Abstract

CPV1 Induzido por HPV (também chamado COPV) é um vírus do papiloma responsável por papilomatose oral em cães jovens. O envolvimento deste tipo viral na oncogênese oral tem sido a hipótese em carcinomas de células escamosas orais (CEC), mas nunca foi investigado em outras lesões orais neoplásicas e hiperplásicas de cães. Objetivo deste estudo foi investigar a presença de CPV1 em diferentes lesões neoplásicas e hiperplásicas a fim de avaliar o seu papel na oncogênese bucal canina; de acordo com os resultados obtidos, um segundo objectivo do estudo foi o de definir se o cão pode ser considerada um modelo animal válido para tumores induzidos por HPV de alto risco orais. Oitenta e oito, embebidos em parafina (FFPE) lesões orais caninos fixados em formol, incluindo 78 tumores orais (papilomas, CCEs, melanomas, ameloblastomas, adenocarcinomas via oral) e 10 lesões hiperplásicas (hiperplasia gengival) foram investigados com imuno-histoquímica para a presença do vírus do papiloma L1 proteína e com o real-Time PCR para DNA CPV1. RT-PCR para o RNA foi realizada em amostras seleccionadas. Todos os papilomas virais testadas foram positivas para imuno-histoquímica e PCR em tempo real. Em 3/33 (10%) CCEs, o DNA viral foi demonstrada, mas não ARN viral pode ser encontrado. Não foi observada positividade tanto com imuno-histoquímica e PCR em tempo real nas outras lesões hiperplásicas e neoplásicas da cavidade oral de cães. Mesmo que o achado de DNA CPV1 em alguns CCEs em face de uma imuno-histoquímica negativa poderia apoiar a hipótese de uma infecção abortiva no desenvolvimento destas lesões, a ausência de RNA viral aponta que CPV1 mais provável representa um espectador inocente em SCC oncogênese. O estudo demonstra uma forte associação entre CPV1 e papilomas virais orais Considerando que a contribuição viral para a patogênese de outras lesões orais parece improvável. Além disso, ele sugere que um modelo canino de infecção CPV1 para oncogênese induzida pelo HPV pode ser impróprio

Citation:. Porcellato I, Brachelente C, Guelfi G, Reginato A, Sforna M, Bongiovanni L, et al. (2014) de um estudo retrospectivo sobre Canine Papilomavírus 1 (CPV1) na oncogênese Oral revela os cães não são um modelo animal adequado para Alto Risco de Câncer Oral Induzido por HPV. PLoS ONE 9 (11): e112833. doi: 10.1371 /journal.pone.0112833

editor: Xuefeng Liu, da Universidade de Georgetown, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de junho de 2014; Aceito: 16 de outubro de 2014; Publicação: 17 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Porcellato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

os papilomavírus (PVs) são um grupo de vírus pertencentes ao

Papillomaviridae

família que são específicos espécies altamente que pode afetar mamíferos, aves e répteis [1] . VP tem uma circular genoma de cadeia dupla de ADN de aproximadamente 8 kb em tamanho que tipicamente contém oito ORF (Open Reading Frames), codificação precoce (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) e tardia (L1 e L2) proteínas virais [ ,,,0],2], [3]. E1 é uma helicase de ADN essencial para a replicação e a amplificação do epissoma virai no núcleo das células infectadas [4]. proteínas E2 participar na iniciação da replicação do DNA viral, mas são fundamentais na regulação da transcrição e particionamento de genoma viral bem como [5]. E6 e E7 são oncoproteínas responsável por processos de proliferação e transformação celular, com E7 a ser reconhecido como um dos deregulator ciclo celular mais eficiente [6]. E4, E5 juntos com, está envolvido na regulação da amplificação do genoma virai e representa o transcrito mais abundante nas lesões produtivas [7], [8]. proteínas tardias (L1, L2) codificam para as proteínas estruturais da cápside virai, que são fundamentais para a conclusão do ciclo de vida PV [8]. (HPV) Os papilomavírus humanos são classificados em tipos cutânea e das mucosas com base no seu tropismo para a pele ou mucosa epitélios, respectivamente, e pode persistir assintomática ou causar doenças hiperproliferativas ou neoplasias benignas [2], [9]. Mucosa HPVs podem ser subclassificados em tipos de alto risco e de baixo risco em relação à sua associação com o desenvolvimento de câncer [10]. Esta classificação foi inicialmente baseado apenas em dados epidemiológicos e confirmado mais tarde com evidências adicionais de ensaios in vitro [11]. Mais do que 170 tipos de HPV foram identificados até agora, ao passo que na medicina canina são conhecidos apenas 14 tipos de CPVs (Canino Os papilomavírus) neste momento [12], [13]. O papel de CPVs na patogénese do cancro não está claramente elucidados e nenhum dos tipos virais canino tem sido associado a uma entidade particular o cancro. Pelo contrário, na medicina humana, o papel oncogénico dos tipos de HPV de alto risco, tais como HPV 16 e HPV 18 é bem conhecido e são consideradas contribuir para mais de 70% dos cancros cervicais [14]. Mais recentemente, a infecção pelo HPV também tem sido associado com câncer de cabeça e pescoço, em particular com carcinoma de células escamosas da orofaringe [15], [16]. Em cães, o primeiro tipo PV documentado é o agente etiológico da papilomatose oral, canino, originalmente chamado COPV (Canine Oral Papillomavirus) e recentemente re-nomeado CPV1 [2], [17]. O ADN do vírus é 8607 pares de bases de comprimento e, portanto, é a maior PV sequenciado [18]. Apesar de o arranjo de CPV1 genoma é semelhante à dos outros de PVS, que carece da região E5 e caracteriza-se por um longo segunda região de não codificação [19]. papilomatose oral, canina causada por CPV1 é mais frequente em cães de aproximadamente um ano de idade e normalmente provoca verrugas exofíticas couve-flor; na ocasião, tumores também podem ser franjas ou nodular. As lesões são normalmente localizada na mucosa oral, lábios e junções mucocutâneas, mas não se restringem a estes locais [17]. Eles são geralmente submetidos a regressão espontânea que está associada a uma infiltração predominante de células CD4 + e CD8 + [20]. Embora CPV1 geralmente está relacionada a papilomas benignos e espontaneamente regredindo, este tipo viral tem sido ocasionalmente relatada em lesões não-regressão, particularmente em carcinomas de células escamosas orais e periorais [21], [22]. Nos últimos anos, a presença de DNA do HPV tem sido amplamente investigados e demonstrada em tumores orais diferentes, tais como carcinoma de células escamosas [23], ameloblastoma [24], carcinoma da glândula salivar [25], [26], bem como nas melanoma cutâneo [27] e outros tumores [28], [29], [30]. O objectivo deste estudo foi investigar tumores orais canino diferentes e lesões hiperplásicas para a presença de ADN e ARN CPV1 assim como a localização antigénio viral em lesões. Avaliar a prevalência viral em eventos neoplásicas orais em cães pode fornecer informações importantes sobre o papel potencial deste tipo viral específica na oncogênese bucal canina e sobre a utilidade do modelo canino para oncogênese induzida por HPV oral em seres humanos. Esta investigação foi realizada em tumores de origem epitelial, tais como carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas ameloblastoma e orais. Um grupo de melanomas, que são os cancros orais mais comuns e invasivos em cães, também foi considerada neste estudo. Além disso, uma vez que é geralmente aceite que VP depender de diferenciação epitelial para a conclusão do seu ciclo de vida [8], este estudo incluiu também um grupo de lesões hiperplásicas gengivais. histologia de rotina, imunohistoquímica e PCR em tempo real foram utilizados neste estudo. O nosso estudo incidiu sobre o papel da CPV1 na oncogênese oral, através da análise imuno-histoquímica e molecular retrospectiva de uma ampla gama de lesões orais neoplásicas e não-neoplásicas.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Este estudo retrospectivo foi realizado em FFPE amostras enviadas previamente aos nossos Departamentos de diagnóstico histopatológico e, portanto, não era necessário a aprovação do comitê de ética.

a selecção de amostras e histopatologia

Vinte e dois papilomas (Ps), 33 carcinomas de células escamosas (CEC), 11 melanomas (MS), 10 ameloblastomas (AMS), 2 adenocarcinomas orais (ACS) e 10 casos de hipertrofia gengival /hiperplasia (GH), coletados de 2005 e 2012, foram selecionados a partir dos arquivos do Departamento de Medicina Veterinária (Universidade de Perugia, Itália) e da Faculdade de Medicina Veterinária (Universidade de Teramo, Itália). O diagnóstico foi revisto por 2 patologistas em lâminas de hematoxilina-eosina. Papilomas foram posteriormente classificados em papilomas virais (VPS) e papilomas (SPs). VP foram diagnosticados com base na presença de características típicas histológicos indicativos de efeitos citopáticos virais, como a proliferação epitelial, coilocitose, hipergranulose, hiperqueratose e a presença de corpos de inclusão.

Imunohistoquímica

As secções de 2 mm foram cortadas a partir das amostras 88 fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) e montadas em lâminas positivas carregada. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando um anticorpo policlonal de coelho contra altamente conservada proteína do capsídeo L1 de BPV1 (1:200 diluição; Anti-Bovine Papillomavirus /BPV1, BO580 DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), conforme relatado em outros estudos [31]. Resumidamente, secções de tecido FFPE foram desparafinados, re-hidratados e lavados em água destilada. Nenhuma recuperação de antigénio foi realizado. A peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 durante 8 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas em TBS e incubadas com o anticorpo primário durante 1 hora numa câmara humidif içada à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado secundário universal, seguido por incubação sequencial com estreptavidina marcada com peroxidase (LSAB + /System-HRP, Dako, Glostrup, Dinamarca). Três-amino-nove-etilcarbazole foi usado como cromogénio (AEC + Substrato cromogénio-pronto-a-usar, Dako, Glostrup, Dinamarca) e hematoxilina de Carazzi como contrastante. Lamelas foram montadas com meio de montagem aquoso. Os controlos negativos foram tratadas da mesma maneira, omitindo-se o anticorpo primário e incubar as secções de tecido com TBS. Os controlos positivos foram obtidos a partir de papilomas bovina

iniciadores Design by

As sondas foram concebidos na sequência relatada de CPV1. [GenBank: L22695.1], em particular, quatro ORF alvo: E4, E7, L1 e L2. Entre os produtos virais precoces, o E4 foi selecionado como um gene alvo por causa da sua elevada expressão (tão alta como 30% do teor de proteína total, em alguns verrugas produtivas) em lesões produtivas e E7, devido à sua função oncogénica reconhecido [6], [7 ]. L1 e L2, as proteínas tardias, foram incluídos devido ao seu papel crucial na conclusão do ciclo viral PV [8]. Para a detecção de cada gene viral, para a frente e os iniciadores e sondas foram concebidos reversa (Tabela 1). As sondas para E4, E7 e L1 foram também adequado para a detecção de RNA viral. Os iniciadores desenhados foram verificados por análise de explosão NCBI e análise de alinhamento ClustalW para assegurar a especificidade.

ácido nucleico extracção

extracção de ADN e de ARN foi realizada a partir de 5 uM secções de parafina com um comercial kit de acordo com as instruções do fabricante (Assistente de ADN genómico kit de purificação, Promega, Milão, Itália e kit de isolamento RECOVERALL total de ácido nucleico, Ambion, Austin, Texas). O ADN total e ARN foram quantificados com um fluorómetro (Qubit 2,0, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) usando um kit comercial de alta sensibilidade (Qubit dsDNA SH ou ARN HS Assay Kit, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) de acordo com as instruções do fabricante.

Transcrição reversa

Cerca de 20 ng de ARN total foram reversamente transcritos em 20 uL de ADNc iSCRIPT (BioRad, Hercules, CA), utilizando hexâmeros aleatórios de acordo com as sugestões do fabricante. Nenhum-RT controles foram incluídos para verificar se há contaminação do DNA genômico.

DNA e cDNA Real-Time PCR

De acordo com as sugestões do fabricante, 4 ul de DNA (30-50 ng) ou 4 ul de cDNA (1-10 ng) foram amplificadas utilizando 12,5 mL de Hot-salvamento real-Time Master mix (Diatheva, Fano, Itália), 0,125 mL de Hot-salvamento DNA polimerase (Diatheva Fano, Itália), 5 pmol de sonda , 10 pmol de iniciadores (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), e DNAse /RNase água a 25 mL. Todas as reacções de PCR foram realizadas num Bio-Rad iCycler PCR em tempo real com uma incubação inicial a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos a 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min, durante o qual os dados de fluorescência foram coletados. Cada amostra foi corrida em triplicado e os resultados foram ponderados. A TC foi calculado automaticamente por cada curva. fidelidade amplificação da amostra foi verificada por electroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados por PCR Purification Kit QIAquick (Qiagen, Valência, CA). Os 18S foi usado como controle endógeno para normalizar variações da amostra na quantidade de ARN a partir de amostras como descrito anteriormente [32]. Para cada execução PCR, há controles de modelo e controles Nort foram incluídas a fim de verificar a ausência de contaminação gDNA.

Resultados

Histologia e imunohistoquímica

Com o exame histológico de rotina secções coradas, papilomas foram classificados em VPs (15/22) e SPs (7/22) avaliar a presença de traços característicos citopáticos de infecção PV (corpos de proliferação epidérmica, coilocitose, hipergranulose, hiperqueratose e inclusão) (Figura 1). Um caso com hipergranulose suave e hiperqueratose focal foi difíceis de classificar devido à falta de corpos de inclusão e de coilócitos. No entanto, após cortes seriados, coilócitos ocasionais foram observados e o caso foi classificado como um VP. características histológicas de SPs e VPs são apresentados na Tabela S1. imunocoloração intranuclear positivo confirmado todas as VPs previamente diagnosticados em cortes corados por HE (Figura 2). As células positivas foram localizadas principalmente na epiderme interdigitantes e frequentemente em áreas onde o epitélio foi caracterizado por hipergranulose grave. Apenas num caso, a imunomarcação foi predominantemente observada em células superficiais descamativas. Todos os outros tumores e lesões hiperplásicas foram negativos para a imunocoloração PV. No entanto, uma coloração citoplasmática finamente granular foi detectada em cinco casos de CCEs

H . E; 40x

AEC e hematoxilina de Carazzi.; 40x.

amplificação Real-Time PCR de DNA e RNA

rendimento de extração de DNA variou de 50 a 90 ng /mL e concentração de RNA foi de cerca de 20 ng /mL. Confirmando os resultados de imuno-histoquímica, Real-Time PCR detectou DNA viral em todas as 15 VPs. VP foram positivos para todas as quatro sondas, especificamente concebidos para a detecção de CPV1. Três CCEs de 33 resultados positivos para a presença de ADN CPV1 com todas as quatro sondas testadas. Sem sobreposição com os cinco CCEs com imunocoloração finamente citoplasmática foi evidenciado. A sequenciação de amplicões todos demonstraram uma identidade completa (100%) com a sequência na base de dados GenBank (número de acesso L22695.1). No DNA viral foi amplificado em todos os AMs, Ms, ACs e GH testado. Real-Time PCR para cDNA foi realizada em uma seleção de 5 PVs, 5 SPs, 8 CCEs, 3 dos quais eram os positivos para DNA viral CPV1. Os critérios de selecção das amostras a ser testada foi baseada na disponibilidade de material para extracção de ARN, após ensaios anteriores tivessem sido realizadas. Para os 3 casos de CCEs positivas para o DNA viral, a quantidade de tecido foi limitado ( 1 mm

2 seções). Nestes casos, a quantidade total de ARNm era extremamente baixa (cerca de 1 ng /mL), devido ao tecido residual escassa após os testes anteriores. papilomas virais foram usados ​​como um controlo positivo e ARNm viral foi recuperada em todos eles. Os três CCEs positivas para o DNA viral foram em vez negativo. Extração de RNA e ensaio experiências foram repetidas duas vezes de modo a avaliar o resultado e impedir a contaminação ambiental. Os resultados de PCR em Tempo Real são apresentados na Tabela 2.

características histológicas de CPV1 associada CCEs

O exame dos CPV1 CCEs positiva não apresentaram características histológicas peculiares que poderia ser suspeito de infecção pelo papilomavírus, em comparação com o grupo de CCEs CPV1 negativas (Tabela S2).

Discussão

o presente estudo avaliou a presença de CPV1 em lesões /hiperplásicos diferentes neoplásicas caninos orais, a fim de investigar o papel deste vírus em oncogénese oral. Na medicina humana, o papel oncogenetic de HPVs de alto risco foi demonstrada para o cancro do colo do útero [16] e mais consciência está crescendo por seu papel na patogênese de CCEs de cabeça e pescoço [15]. A consideração o aumento pagos para o estudo de PVs em medicina veterinária é justificada tanto pela atenção crescente para a saúde animal e pela possibilidade de usar o cão como modelo experimental para estudar a interação entre a infecção por PV e carcinogênese em humanos [33], [ ,,,0],34]. Apesar disso, existe pouca informação disponível sobre a prevalência de CPVs em tumores caninos. Com este estudo apontou que CPV1 é fortemente associada com VPs em cães em locais orais e perioral. Além disso, observou-se a presença de ADN viral apenas em três CCEs, ao passo que nenhum ARNm viral foi encontrado para demonstrar a actividade viral. Este resultado confirma o que é descrito na literatura veterinária [22], [35] sobre o baixo potencial de transformação maligna associada com infecção CPV1. Com base nos nossos dados, o cão não deve ser utilizado como um modelo para o estudo de lesões neoplásicas causadas por genótipos de alto risco de HPV.

Os resultados obtidos a partir da análise histológica de todos os papilomas orais incluídos no presente estudo mostrou que coilocitose e hipergranulose foram mais evidentes em VPs comparação com SPs. No entanto, mostrou 2/7 SPs hipergranulose ligeira ou moderada, de modo que este aspecto morfológico por si só não pode ser considerada um indicador fiável da infecção viral. De acordo com nossos resultados, a presença de coilócitos e corpos de inclusão representa o sinal histopatológico mais importante da presença viral. A imuno-histoquímica foi útil não só para confirmar a classificação histológica e avaliar o estágio da infecção, mas foi particularmente útil em casos de infecção PV fase tardia onde os corpos coilocitose e de inclusão não eram histologicamente evidente. Nestes casos, imunomarcação foi confinada às células descamativas da epiderme. A positividade citoplasmática encontrado em cinco CCEs, principalmente nas áreas de diferenciação escamosa, foi interpretado como um artefato, devido ao fato de que esses tumores foram negativos para amplificação de DNA.

Real-Time PCR confirmou a presença de ambos CPV1 ADN em todos os 15 VP do estudo e de ARNm viral nas cinco VP seleccionados testados. Isto confirma uma forte correlação entre CPV1 e VPs. Em nosso estudo, a maioria das VPs foram detectados em junções mucocutâneas e apenas um caso foi feita a biópsia da pele do queixo, de acordo com estudos anteriores relatando o possível CPV1 presença em lesões cutâneas [17], [22], [36]. Portanto CPV1 parece mostrar um tropismo menos marcada para as membranas mucosas em comparação com o alfa-HPV, que compreendem tipos de alto risco. infecções Alpha-HPVs de fato são geralmente restrito a mucosa oral e raramente podem ser encontrados em lesões cutâneas [37], [38], [39].

Apesar da ausência de PV-imunomarcação, PCR revelou a presença de ADN viral em 3/33 CCEs testado. Este número limitado de casos de ADN CPV1 positivos não nos permite tirar conclusões estatisticamente significativas sobre possíveis critérios histomorfológicas que podem ser associados com a presença do vírus. Cada um dos três casos apresentaram diferentes graus histológicos de diferenciação, atipia celular e inflamação. Digno de nota é que a busca de mRNA viral nestes três CCEs positivos para DNA CPV1 não deu resultados positivos. Diferentes hipóteses podem ser feitas para justificar este resultado. Em primeiro lugar, a quantidade de material a partir de biópsias de CCEs FFPE foi extremamente limitada quando cortado para extracção de ARN e este pode ter resultado numa excessivamente baixa quantidade de ARNm viral em mRNA total extraído, não permitindo a amplificação por PCR em tempo real. Por outro lado, uma vez que a positividade para ARNm viral foi encontrado em todos os VP utilizadas como um controlo positivo, pode-se assumir que CPV1 poderia ser interpretado como um espectador inocente no contexto de CCEs. Mesmo que a pele saudável de seres humanos e os cães podem funcionar como um reservatório para a infecção potencial PV [40], [41] espécimes deste estudo tinha sido previamente tratado com formalina, por conseguinte a hipótese de uma contaminação superficial parece improvável.

a PV-imunomarcação negativa associada a resultados negativos real-Time PCR (tanto para DNA viral e mRNA) em todas as outras lesões (hiperplásicas e neoplásicas) incluídos na presente estudo sugere que CPV1 tem provavelmente nenhum papel na patogênese da via oral canino lesões diferentes das VPs.

em conclusão, com este estudo, investigamos o papel de CPV1 em uma ampla gama de diferentes lesões neoplásicas e hiperplásicas resultantes na cavidade oral no cão. CPV1 foi fortemente associada com VPs. Uma vez que a presença e a actividade de transcrição de CPV1 só foram comprovadas para VP, parece improvável que o CPV coloca um elevado risco de progressão neoplásica. Além de ampliar o número de casos testados para a presença de CPV1, seria importante investigar o papel de outros tipos de CPVs na patogênese dos cancros mais comuns da cavidade bucal em cães. Considerando os nossos resultados, acreditamos que as lesões induzidas por CPV1 têm um baixo risco de progressão maligna e que o uso de CPV1 como um modelo para a cabeça associada ao HPV e cancro do pescoço, consequentemente, não é suportado pelos nossos dados, especialmente como a incidência de CPV1 em o CCSC testado era muito baixo.

Informações de Apoio

Tabela S1.

características histológicas dos 22 papilomas e virais neste estudo. Características de diferentes tumores foram classificados: 1 = fraca /moderada; 2 = moderada; . 3 = alto /grave

doi: 10.1371 /journal.pone.0112833.s001

(DOCX)

Tabela S2.

características histológicas dos 33 CCEs deste estudo. corpos IB = inclusão; IHC = imuno-histoquímica. Características de diferentes tumores foram classificados: 1 = fraca /moderada; 2 = moderada; 3 = alto /grave. ensaios de imuno-histoquímica com um resultado incerto (?) foram classificados como positividade negativo e incerto encontrou foi considerado como um artefato. N /A = não realizado devido a material escasso disponível para extração de RNA

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0112833.s002

(DOCX)

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer ao Dr. Emilia del Rossi e Luca Stefanelli por seus esforços e suporte técnico para este estudo.