Sumário

MicroRNAs (miRNAs) têm sido relatados para desempenhar um papel crítico na invasão e metástase do cancro. Nosso estudo anterior mostrou que o miR-375 com frequência reprimidos no câncer gástrico suprime a proliferação celular, visando Janus quinase 2 (JAK2). Aqui, Descobrimos ainda que o nível de expressão de miR-375 é significativamente diminuída em tecidos de cancro gástrico metastáticas em comparação com os controlos não-metástase. A expressão ectópica de miR-375 inibe a migração e invasão das células cancerosas gástricas parcialmente visando JAK2. Além disso, o miR-375 expressão é regulada negativamente por o factor de transcrição Snail metástases associadas, que se liga directamente ao promotor putativo de miR-375. Além disso, a sobre-expressão de Snail pode inverter parcialmente a inibição da migração de células de cancro gástrico causada por miR-375. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que miR-375 pode ser regulado negativamente por Caracol e envolvidos na migração de células de câncer gástrico e invasão potencialmente, visando JAK2

Citation:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, Você T, et al. (2014) Caracol-Regulado miR-375 Migração inibe e invasão das células de câncer gástrico pela segmentação JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de fevereiro de 2014; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 23 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Natural Científico da China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 e 31100975), Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2013CB945603, 2012CB945004 e (2011CBA01001), Ministério da Educação da China (20110101110103 e (20130101120001), Natural Scientific Fundação da Província de Zhejiang, China (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 e Y2100106), a 111 Projecto (B13026), os fundos investigação fundamental para as universidades Central (2014QNA7015) e Programa Provincial de Zhejiang para o cultivo de alto nível talentos saúde inovadores. a financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

a metástase é os aspectos mais terríveis de câncer e tem sido estudada há mais de 100 anos [1], [2]. No cancro gástrico, a elevada taxa de mortalidade principalmente atributos de diagnóstico retardado por causa da falta de sintomas específicos em fase precoce. E metástase é responsável para a mortalidade relacionada com o cancro gástrico [3], [4]. A migração e a invasão de células cancerosas são processos essenciais durante o cancro procissão metastático, que consiste numa série de passos inter-relacionados, incluindo a proliferação, descolamento, circulação, transporte, paragem de órgãos, adesão a parede do vaso, o extravasamento, o estabelecimento de um microambiente, e proliferação em órgãos distantes. No cancro gástrico, células de invasão para o tecido circundante é um passo inicial importante [3], [5]. No entanto, os mecanismos de gástrica células cancerosas migração, invasão e metástase não foram completamente compreendidos.

Nos últimos anos, várias moléculas, por exemplo, factores de crescimento, citocinas, moléculas-remodelação da matriz extracelular, e alguns factores de transcrição tais como Caracol, twist and ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], foram revelados para impulsionar o progresso da migração de células cancerosas, invasão e metástase. Ultimamente, tornou-se evidente que, além de alterações nos genes que codificam proteínas, as alterações nos genes não-codificantes podem igualmente contribuir para a migração de células de cancro, invasão e metástase, tais como miARNs, que são uma classe de pequenos de cadeia simples moléculas de RNA não codificante que regulam a expressão de genes com grande potencial e têm sido implicados na regulação das células cancerosas migração, invasão e metástase como activadores ou supressores de [12], [13], [14], [15], [16] . Até à data, um número de miARNs têm sido estudados para ser implicada na progressão da metástase do cancro gástrico, por exemplo, o miR-218, miR-9, miR-7, e miR-146a [6], [17], [18], [19]. Temos estudado a associação entre miRNA desregulado específico e passo específico metástase de câncer gástrico, que irá fornecer insights sobre os potenciais mecanismos de gástrica células cancerosas migração, invasão e metástase.

Em nosso estudo anterior, miR-375 foi significativamente regulada negativamente em câncer gástrico e inibiu a proliferação de células cancerosas gástricas, visando JAK2 [20]. Curiosamente, no presente estudo, verificou-se ainda que o nível de miR-375 expressão era ainda menor em amostras de câncer gástrico de pacientes com metástase positivo compaired com a de pacientes sem metástase. Assim, propusemos que o miR-375 pode ter um papel causal na metástase do câncer gástrico. Nossos estudos descobriram que a expressão ectópica de miR-375 inibiu a migração e invasão das células cancerosas gástricas também parcialmente visando JAK2. Nós ainda solicitado para descobrir como expressão de miR-375 foi regulamentada no câncer gástrico. Os resultados indicaram que miR-375 era um alvo do fator de transcrição metástase associado Caracol e sua expressão foi inversamente correlacionada com caracol no câncer gástrico. A sobre-expressão de Snail pode inverter parcialmente a inibição da migração de células de cancro gástrico causada por miR-375. Assim, nossos resultados demonstram que o miR-375 inibe gástrica migração células cancerosas e invasão através Snail via /miR-375 /regulação JAK2.

Materiais e Métodos

As amostras clínicas (Declaração de Ética) e celular linhas

espécimes clínicos de câncer gástrico e suas amostras gástricas não malignas correspondência par de 39 pacientes submetidos a ressecção de câncer gástrico foram fornecidos por Sir Run Run Shaw Hospital (Hangzhou, China). Todas as amostras foram coletadas com o consentimento por escrito dos pacientes, como descrito anteriormente [20]. Ambos os tecidos tumorais gástricas e tecidos gástricos não tumorais adjacentes recolhidos após a cirurgia foram divididos em duas partes. Um deles foi congelado em nitrogênio líquido imediatamente para uso posterior, outra parte foi armazenada em formalina para exame anatomopatológico. Os pacientes envolvidos no estudo foram separados em grupos de metástase positivo (9/30) livre de metástases e. As linhas de células de câncer gástrico (AGS e MGC-803) e uma linha celular epitelial gástrica não-malignas (GES-1) foram descritos anteriormente [20].

RNA extração

O RNA total de amostras e linhas celulares gástrica foi extraído utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, TX, EUA), seguindo o protocolo do fabricante.

quantitativa PCR em tempo real a análise

a expressão de miR-375 foi ensaiada utilizando TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems, CA, EUA) com iniciadores específicos (P /N: 4373151, Applied Biosystems). reacção de transcrição reversa foi feito a partir de 10 ng de ARN total utilizando os iniciadores enrolados. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada utilizando o protocolo padrão Taqman microARN Ensaios em ABI7500 Real-Time PCR Detection System. O método para a quantização relativamente ΔΔCt foi utilizado para determinar a expressão de miARN. A CT é o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência de cada amostra passa o limiar fixo. O ΔCt foi calculado subtraindo o Ct do snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) do Ct do miRNA de interesse. O ΔΔCt foi calculado subtraindo o ΔCt da amostra de referência (emparelhado tecido não maligno para amostras cirúrgicas, tecidos normais e GES-1 de células de linhas celulares de cancro gástrico) do ΔCt de cada amostra. Dobre a mudança foi determinada como 2

-ΔΔCt.

Migração e ensaio de invasão

As células foram transfectadas com 20 nM de pré-miR-375 ou negativo controle usando transfecção Agent (Ambion, TX, EUA) seguindo o protocolo do fabricante, em placas de 24 poços. 24 h após a transfecção, o ensaio de migração Transwell e ensaio de invasão de Matrigel foram realizadas separadamente, através de 24 poços insere Transwell com tamanho de poro 8 (Corning Costar Corp). Para o ensaio de migração Transwell, 2 × 10

4 AGS ou 3 × 10

4 MGC-803 células suspensas em meio de correspondente cultura 100 ul, sem soro fetal de bovino (FBS) foram carregados para dentro da câmara superior da Transwell Insert com non membrana -Revestido. Para o ensaio de invasão de Matrigel, 5 × 10

4 AGS ou células MGC-803 foram plaqueadas em 100 de meio isento de soro ul na câmara revestida de Matrigel superior em vez disso. Em ambos os ensaios, a câmara do fundo foi de 600 contendo meio ul com 20% de FBS. As células foram, em seguida, deixada a migrado ou invadido por 12 h a 37 ° C. As células que migraram ou invadido para dentro da câmara inferior foram fixadas, coradas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1:1000), visualizadas ao microscópio de contraste de fase e fotografados. número total de células que migraram ou invadidas foi contado pelo IPP software (Imagem-Pro Plus 6.0). Todas as experiências foram repetidas, independentemente, pelo menos, três vezes.

cura arranhões ferida ensaio

As células foram transfectadas tal como descrito anteriormente e deixou-se crescer até à confluência. As células foram então cultivadas em meio correspondente sem FBS durante 12 h e depois riscados com uma ponta de pipeta. áreas das feridas foram marcadas e fotografado em 0 h, 12 h, 24 h e 36 h, respectivamente. A taxa de migração das células foi avaliada por ambos fotografando e quantificar a distância migrada de células movidas a partir da borda da ferida para o centro utilizando o sistema de IPP 6.0. Todas as experiências foram repetidas três vezes.

Constructos

para produzir o plasmídeo pGL3-375pro, a sequência de ADN contendo pri-miR-375 (primário miR-375) promotor foi amplificado por RT-PCR utilizando os iniciadores 5′-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT CTC AAG CGA-3 ‘e 5′-AAGCTT ATCG ACG CCT AGC TGG TTG TCC-3′ e, em seguida clonado no vector pGL3-basic (Promega). Para construir o plasmídeo que expressa Snail em células, a sequência de estrutura de leitura aberta (ORF) de Snail foi clonado no vector de expressão de mamífero pEGFP-C1 (Clontech, CA, EUA) utilizando os iniciadores 5’-ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 ‘e 5′-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3’. Para a expressão ectópica de JAK2 marcado com FLAG, JAK2 humana com a região de codificação foi clonado pCMV-Tag 2C vetor. Para construir o plasmídeo que expressa o miR-375 em células de mamíferos, os oligonucleótidos emparelhados com base na sequência primária de tem-miR-375 e as suas regiões flanqueadoras foram clonados no vector de expressão de mamífero pEGFP-C1 (Clontech, CA, EUA). Todas as construções foram confirmadas por sequenciação.

Luciferase Assay

Quarenta mil células foram inoculadas em placas de 24 poços 24 h antes da transfecção. As células foram transfectadas com qualquer vector de pGL3-375pro ou pGL3-Basic. O vector pRL-TK (Promega, WI, EUA) contendo

Renilla luciferase também foi co-transfectado como um controlo de referência. Firefly e

Renilla

actividades de luciferase foram medidos usando Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 h após a transfecção. Firefly atividade luciferase foi normalizada para a actividade luciferase Renilla.

Análise estatística

Os dados são representados como média ± erro padrão (SE) de três experimentos independentes. As relações entre a expressão de miR-375 e a expressão de mRNA Caracol foram exploradas pela

O coeficiente de correlação de Pearson

, que foi descrito anteriormente [20]. Estudante de

t

-teste e

X

2 de teste foram realizados para determinar a significância estatística.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

miR-375 é drasticamente reprimidos em células cancerosas gástricas e tecidos de pacientes com metástase positivo

.

Para descobrir se miR-375 está associada com a metástase do câncer gástrico, foi detectada pela primeira vez o nível de expressão de miR-375 em tecidos de câncer gástrico primários de pacientes com metástase-positiva e livre de metástases. Quando comparado com as amostras de pacientes livres de metástase, o nível de expressão de miR-375 era redução de quase duas-vezes em tecidos de pacientes com metástases-positivas (

P

0,05) (Figura 1A). Em consonância com este resultado, o nível de expressão de miR-375 em linhas celulares gástricas foi negativamente associado com as habilidades de células migração e invasão. As propriedades metastáticas de linhas de células epiteliais gástricas (GES-1, MGC-803, AGS) foram caracterizados. Como mostrado na Figura 1C e 1D, migração e invasão capacidades de linha celular de AGS foram maiores do que a de MGC-803 e GES-1 linhas de células (

P

0,01). Inversamente, o miR-375 a expressão em células AGS foi menor que a do MGC-803 e células GES-1 (

P

0,01) (Figura 1B). Em uma palavra, miR-375 é regulada negativamente em tecidos de câncer gástrico de pacientes com metástase-positivas e em células cancerosas gástricas com maiores capacidades de migração e invasão. Esta correlação indica que o miR-375 pode ter um papel causal na metástase do cancro gástrico.

A expressão de miR-375 foi investigado por qRT-PCR. (A) mudanças vezes relativamente (tecido tumoral /tecido normal, T /N) entre as amostras com câncer gástrico de pacientes livre de metástases ou -positivas e os seus tecidos não malignos adjacentes. O nível de miR-375 expressão era redução de quase duas vezes em tecidos de pacientes de 30 metástases-positivos do que aquele de 9 pacientes livre de metástases,

* P Art 0,05. (B) O nível de expressão de miR-375 em três linhas epiteliais gástricas humanos de células com diferentes habilidades migração e invasão. O nível de expressão de miR-375 em células AGS foi menor que a do MGC-803 e células GES-1.

** P Art 0,01. As habilidades de migração e invasão das três linhas de células epiteliais gástricas (C, D) foram medidos com transpo� câmaras. As fotos são campos representativos de células invasoras (D) na membrana migrou (C) ou. Os gráficos de barras representam o número médio de células na face inferior da membrana ± SE. **

P Art 0,01 em comparação com a linha de células epiteliais gástricas não-malignas GES-1

A superexpressão de miR-375 inibe gástrica células cancerosas migração e invasão

.

Para explorar o papel do miR-375 em metástases do cancro gástrico, examinámos o efeito de miR-375 sobre-expressão na migração e invasão da AGS e MGC-803 células de cancro gástrico com baixa expressão endougenous de miR-375. As células foram transfectadas quer com miR-375 precursor (miR-375) ou oligonucleótidos de controlo negativo precursoras-(negativo) ou nenhuma das opções acima (Mock). O ensaio de migração Transwell mostrou que a sobre-expressão de miR-375 inibiu significativamente a migração de AGS (Figura 2A, 2B) e MGC-803 células (Figura S1A, S1B). Em consistente com estes resultados, o ensaio de cura zero-ferida também revelou que as velocidades de AGS (Figura 2C, 2D) e MGC-803 células (Figura S1C, S1D) migração para a área da ferida foram significativamente reduzidos após a sobre-expressão de miR-375 . Nós posteriormente utilizado ensaio de invasão de Matrigel e descobriram que a sobre-expressão de miR-375 conduziu a uma redução de mais de duas vezes nas propriedades invasivas de AGS (Figura 3A, 3B) e MGC-803 células (Figura 3C, 3D). Colectivamente, estes resultados indicam que a sobre-expressão de miR-375 é suficiente para inibir tanto a migração e invasão habilidades de células cancerosas gástricas.

células AGS transfectadas com miR-375 precursor (miR-375), controle negativo (negativo ) ou nenhuma das opções acima (Mock) foram submetidos ao ensaio de Transwell migração (a) e scratch-cicatrização de feridas análise (C). (A) Os campos representativos de células migradas no lado inferior da membrana que foram fixadas e coradas com DAPI. (B) Número total de células migradas no lado inferior da membrana foi contado por um software IPP 6.0. (C) A migração de células para a área ferida foi fotografada por microscopia de 0 h, 12 h, 24 h e 36 h após o ferimento. As linhas a tracejado indicam as áreas de células sem. (D) A taxa de migração foi examinado através da medição da distância de células movidas a partir da borda da ferida para o centro, em 36 h após arranhão. Os dados são apresentados como média ± SE de pelo menos três experiências independentes. Bares, 50 um. **

P

. 0,01

AGS e MGC-803 células transfectadas com pré-miR-375 (miR-375), controle negativo (negativo) ou nenhum dos acima (Mock) foram objecto de análise Matrigel invasão. (A, C) foram mostradas campos representativos de células na câmara inferior, às 12 h após a invasão. As barras de escala, 50