Abstract

MicroRNA (miRNA) desempenhou um papel importante na progressão do cancro do fígado e dos seus valores de diagnóstico e prognóstico têm sido frequentemente estudadas. No entanto, diferentes técnicas de microarray e pequeno tamanho da amostra levou a resultados inconsistentes em estudos anteriores. Foi realizada uma meta-análise abrangente de um total de 357 tumor e 283 amostras não cancerosos de 12 estudos de expressão de miRNA publicados utilizando método de classificação de agregação robusto. Como resultado, identificamos uma meta-assinatura estatisticamente significativa de cinco regulada (miR-221, miR-222, miR-93, miR-21 e miR-224) e quatro reprimidos (miR-130a, miR-195, miR- 199A e miR-375) miRNAs. Em seguida, realizou previsão alvo miRNA e análise de enriquecimento caminho para encontrar o processo biológico destes miRNAs possam afectar. Descobrimos que a maioria das vias foram frequentemente associada a sinalização celular e patogênese do câncer. Assim, estes miRNAs pode envolver no aparecimento e progressão do câncer de fígado e servir como potenciais alvos de diagnóstico e terapêuticos desta doença maligna

Citation:. Yang J, Han S, Huang W, Chen T, Liu Y, Pan S , et ai. (2014) Uma meta-análise de microRNA expressão em cancro do fígado. PLoS ONE 9 (12): e114533. doi: 10.1371 /journal.pone.0114533

editor: Isabelle A. Chemin, CRCL-INSERM, França |

Recebido: 03 de julho de 2014; Aceito: 10 de novembro de 2014; Publicação: 09 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Projeto de Pesquisa de Guangxi Colleges and Universities (201203YB035) e Guangxi Projeto Chave de Ciência e Tecnologia (1355005-4-8). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de fígado em homens é a segunda causa mais frequente de morte por câncer e é a sexta maior causa de morte por câncer em mulheres, o que faz com que cerca de 700 mil mortes por ano, com cerca de 750 mil novos casos diagnosticados em todo o mundo. [1] sobrevivência baixa é atribuída ao diagnóstico tardio, resistência à quimioterapia, recorrência do tumor, e metástases, portanto, salientando a necessidade de novos diagnósticos e terapias. Numerosos estudos de expressão do gene mostraram que uma activação aberrante geral de vias de sinalização foi atribuído ao oncogenicidade, no entanto, uma assinatura ou um único percurso característica proeminente não poderia ser definida em cancro do fígado. [2]

MicroRNAs (miARNs), pequena não codificante RNAs de 18-25 nucleótidos de comprimento, que foram observados para controlar a expressão do gene em praticamente todas as células de cancro, foram abundantemente investigado sobre a ocorrência, progresso, classificação, diagnóstico e tratamento de tumores recentemente. O envolvimento de miARNs na patogénese do cancro está bem estabelecido, uma vez que podem comportar-se como oncogenes ou genes supressores de tumores, dependendo da função celular de seus alvos. [3] A compreensão da biologia do miRNA e sua contribuição para o desenvolvimento do cancro pode prometer o diagnóstico precoce eo controlo eficaz dos tumores malignos.

Os resultados recentes de estudos de perfil de integração e com base no mecanismo forneceram informações importantes sobre os papéis dos miRNAs em células normais e condição de doença. Estes estudos podem melhorar a nossa compreensão dos mecanismos moleculares de doenças hepáticas crônicas e câncer de fígado. Numerosos estudos ligando para a desregulamentação de expressão miRNA ao câncer de fígado foram relatadas com métodos variadas. [4] No entanto, devido à aplicação de diferentes plataformas tecnológicas e pequeno tamanho da amostra, a expressão miRNA profiling esforços levaram a resultados inconsistentes entre os estudos.

Para superar as limitações nas pesquisas atuais, foi realizada uma meta -Análise aplicação do método de classificação de agregação robusta, [5] seguido por análise de caminho, para identificar miRNA desregulamentação no cancro do fígado e das vias que miRNAs-chave podem ter impacto. O método de validação cruzada leave-one-out foi utilizado para validar os resultados. Identificação de miRNA meta-assinatura e invovled vias iria fornecer potenciais alvos para novos estudos experimentais de desenvolvimento de câncer de fígado.

Material e Método

Seleção dos estudos e os dados de extração

A sistemática pesquisa bibliográfica foi realizada para a identificação de estudos de câncer de fígado expressão miRNA de perfil usando uma estratégia de busca de dois níveis. Primeiro, realizamos uma pesquisa baseada em web em Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.-nih.gov/geo/) usando o termo de pesquisa (( “Neoplasias” [malha] e “fígado” [malha]) E “Os microRNAs” [MeSH]) e “seres humanos” [malha]. Para executar uma recuperação abrangente, procurando em ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), o Pubmed eo banco de dados Embase também foram realizadas. Em segundo lugar, as listas de referência de todos os estudos relevantes e existentes foram revistos através de uma busca manual para posterior identificação de potenciais estudos relevantes.

Os resumos foram selecionados com cuidado e foram avaliados textos completos de resumos potenciais relevantes. Estudos com delineamento experimental original que analisou a expressão miRNA profiling em humanos entre os tecidos de câncer de fígado e tecidos do fígado não-tumorais foram incluídos. Enquanto isso, os estudos não eram elegíveis para meta-análise, se eles se encontraram os seguintes critérios de selecção:. 1), utilizando apenas as linhas celulares, 2) pré-selecionada pesquisa genes candidatos, 3) criação de perfis diferentes subtipos clínicos ou histológicas sem incluir tecidos não-tumorais

As listas de miRNAs expressos estatisticamente significativas foram extraídos de publicações. Os autores foram contactados quando não poderia ser obtida nas listas. Todos os nomes de miRNA foram padronizados através versão miRBase 20. MiRNAs que não podem ser relacionados a qualquer -3p ou -5p em miRBase foram designados com HSA-miR- *, tais como HSA-miR-210. Os identificados como entrada mortos em miRBase foram permaneceu seus nomes mencionados nas literaturas

A análise estatística

As listas de miRNAs foram extraídas com base em valores de p teste estatístico ( . 0,05 foi considerado significativo ). Então, miRNAs em todas as listas foram priorizados por mudanças vezes ou outros valores que poderiam indicar o grau de desregulamentação. Para garantir que os miRNAs extraídos pode ser classificado de uma forma mais confiável, utilizamos o método de classificação de agregação robusto. [5] O método baseia-se na comparação entre os dados reais com um modelo nulo que assume ordem aleatória de entrada de listas. Um valor P atribuído a cada elemento da lista agregada descreveu como muito melhor foi classificado do que o esperado. Em caso de resultados falso-positivos, foi realizada correção de Bonferroni. Enquanto isso, para avaliar a estabilidade do p-valores adquiridos, sair para fora uma validação cruzada foi aplicada sobre o algoritmo de classificação agregação robusta. Um p-valor médio foi obtido a partir de listas de genes aleatórios depois de repetir a análises 10.000 vezes.

Clustering análise

Para verificar a correlação entre os perfis de expressão de miRNA de estudos individuais, foi realizado utilizando agrupamento hierárquico os miRNAs desregulados. Bidimensional-ligação média de agrupamento hierárquico de uma matriz de similaridade de correlação Spearman construído a partir de análises separadas para listas de genes regulada e reprimidos foi realizada.

identificação Integrative de alvos de miRNA

Os miRNAs meta-assinatura foram selecionados para a previsão de destino usando TargetScan banco de dados versão 6.2 [6], PicTar (previsões do banco de dados miRWalk) [7] e Diana-microT-CDS v5.0 (usando limiar de pontuação MITG 0,7) [8]. TarBase v6.0database [9] e banco de dados CLIP-Seq Base Estelar [10] foram usadas para adquirir alvos validados. Para melhorar a precisão da previsão alvo, alvos de consenso foram extraídas para as metas sobrepostas previstos pelo menos dois algoritmos mais validado metas de TarBase e Base Estelar.

Análise de Enriquecimento

Para identificar as vias de previu alvos miRNA, Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG), vias Panther e termos Gene Ontologia foram realizados com a ferramenta web GeneCodis (https://genecodis.dacya.ucm.es/). [11]

Resultados

Seleção dos estudos e os dados de extração

pesquisas de banco de dados inicialmente resultou em um total de 251 publicações e 16 estudos preencheram os critérios de inclusão. (Fig. 1) Quatro pesquisas [12] – [15] foram excluídos na análise final, porque as listas de miRNA classificados não eram nem público nem pessoalmente disponíveis com os autores correspondentes. A maioria dos estudos foram publicados entre 2009 e 2013. Dois terços das pesquisas vieram da região da Ásia e os remanescentes foram vêm da América e Europa. Além disso, estudos incluídos usadas várias plataformas de microarray e a média do número de sondas de miARN foi 626 (variando 121-1205). Um total de 357 amostras de tumor e 283 não cancerosas foram incluídos. A maioria dos estudos voltados para o carcinoma hepatocelular (HCC), em comparação com os tecidos adjacentes não tumorais ou tecidos normais do fígado, exceto Cario 2010 e Selaru 2009, que, respectivamente, focados em hepatoblastoma (HB) e colangiocarcinoma (CCA). As principais características desses estudos foram listadas na Tabela 1.

No total, foram relatados 136 miRNAs como significativamente regulada e 138 como significativamente regulada negativamente em estudos incluídos. O número de miRNAs significativamente desregulados variaram muito entre os estudos (variando de 14 a 91).

Cluster análise

Para avaliar o grau de concordância entre as listas de miRNA e possível correlação de acordo com os subgrupos de tumor histologia, região e tamanho da amostra, a análise de agrupamento hierárquico foi realizada (S1 Figura). O agrupamento de estas listas mostrou que os resultados de Shih 2012, 2011 e Sato Li 2008 utilizando os tecidos de carcinoma hepatocelular foram mais semelhantes entre si do que quaisquer outros estudos. Os resultados foram mais semelhantes Li 2008-1 e 2008-2 Li, conduzido pelo mesmo grupo de trabalho usando a mesma plataforma que o tamanho da amostra é muito diferente. Não é claro se houve alguma sobreposição das amostras entre os dois estudos, mas se este for o caso, pode ser uma explicação para a elevada similaridade dos resultados. Sem semelhanças mais evidentes foram observados entre outros subgrupos.

Mirna meta-assinatura

Identificamos uma meta-assinatura estatisticamente significativa de cinco miRNAs regulada e quatro miRNAs regulados negativamente em amostras de câncer de fígado em comparação com o fígado não cancerosos tecido de acordo com a p-valor de permutação. (Tabela 2) Apenas dois regulada mas não miRNAs subregulado atingiu significância estatística após correção de Bonferroni. O número de estudos miRNAs meta-assinatura relatado variou bastante, mas pelo menos três miRNAs desregulados foram relatados por cada estudo, com exceção do Cairo de 2010 e Selaru 2009, que acaba de informar separadamente dois miRNAs regulada. Os miRNAs mais significativamente desregulamentado, miR-221, miR-222, são, respectivamente, relatada por nove e dez conjuntos de dados. Além disso, os valores de p permutação de mais três miRNAs regulada, miR-93, miR-21 e miR-224 e quatro miRNAs reprimidos, miR-130a, miR-195, miR-199 e miR 375 são 0,05, mas não atingem o significado corrigido.

miRNA genes Meta-assinatura estão espalhadas em diferentes locais cromossômicas com uma exceção de miR-221 e miR-222 genes, que são ambos localizados no Xp11.3. MiR-224 genes estão localizados na mesma região cromossómica, Xq28, que é uma região citogenética que contém uma grande parte da família do gene antigénio de cancro /testículo. [16]

previsão alvo e análise de enriquecimento

alvos de consenso para miRNAs atingindo robusto de significância classificação agregação foram extraídos para os alvos sobrepostos previstos pelo menos dois algoritmos mais validada experimentalmente alvos a partir de duas bases de dados. O verão de contagens de destino é apresentado na Fig. 2. miR-130a e miR-195 tem mais alvos do que outros miRNAs, enquanto que miR-199 não tem metas, porque foi previsto por apenas um algoritmo.

análises de enriquecimento foram realizadas utilizando genes alvo previsto com ferramenta web GeneCodis. Várias vias enriquecidos por KEGG e Panther caminhos eram relativamente significativa ea maioria deles eram frequentemente associada a sinalização celular (por exemplo neurotrofina, Wnt, FGF, e via de sinalização p53) e câncer. (Tabela 3, Fig. 3, Figura S2)

A intensidade da cor representa o valor de p-FDR corrigido. Apenas os caminhos, que foram significativos para mais de quatro miRNAs são mostradas (estão disponíveis dados completos como S2 Figura).

Discussão

Usando o método de classificação de agregação robusta, 14 listas de miRNA priorizados a partir dos 12 estudos publicados foram analisados ​​e, finalmente identificou cinco upregulated e quatro miRNAs reprimidos. Mas após a correção de Bonferroni apenas dois miRNAs regulada chegou a diferença estatística.

Os miRNAs desregulados identificados por diferentes centros de pesquisa não permitem uma conclusão consistente. As diferenças entre as técnicas de microarray, estágio do tumor, aparência histológica e fatores etiológicos atribuídos à heterogeneidade. [17] Tem havido tentativas para dividir os conjuntos de dados em subgrupos com base na plataforma e do tipo de tumor subtipo, mas nenhum dos dois estudos têm utilizado a mesma plataforma e a maioria de amostras de tumores foram a partir de tecidos de carcinoma hepatocelular. No entanto, a análise de agrupamento demonstrou que dois conjuntos de dados realizados por um grupo de trabalho utilizada uma plataforma idêntica feita alta similaridade e anteras meta-análise utilizado o método de classificação de agregação robusta também levou à mesma conclusão que nós. [18]

Neste estudo, foi utilizado o método de Bonferroni para controlar a taxa de falsos positivos e fez os resultados mais fiáveis. Em última análise, miR-221 e miR-222 foram apenas dois miRNAs estatisticamente significativas meta-assinatura. Além disso, os valores de p de permutação de outro três upregulated (MIR-93, miR-21 e miR-224) e quatro miARNs regulados negativamente (miR-130a, de miR-195, o miR-199 e miR-375) foram 0,05, mas os seus valores de p corrigidas não foram significativos. As seguintes limitações podem explicar esses constatação: 1) não havia conjuntos de dados suficientes para a integração, 2) os tamanhos das amostras dos conjuntos de dados eram relativamente pequenas, 3) diferentes pesquisadores metodologia utilizada feito mais discrepantes

Embora nenhum significado forte. foi visto em todos os miRNAs meta-assinatura, estudos experimentais em anos recentes demonstraram que eles estavam altamente associado com câncer de fígado. MiR-221 foi a mais estudada entre os miRNAs meta-assinatura. Fornari et ai. [19] provaram que miR-221 funcionava como um oncogene na hepatocarcinogênese, visando CDKN1B /p27 e CDKN1C /p57 em 2008. Enquanto isso, os resultados de Gramantieri et al. [20] indicaram que o miR-221 inibiu a apoptose por segmentação Bmf e a sua sobre-expressão foi associada com um fenótipo mais agressivo em 2009. Em conjunto, estes resultados implicado que o miR-221 pode ser um alvo potencial para o tratamento não convencional contra HCC. Além disso, Park et ai. [21] verificaram que o miR-221 silenciamento bloqueado carcinoma hepatocelular e promovendo a sobrevivência num modelo de rato ortotópico válido do HCC e Callegari et ai. [22] e Pineau et al. [23] têm, respectivamente, confirmaram o papel oncogênico de miR-221 no modelo de ratos. Além disso, Li et al. [24] demonstraram que o soro miR-221 pode fornecer significado preditivo para o prognóstico de pacientes com CHC e He et al. [25] demonstraram que o miR-221 inibiu silenciamento propriedades malignas de cancro do fígado in vitro e in vivo. Juntos, miR-221 foi estudado profundamente sobre o seu impacto sobre o câncer de fígado, e que poderia ser um alvo potencial candidato para o diagnóstico e tratamento do câncer de fígado.

Além de miR-221, alguns outros miRNAs têm sido experimentalmente provou associar com a ocorrência, desenvolvimento, e metástase. Três miRNAs meta-assinatura regulada, miR-222, miR-21 e miR-224, pode exacerbar HCC através AKT vias de sinalização. [26] – [28] miR-222 sobre-expressão é comum no HCC e poderia conferir potencial metastático em células do CHC, possivelmente, através do reforço da sinalização AKT. [26] miR-21 suprime PTEN e HSulf-1 expressão e promove a progressão HCC através de vias AKT /ERK, e como para miR-224, que possivelmente activa o AKT vias de sinalização, visando PPP2R1B. [27], [28] Um estudo recente mostrou que o miR-21 e miR-222 expressões foram diferencialmente modulados por proteína de Hepatite B virus X em hepatócitos malignos. [29] Além disso, o miR-224 pode desempenhar um papel significativo na migração e invasão de células HCC. [30] – [32] Curiosamente, dois miRNAs meta-assinatura reprimidos, miR-195 e miR-375, pode desempenha funções inibidoras importantes na progressão HCC. [33] – [38] Por exemplo, o miR-195 pode inibir a progressão do carcinoma hepatocelular por segmentação LATS2 e a NF-kB via de sinalização de [33], [34] e suprimir a angiogénese e metástase de carcinoma hepatocelular por inibição da expressão do VEGF, VAV2 , e CDC42. [35] Xu et al. provaram que o miR-195 desempenhado um papel importante no controlo do ciclo celular e na etiologia molecular de HCC. [36] Por outro lado, o miR-195 pode ter como alvo PCMT1 no carcinoma hepatocelular que aumenta a vida útil do tumor [39] e negativamente regular os níveis de proteína de esteróide-3 coactivador do receptor através visando a sua região 3 ‘não traduzida em células de carcinoma hepatocelular [40]. Outra downregulated miARN, miR-375, também tem sido provado para suprimir o crescimento de células de cancro do fígado in vitro ou in vivo. [37], [38]

Embora tenhamos demonstrado que miRNAs podem envolver na promoção ou inibição da progressão do cancro do fígado, visando alguns genes nas vias principais de regulação câncer, ainda há um longo caminho a percorrer na interpretação o impacto do miRNA em câncer de fígado. Os trabalhos futuros deverão manter foco contínuo sobre o mecanismo através do qual miRNAs regulam ocorrência, progressão e metástase de câncer de fígado. Além disso, são necessários estudos com grande tamanho da amostra e da mesma plataforma.

Em conclusão, sugerimos que os miRNAs meta-assinatura são requisitos imprescindíveis reguladoras do processo oncogênico, que podem ser bons alvos potenciais para o diagnóstico e terapia de câncer de fígado.

Informações de Apoio

S1 Figura. A análise de agrupamento

da lista de miRNA. correlação possível foi mostrado de acordo com os subgrupos de histologia do tumor, região e tamanho da amostra. Clustering foi realizada por meio de correlação de Pearson e o método average linkage

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s001

(TIF)

S2 Figura. enriquecimento

Caminho de meta-assinatura alvos de miRNA. A intensidade da cor representa o valor-p FDR corrigida. Clustering foi realizada por meio de correlação de Pearson e o método average linkage

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s002

(TIF)

S1 Checklist.

PRISMA Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114533.s003

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Sr. Hui Chen e Sra Shanshan Zeng pelo seu apoio na sala de trabalho e rede de recuperação.