Abstract

O câncer de fígado ou carcinoma hepatocelular é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer . quimioterapias convencionais estão limitados pelo desenvolvimento de resistência ao fármaco e vários efeitos colaterais. Devido à sua não-toxicidade e atividade biopharmacological potente, metabólitos derivados de cogumelos têm recebido mais atenção na terapia do cancro. Nossos estudos anteriores demonstraram os efeitos anticancerígenos de complexos de polissacarídeo-proteína derivadas do

Pleurotus

cogumelos. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo molecular subjacente da atividade anticancerígena de um extrato de água quente contendo um complexo polissacarídeo-proteína isolada a partir

Pleurotus pulmonarius

(PP) em células de câncer de fígado. Nossos resultados indicaram que a exposição de células de câncer de fígado ao PP não só reduziu significativamente o

in vitro

proliferação de células cancerígenas e invasão, mas também reforçada a droga sensibilidade ao fármaco quimioterápico Cisplatina. Tanto a administração oral e injecção intraperitoneal de PP inibiu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos nus BALB /c. PP desencadeou uma supressão acentuada da via de sinalização PI3K /AKT em câncer de fígado células

in vitro

e

in vivo

, e superexpressão da forma constitutivamente activa de AKT, Myr-AKT, revogou esta efeito eo inibiu a proliferação e invasão de PP. Ambos Western blot e ELISA resultados mostraram que as células de cancro do fígado PP-tratados tinham reduzido expressão e secreção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). A adição de VEGF humano recombinante atenuou os efeitos inibitórios da PP na via PI3K /AKT e os fenótipos de cancro. Nossos resultados demonstraram que PP suprimiu a proliferação, invasão e fármaco-resistência das células de câncer de fígado

in vitro

e

in vivo

, mediada pela inibição da PI3K sinalização autócrina induzida por VEGF /AKT via. Este estudo sugere o potencial implicação terapêutica do PP no tratamento de câncer de fígado humano

Citation:. Xu W, Huang JJ-h, Cheung PCK (2012) Extracto de

Pleurotus pulmonarius

Suprime fígado Desenvolvimento e progressão de cancro através da inibição da PI3K Induzida por VEGF /AKT via de sinalização. PLoS ONE 7 (3): e34406. doi: 10.1371 /journal.pone.0034406

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de novembro de 2011; Aceito: 01 de março de 2012; Publicado: 28 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de fígado é o quinto câncer mais prevalente eo terceira principal causa de todas as mortes relacionadas com o cancro no mundo [1] – [3]. Infelizmente, a taxa de resposta global de cancro do fígado para o tratamento não é satisfatória, principalmente devido à tarde diagnóstico e fraca eficácia de terapias, especialmente a resistência a drogas quimioterapêuticas e metástase para outros órgãos [4]. As alternâncias de múltiplas vias de sinalização celular foram frequentemente observada em uma ampla variedade de cânceres humanos, incluindo câncer de fígado, em que a cascata de sinalização PTEN /PI3K /AKT foi avaliado a desempenhar um papel crucial na regulação dos comportamentos malignas incluindo a proliferação, sobrevivência e invasão [5], [6]. evidências emergentes demonstraram que via PI3K /AKT pode ser regulada de forma autócrina por vários factores de crescimento, tais como o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [7], [8].

fitoquímicos naturais e metabolitos das plantas estão recebendo cada vez mais atenção por seus efeitos farmacológicos no tratamento e prevenção de câncer por causa de sua baixa toxicidade e atividade biológica em potencial [9]. Ambos

in vitro

e

in vivo

estudos têm demonstrado que estes produtos naturais bioativos podem inibir a iniciação, promoção e progressão da carcinogênese, interferindo as vias de sinalização em células cancerosas humanas e seu consumo tem -se uma estratégia quimiopreventivo e quimioterápico promissora contra o câncer [10], [11]. Entre eles, os cogumelos comestíveis são conhecidas por serem uma fonte rica de agentes anticancerígenos, com os seus complexos de polissacarídeos e de polissacárido-proteína, sendo as mais eficazes [12], [13]. Numerosos relatos demonstraram a

in vitro

e

in vivo

atividades anticancerígenas de polissacarídeos isolados de cogumelos comestíveis, como

Lentinula edodes

,

Agaricus blazei Comprar e

Phellinus linteus

contra células cancerosas humanas diferentes [14] – [18]. Um estudo recente demonstrou que o extrato bruto de polissacarídeo de

Phellinus linteus

inibiu a fosforilação de AKT em células de câncer de mama [19]. extrato bruto dos polissacarídeos presentes no

Ganoderma lucidum

foi encontrado para ter efeitos anti-metastáticos através da modulação da via PI3K /AKT [20].

Recentemente, há muitos

in vitro

estudos demonstrando que o antioxidante e efeito anti-proliferativo de extractos em bruto de polissacáridos e complexos de polissacarídeo-proteína de o

Pleurotus

cogumelo género em células cancerosas humanas diferentes [2] – [25]. A actividade antioxidante de diversos produtos naturais também tem sido sugerida para contribuir para o seu efeito anti-cancro [26] – [28]. Com base no estudo antioxidante da coleção de espécies de cogumelos em nosso laboratório, um complexo ativo polissacarídeo e proteína isolada de cogumelos

Pleurotus pulmonarius

, codificado como PP, foi exibido fora de potencial agente anticancerígeno devido ao seu efeito antioxidante significativo ( dados não publicados) neste estudo. Estes resultados preliminares intrigantes levaram-nos a investigar os mecanismos moleculares subjacentes do efeito anti-cancerígeno pelo qual PP exercida sobre duas células de câncer de fígado humano, Huh7 e Hep3B. Estes resultados demonstraram pela primeira vez que a inibição do VEGF /PI3K /AKT cascata mediada o

in vitro

e

in vivo

efeitos supressores de PP no desenvolvimento e progressão de células cancerígenas do fígado. O quimiossensibilização das células do cancro do fígado no sentido de cisplatina fármaco terapêutico também foi melhorada por tratamento de PP. No presente estudo, o potencial terapêutico do PP no tratamento do carcinoma hepatocelular humano foi implicado.

Resultados

In vitro

efeito anti-proliferativo de PP em câncer de fígado células

Para determinar o efeito inibitório de PP em células de cancro do fígado, que numa primeira fase, o crescimento e viabilidade das linhas celulares de cancro do fígado (quatro Huh7, Hep3B, HepG2 e SMMC-7721) com o tratamento de PP usando MTT ensaio. Os resultados mostraram que a PP exerceu um efeito inibidor significativo sobre Huh7, Hep3B, HepG2 e células SMMC-7721 na forma da dose e dependente do tempo (Fig. 1A). Este achado foi ainda confirmado por ensaio de colónias de formação (Fig. 1B). Citometria de fluxo mostrou que o tratamento de células de cancro do fígado PP causou uma acumulação de células nas fases G2 (um aumento de 12,42 ± 0,25-19,66 ± 1,12 em Huh7 e de 13,30 ± 1,04-20,38 ± 1,11 em Hep3B) (Tabela 1) . Além disso, as células de acordo com o ligeiro aumento da população sub-G1 em células tratadas com PP (Tabela 1), os marcadores de apoptose importantes, caspase3 clivado e clivadas com polimerase de poli (ADP-ribose) (PARP) foram regulados positivamente em PP-tratada , sugerindo que o efeito pró-apoptótica de PP em células de câncer de fígado pode ser mediada por caspase. Western blot indicaram uma redução dose-dependente na expressão de ciclina B1, uma proteína importante ponto de controlo G2, nas duas células de cancro do fígado, sugerindo que a PP-induziu a paragem do ciclo celular de fase G2 pode ser mediada pela expressão regulada por baixo da ciclina B1 (Fig. 1C). Entretanto, para excluir a possibilidade de que o efeito anti-cancro do complexo polissacárido-proteína isolada a partir de

Pleurotus pulmonarius Quais são não-específica, complexo polissacárido-proteína isolada a partir de outro Pleurotus

cogumelo, Pleurotus tubérculo-regium

(PTR) foi aplicado como controle, sugerindo, assim, o efeito específico do PP (Fig. S1).

a. ensaio de MTT foi tomado para avaliar a célula do cancro do fígado (Huh7, Hep3B, HepG2 e SMMC-7721) a viabilidade após o tratamento com diferentes concentrações de PP (0, 25, 50, 100, 200 ou 400 ug /ml, respectivamente) até 96 hr. Os dados são médias (barras, SD) de três experiências independentes. B. O ensaio de colónias de formação demonstrou uma diminuição dependente da dose na proliferação das células do cancro do fígado (Huh7, Hep3B, HepG2 e SMMC-7721) quando a exposição ao PP. C. de Western blot foi realizado e foi observada uma redução dose-dependente da expressão da ciclina B1. Actina foi envolvido como um controlo de carga.

Por outro lado, o PP foi examinado para efeitos citotóxicos contra normais WRL-68 das células do fígado, utilizando ensaios de MTT e formação de colónias. Os resultados demonstraram que a célula hepática normal WRL-68 são mais resistentes a PP do que as células de cancro do fígado, sugerindo que a citotoxicidade selectiva de PP para células cancerosas e o seu potencial para ser desenvolvidos como agentes anti-cancro (Fig. S2). Para investigar mais a implicação potencial do PP no tratamento de cancros humanos, estendemos nossos estudos em outros tipos de câncer. Os resultados indicam uma taxa de proliferação reduzida significativamente de uma maneira dependente da dose, após tratamento PP em linhas celulares de cancro humano da mama (T47D), do pulmão (A549), estômago (AGS), e da próstata (DU145) (Fig. S3).

Efeito do PP na inibição da expressão de VEGF e inactivação da via PI3K /Akt

Western blot mostrou que o tratamento de PP reduzida nomeadamente expressão de proteínas de fosfo-AKT (p-AKT), a activada forma de AKT, e os seus alvos a jusante incluindo fosfo-GSK3β (p-GSK3β), Survivina, a Bcl-xL de uma maneira dose-dependente, mas não a da Bax e nível total de AKT e GSK3β em ambas as células de cancro do fígado (Fig. 2A). Além disso, as células de acordo com o ligeiro aumento da população sub-G1 em células tratadas com PP (Tabela 1), os marcadores de apoptose importantes, caspase3 clivado e clivadas com polimerase de poli (ADP-ribose) (PARP) foram regulados positivamente em PP-tratada , sugerindo que o efeito pró-apoptótica de PP em células de câncer de fígado pode ser caspase mediada. Enquanto isso, N-caderina e vimentina, que podem ser responsáveis ​​pela inversão da transição epitelial-mesenquimal (EMT), foram regulados negativamente em células tratadas com PP (Fig. 2a). Em contraste, o nível de fosfo-ERK (p-ERK), uma outra via de sinalização importante envolvido na regulação das células do cancro, a expressão não foi substancialmente alterada quando do tratamento de PP, sugerindo a especificidade na regulação da via PI3K /Akt por PP (Fig. 2A ). células Huh7 transfectadas transientemente com o plasmídeo de AKT-consistentemente revelou um efeito inibidor revogada quando a exposição a PP, tal como indicado por ensaio de MTT (Fig. 2B) e análise de mancha de Western (Fig. 2C). Esses achados ainda confirmou que PI3K /AKT via de sinalização pode contribuir para os efeitos anticancerígenos de PP em células de câncer de fígado.

A. células Huh7 e Hep3B foram tratadas com diferentes concentrações de PP (0, 50 ou 100 ug /ml) e a lise das células colhidas a 48 horas para análise de Western blot. tratamento PP exerceram uma redução significativa nos níveis de expressão de p-AKT e seus alvos a jusante, incluindo p-GSK-3β, Bcl-xL, e survivina. No entanto, o PP não afetou as expressões de p-ERK e PTEN mas a expressão de VEGF foi reduzida nas células tratadas com PP. As experiências foram repetidas 3 vezes. B. células Huh7 foram transfectadas com o vector de AKT-sobre-expressam ou o controlo do vector, em seguida, tratada com PP (50 ug /ml) e a viabilidade celular medida por MTT de 72 h. Os resultados mostraram um efeito inibitório revogada em células transfectadas por AKT, quando comparado com o controlo. Os dados são apresentados como percentagem de células não tratadas como controlo que foi estabelecido a 100%. Os dados são médias ± DP de três experiências independentes. C. células Huh7 foram transfectadas com vector de sobre-expressam AKT ou o vector de controlo e, em seguida, tratada com PP. O lisado celular foi colhida e aplicada a Western blot. diferenças significativas entre as células PP-tratados e não tratados foram analisados ​​estatisticamente pelo ANOVA (teste de comparação múltipla de Tukey; *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001).

Efeito do PP na inibição da secreção de VEGF e inactivação da via PI3K /Akt

é interessante verificar que a PP reduziu a expressão do VEGF, que é um importante factor de crescimento envolvido em proliferação e invasão de cancro humano [29]. Tem sido bem documentado que a via PI3K /AKT é activada em resposta a vários factores de crescimento [30]. Dado que os nossos resultados de Western blot mostraram redução da expressão de proteínas de p-AKT e VEGF, mas não fosfatase e tensina homólogo (PTEN), uma proteína a montante do AKT (Fig. 2A), é muito provável que a PP regula a via PI3K /AKT através de um VEGF mediada forma autócrina. Curiosamente, os dados de ELISA demonstraram uma supressão da secreção de VEGF de um modo dependente da dose, após tratamento PP em células Huh7 e Hep3B (Fig. 3A). Mais importante ainda, a adição de VEGF humano recombinante (rhVEGF) a 0,6 ng /ml, a concentração reduzida de PP em relação ao grupo não tratado no ponto de tempo de 72 horas, atenuou o efeito inibitório de PP sobre a proliferação celular (Fig. 3B) e PI3K /AKT via de sinal (Fig. 3C). Estes dados sugerem que a inactivação da via PI3K /Akt por PP podem ser mediados pela inibição do VEGF de um modo autócrino.

. Efeitos do PP sobre a secreção de VEGF em células Huh7 e Hep3B. Depois as células foram tratadas pelo PP com várias concentrações de (0, 50 ou 100 ug /ml) durante 48 horas, o meio condicionado foram colhidos e nível de VEGF no meio condicionado foi determinada por um kit de ELISA de VEGF humano. O resultado demonstrou uma supressão da secreção de VEGF de um modo dependente da dose, após tratamento PP. B. Ensaio de MTT foi realizado para avaliar a proliferação quando a exposição para a PP A (50 ug /ml) na presença ou ausência de rhVEGF (0,6 ng /ml) durante 72 h em células Huh7. C. células Huh7 foram tratados com PP (50 ug /ml) sozinha ou a combinação com rhVEGF (0,6 ng /ml), e o lisado celular foi colhida e aplicada a Western blot. Os dados são expressos como média ± DP. diferenças significativas entre as células PP-tratados e não tratados foram analisados ​​estatisticamente pelo ANOVA (teste de comparação múltipla de Tukey; *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001).

Efeito do PP sobre o reforço da quimio-sensibilidade das células de câncer de fígado à cisplatina

Um grande corpo de evidências indicou que via PI3K /AKT contribui de forma crítica à resistência aos medicamentos em câncer humano [31] e inativação de PI3K /AKT pelo PP pode levar a alternância de sensibilidade às drogas em células de câncer de fígado. A partir do ensaio de formação de colónia, cisplatina (DDP) a 5 ^ M ou 10 uM diminuiu apenas ligeiramente a viabilidade das células, ao passo que um efeito sinérgico significativo na formação de colónias em células Huh7 e Hep3B foi observada quando DDP foi combinada com uma baixa concentração de PP (25 ug /ml) (Fig. 4A), sugerindo que a PP pode ser um sensibilizador para a droga quimioterapêutica. Transfecção de plasmídeo AKT (Fig. 4B) e adição de rhVEGF (0,6 ng /ml) (Fig. 4C) resultou numa sensibilização revogada, apoiando ainda mais o papel vital da via AKT e VEGF desempenhado na regulação das células de câncer de fígado pelo PP .

A. Huh7 e células Hep3B foram tratados com DDP (até 10 uM), PP (25 ug /ml), ou a combinação e, em seguida, ensaio de formação de colónia realizada. B. células Huh7 foram transfectadas com o vector de AKT-sobre-expressam ou o controlo do vector, em seguida, tratado com dose baixa de PP (25 ug /ml), DPP (5 uM), ou a combinação durante 72 horas e a viabilidade celular medida por teste MTT . C. Ensaio de MTT foi realizado para avaliar a proliferação quando a exposição a dose baixa de PP (25 ug /ml), DDP (5 ^ M) sozinho ou a combinação, na ausência ou na presença de rhVEGF durante 72 h em células Huh7. A adição de rhVEGF (0,6 ng /ml) levou a uma sensibilização revogada. Os dados são apresentados como percentagem de controlos não tratados que foram fixadas em 100%, sendo a média ± DP de pelo menos três experiências independentes. diferenças significativas entre as células PP-tratados e não tratados foram analisados ​​estatisticamente pelo ANOVA (teste de comparação múltipla de Tukey; *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001).

PP diminui o potencial invasivo de células de câncer de fígado

Usando ensaio de invasão de câmara, verificou-se que PP na dose baixa (50 mg /ml), que não teve efeitos significativos sobre celular proliferação em 24 pontos do tempo HR diminuiu marcadamente a capacidade de invasão de células Huh7 e Hep3B (Fig. 5A). Curiosamente, o efeito inibitório de PP na invasão de Huh7 foi atenuada por sobre-expressão de AKT constitutivamente activado (Fig. 5B) e adição de rhVEGF (Fig. 5C), o que demonstra ainda mais o envolvimento de VEGF /PI3K /cascata de AKT na regulação da células de câncer de fígado por PP. Além disso, dose-dependente da redução dos níveis de N-caderina e vimentina de expressão, os fabricantes importantes para a migração celular e invasão, foi observado na análise de Western blot mostrado na Fig. 2A, apoiando o efeito inibitório observado de PP sobre a capacidade de invasão das células de câncer de fígado.

A. ensaio de câmara de Boyden foi usada para determinar a capacidade de invasão de células Huh7 e Hep3B após tratamento com o controlo ou PP (50 ug /ml) durante 24 h PP. PP suprimiu significativamente a invasão de células do cancro do fígado. Painel direito mostrou a quantificação por submersão das câmaras em SDS a 1% e medindo a absorvância da solução a 570 nm. A média de ensaios em triplicado para cada condição experimental foi calculada e os valores normalizados para as células não tratadas. células B. A Huh7 transfectadas com vector de AKT-sobre-expressam, ou o vector de controlo foram tratados com PP, e a capacidade de invasão de células foi testada. O painel direito mostra a quantificação. C. células Huh7 foram tratados com PP na ausência ou na presença de 0,6 ng /ml rhVEGF, e o potencial invasivo determinada. O painel direito mostra a quantificação. Os dados são expressos como média ± DP. diferenças significativas entre as células PP-tratados e não tratados foram analisados ​​estatisticamente pelo ANOVA (teste de comparação múltipla de Tukey; *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001).

PP suprime significativamente o crescimento de xenoenxerto de cancro de fígado humano em ratinhos nus

Diante do exposto

in vitro

resultados que mostram que PP reduziu a proliferação de células de câncer de fígado, ele será ser crucial para avaliar se PP poderia inibir tumorigenicidade de células de câncer de fígado

in vivo

. Em primeiro lugar, os ratinhos nus com xenoenxerto de tumor s.c. estabelecidos a partir de células Huh7 foi utilizado e tratado com a administração oral ou intraperitoneal (i.p.) de PP. Tanto a injecção de alimentação e IP oral de PP significativamente (p 0,001) reduziu o crescimento do tumor (Fig. 6A), embora o efeito por administração oral (razão de inibição ~82%) era menos pronunciada em comparação com injecção ip (razão de inibição -99% ).

A. As curvas de crescimento e fotografias representativas de ratinhos nus tratados com i.p. (painel da esquerda) ou administração oral (painel da direita) de PP com o controlo de veículo (água). Ponto representa o tamanho médio do tumor com a equação V = (comprimento x largura

2) /2. B. Os tumores colhidos a partir tratado com água ou PP-ratinhos tratados foram fixados, embebidos, seccionado, e aplicado para Ki-67 coloração imuno-histoquímica e quantificação. O número de núcleos corados positivamente em um mínimo de seis campos seleccionados aleatoriamente a partir de secções de tumor representativas dividido pelo número total de células é apresentada no painel direito. C. Os tecidos tumorais foram colhidas por western blot. Os dados são expressos como média ± DP. diferenças significativas entre as células PP-tratados e não tratados foram analisados ​​estatisticamente pelo ANOVA (teste de comparação múltipla de Tukey; *,

P Art 0,01; **,

P Art 0,001).

xenograftes tumorais recolhidas a partir dos quatro grupos de ratos foram submetidos a imuno-histoquímica e análise de western blot. Uma percentagem significativamente inferior de células-Ki-67 positivos encontrados no grupo tratado com PP em comparação com o grupo de controlo (Fig. 6B) sugeriu que o efeito inibitório de PP pode ser devido à diminuição da proliferação celular. A alternância de expressão de proteínas nos animais de xenoenxertos tratados com PP, incluindo uma expressão regulada para baixo de p-AKT, P-GSK3β, Bcl-xL, e uma expressão sobre-regulada de caspase-3 clivada nestas

in vivo

experiências (Fig. 6C) foram consistentes com os

in vitro

estudos (Fig. 2A).

Além disso, sem efeitos colaterais óbvios ou mudanças foram observadas através da comparação das características histológicas de órgãos internos incluindo o fígado, pulmão e rim (Fig. 7A) e o peso corporal dos animais (Fig. 7B) nos grupos de tratamento e de controlo, sugerindo que a segurança e implicações clínicas de PP como um agente anticanceroso.

A. Hematoxilina e eosina (H E) de coloração do pulmão, do fígado, do rim, dos quatro grupos de ratinhos indicadas. peso B. corporal (grama) dos camundongos tratados com PP e controle.

Discussão

Neste estudo demonstramos que PP, um extrato de água quente contendo um complexo polissacarídeo-proteína isolado do

Pleurotus pulmonarius

inibiu o desenvolvimento e progressão de células de câncer de fígado

in vitro

e

in vivo

. Tais efeitos anti-cancerígenos são, através da inibição da regulação autocrina mediada por VEGF da via PI3K /AKT. A importância destes achados é discutida abaixo.

Em primeiro lugar, nós demonstramos que o tratamento de PP reduziu tumorigenicidade de células de câncer de fígado no modelo de ratinho nu xenoenxerto sem qualquer efeito colateral óbvio. Apesar do avanço em quimioterapêuticos nos últimos anos, a quimioterapia continua a ser associado a efeitos secundários graves, tais como nefrotoxicidade, náusea, perda de cabelo, irritação da pele, a anemia, a infertilidade [32], [33]. Portanto, que ocorrem naturalmente compostos anticancerígenos presentes na dieta humana têm importante implicação da quimioterapia e quimioprevenção, especialmente para aqueles com baixa toxicidade e alta potência, como resveratrol [34] e os polifenóis do chá [35]. Mais interessante, o

Pleurotus pulmonarius

extractos corpo de fruto foram relatados para atrasar a progressão do carcinoma hepatocelular induzida quimicamente em ratinhos CBA [36]. Neste estudo, verificou-se que tanto a injecção i.p. e administração oral de PP notavelmente inibiu o crescimento do tumor. A inibição do tumor comparativamente menos pronunciado observado na administração oral de PP pode ser devido às limitações farmacocinéticos e degradação intestinal dos compostos [37]. Não houve diferenças significativas foram encontradas comparando a histologia do pulmão, do fígado, do rim e do peso corporal nos ratos tratados com PP e de controlo, sugerindo que não houve qualquer efeito observável sobre a saúde adversos ratinhos tratados com PP. Os notáveis ​​efeitos anticancerígenos e baixa toxicidade para animais dar suporte para a viabilidade de PP para o tratamento de câncer de fígado humano.

Em segundo lugar, os presentes resultados indicaram que PP inibiram a taxa de proliferação de células de câncer de fígado, e este efeito pode ser através da paragem do ciclo celular G2. Curiosamente, para além da fase G2, foram observadas acumulações simultâneas em fase S, os mecanismos moleculares possíveis garante mais investigação. Além disso, os nossos dados mostraram que a PP aumentou significativamente a sensibilidade ao fármaco das células de cancro do fígado a cisplatina (Fig. 4). Apesar do recente avanço no desenvolvimento de quimioterapias nas últimas décadas, a maioria dos pacientes, eventualmente, em recidiva após o tratamento, o que implica que os tumores de mecanismos de resistência a medicamentos, que crucialmente contribuiu para a elevada taxa de mortalidade de cancro do fígado [38] adquirida. A fim de superar quimiorresistência, quimiossensibilização que é baseado na combinação de uma outra droga através do controlo de um ou mais mecanismos de resistência tem sido tomado como uma estratégia atraente, especialmente o envolvimento de compostos naturais existentes [39]. Curiosamente, um grande corpo de evidência está a emergir para indicar que várias vias de sinalização estão criticamente envolvidos na mediação da resistência adquirida a drogas quimioterapêuticas em cancro humano, incluindo a via PI3K /AKT, MEK /ERK, JNK e vias de AMPK [40], [41]. A inibição da via PI3K /AKT pela abordagem farmacológica pode levar à restauração da sensibilidade de drogas [42], [43]. A este respeito, a inactivação da via PI3K /Akt por PP (Fig. 2 e 3) sugeriu que a exposição a PP pode aumentar a susceptibilidade de drogas de células de cancro do fígado. Além disso, o facto de que a PP-induzida a sub-regulação de Bcl-xL e Surviven (Fig. 2A), ambas as quais são importantes fabricantes de resistência a múltiplas drogas, mostrou ainda mais o papel de PP promissor como chemosensitizer.

Outro destaque deve ser abordado é que o tratamento PP resultou num invasividade reduzida de células de cancro do fígado (Fig. 5a), o qual foi adicionalmente suportado pelas expressões proteína diminuiu de N-caderina e vimentina em células tratadas com PP (Fig. 2A ). Tinha sido relatado que N-caderina é crucial para a interacção tumor-vasos, extravasamento e disseminação metastática [44], [45] e vimentina é amplamente usado como um marcador de contabilidade para o epitelial para mesenquimal (EMT) [46], [ ,,,0],47]. EMT é um programa de trans-diferenciação necessária para a morfogénese do tecido durante o desenvolvimento embrionário. No entanto, isso pode causar adversamente fibrose de órgão e promover a progressão do carcinoma através de uma variedade de mecanismos, a aquisição de propriedades invasivo e metastático [48] – [50]. A investigação de inibidor EMT abriu novas portas para controlar a metástase, que contribui decisivamente para a elevada taxa de mortalidade de câncer de fígado [51]. Portanto, os presentes achados nos efeitos inibitórios do PP sobre o potencial invasivo de células de câncer de fígado têm implicação clínica no tratamento de câncer de fígado.

Além do estudo funcional, elucidação dos mecanismos é fundamental para a compreensão do PP como potencial agente anti-cancro. Uma vez que a activação constitutiva de PI3K /AKT cascata de sinalização é frequentemente observada em fenótipos de cancro humanas e crucialmente relacionada com a proliferação de células de cancro, a sobrevivência, a invasão e a angiogénese, a inibição da via PI3K /AKT tornou-se uma abordagem atractiva para o tratamento do cancro do fígado [52] , [53]. inibidores de AKT têm sido relatados para suprimir o crescimento do tumor no fígado, sugerindo que o racional para a segmentação da via PI3K /AKT nesta doença. No entanto, o emprego de um inibidor de AKT está associada com efeitos secundários inesperados [54].

Cordyceps militaris

, um cogumelo medicinal, foi relatado para induzir a paragem do ciclo celular e apoptose através de inativação de PI3K /AKT no cancro da mama [55]. Além disso, a administração oral de uma fracção polifenólica de chá verde isolado inibe significativamente o desenvolvimento do cancro da próstata e metástases através de via PI3K /AKT no adenocarcinoma transgénico de modelo de rato [56]. Curiosamente, o nosso resultado mostrou que a PP-regulada a expressão de p-AKT, a forma activa de PI3K /AKT, de uma forma dependente da dose, de acordo com o resultado do estudo funcional. Além disso, os resultados de experiências em paralelo por transfecção do plasmídeo AKT consistentemente ilustrado um efeito inibidor revogada de PP, confirmando ainda mais o envolvimento da via PI3K /Akt cascata (Fig. 2B e 2C) .A sinalização desregulação da via PI3K /AKT contribuiu significativamente para o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular [57]. abordagens personalizadas baseadas em um refinamento da classificação molecular de HCC, foram tomadas como estratégias potenciais para o tratamento clínico de HCC [58]. Enquanto isso, a identificação de reagentes que interfiram com as vias de sinalização que contribuem para o HCC pode levar ao desenvolvimento de terapias personalizadas para os doentes, e assim maximizar a eficácia e custo benefício [59]. Este estudo fornece uma nova opção terapêutica potencial para os pacientes apresentaram ativação PI3K /AKT constitutiva. Por outro lado, embora nenhum alternâncias óbvias foram observadas na via ERK quando a exposição a PP, o efeito de PP em outras vias de sinalização garante mais investigação.

Curiosamente, verificou-se que o VEGF foi regulada para baixo em ambos a expressão da proteína e níveis de secreção após tratamento PP. Além disso, a estimulação das células com rhVEGF no meio de cultura atenuado o efeito inibitório de PP em Akt e fenótipos de cancro (Fig. 3). Carcinogénese é um processo multi-passo mediado por vários factores de crescimento incluindo o factor de crescimento placentário (PIGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [60]. No microambiente tumoral, os vários factores de crescimento controlar não só as células cancerosas, mas também a do estroma de forma autócrina e parácrina [61], [62]. O VEGF é um dos factores responsáveis ​​principais para a angiogénese que controla a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura existente, e desempenha um papel essencial no crescimento do tumor, invasão e metástase [63], [64]. Há estudos demonstraram que o extrato de

Phellinus linteus

poderia suprimir significativamente a angiogénese através da regulação negativa da secreção de VEGF, visando AKT no cancro da mama ou através de Wnt via de sinalização /β-catenina no câncer de cólon [65], [ ,,,0],66]. Acredita-se que a terapia anti-angiogénica baseada na inibição do receptor /VEGF VEGF a ser poderosa estratégia clínica no tratamento de cancro, especialmente para cancro do fígado, que é um tumor altamente vascular [67], [68] .A efeito inibidor de VEGF em PP sugere que as actividades anti-angiogénicas de PP e a sua implicação potencial em terapia anti-angiogénica. Neste estudo, as novas descobertas relacionadas com a inibição do VEGF /PI3K /AKT cascata em células de câncer de fígado por tratamento PP fornecer insights sobre os mecanismos moleculares para apoiar a sua aplicação clínica potencial.

Em conclusão, PP, um

Pleurotus

complexo polissacarídeo-proteína cogumelo, tem tanto

in vitro

e

in vivo

atividades anticancerígenas contra células de câncer de fígado, através da inibição da regulação autócrina mediada por VEGF secretora de PI3K /sinalização AKT. Outros estudos sobre o efeito anticancerígeno do

Pleurotus

complexo polissacarídeo-proteína cogumelo em cancros-tronco de câncer de fígado serão realizadas para avaliar a sua potencial aplicação no tratamento e prevenção do câncer.

Materiais e Métodos

Preparação e caracterização de cogumelos água quente extrato

cogumelo comestível (

Pleurotus pulmonarius

) foi comprado do supermercado local e as espécies foi positivamente identificados com base na sua morfologia. pó seco foi preparado a partir de moagem dos corpos de frutificação cogumelo seca por congelação em partículas de tamanho inferior a 0,5 mm e, em seguida, submetido a uma extracção com água quente a 95-100 ° C durante 3 h com uma razão de amostra-para-solvente de 01:25 ( w /v). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.