Abstract

Evidências acumuladas indicam que numerosos microRNAs estão envolvidos na tumorigênese e progressão do câncer gástrico, enquanto o significado clínico de microRNA-214 em câncer gástrico é mal compreendida e o papel exacto do microRNA-214 em câncer gástrico permanece obscura. No presente estudo, os níveis de expressão de microRNA-214 em 80 tecidos carcinoma gástrico, 18 tecidos gástricos nontumourous, e 4 tipos de linhas celulares de cancro gástrico foram quantificados através de transcrição reversa seguido em tempo real por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), ea relação entre a expressão de microRNA-214 e as características cliniopathological incluindo prognóstico foi explorada. Para investigar o papel potencial do microRNA-214 em comportamento biológico de células de câncer gástrico, realizamos ensaios de proliferação celular, apoptose, migração e invasão em quatro linhas celulares de cancro gástrico e uma linha celular gástrica imortalizado

in vitro

. Os nossos resultados mostraram que microARN-214 foi dramaticamente regulada negativamente em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares de cancro gástrico, em comparação com os tecidos gástricos nontumourous. Observou-se a regulação baixa gradual de expressão microRNA-214 entre mucosa gástrica nontumourous, nonmetastasis tecidos de câncer gástrico, e metástase tecidos de câncer gástrico. A expressão de microRNA-214 foi significativamente inversamente correlacionada com metástases em linfonodos e tamanho do tumor, mas não teve correlação com o prognóstico do paciente. A expressão ectópica de microRNA-214 pode inibir a migração celular e capacidade de invasão em células de câncer gástrico SGC7901 e MKN45. E knockdown de microARN-214 facilitou significativamente a proliferação celular, migração e invasão de um modo específico de células em MKN28, e as células BGC823 GES-1. Factor estimulante de colónias 1 (CSF1) foi identificado como um gene alvo de microARN-214. Em resumo, os nossos dados demonstram que microRNA-214 é um romance biomarcador promissor para metástase linfática em pacientes com câncer gástrico. E identificou-se que a regulação baixa de microRNA-214 pode regular a proliferação, invasão e migração de células cancerosas gástricas diretamente pela segmentação CSF1

Citation:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) Significado clínico-patológico de microRNA-214 no câncer gástrico e seu efeito sobre célula biológica Comportamento. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 25 Abril 2013; Aceito: 11 de fevereiro de 2014; Publicação: 10 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81172351 e 81372856). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1]. Apesar dos estudos consideráveis ​​na tumorigénese e progressão da GC, a patogênese da doença complexa é mal compreendida. Assim, é de valor clínico vital identificar e caracterizar o mecanismo molecular preciso envolvido no desenvolvimento e progressão do carcinoma gástrico.

Para além da alteração genética e epigenética convencional de oncogenes que codificam proteínas, e genes supressores de tumores em processo de carcinogênese do GC, RNAs não protéicas de codificação, especialmente microRNAs (miRNAs), surgiram como um novo jogador para lançar luz sobre o mecanismo de desenvolvimento GC [2]. MiRNAs são endógenos 19-25 RNAs não codificadores nt que regulam negativamente a expressão da proteína através da promoção da degradação do mRNA ou reprimir a tradução da proteína, por meio da interação com o 3′-UTR de mRNAs alvo. Um número crescente de miARNs têm sido relatados para participar na carcinogénese e no desenvolvimento de cancros humanos, incluindo GC [2] – [4]. Estes miRNAs são geralmente desregulado e função ou como supressores tumorais ou oncogenes na iniciação e progressão de carcinomas humanos. Por exemplo, a Tsukamoto et ai. demonstraram que o miR-375 é regulada negativamente no carcinoma gástrico e exerce o seu efeito através da regulação negativa proapoptótica PDK1, uma quinase que fosforila Akt, e, por sua vez, inibe a via PI3K /Akt [5]. Enquanto o miR-21 foi encontrado para promover a proliferação e invasão do tumor em GC, regulando negativamente supressores de tumores importantes, tais como PTEN, PDCD4, e RECK, e, em seguida, confere células de GC com aumento da capacidade de invasão e a capacidade de evitar a anoikis [6] – [8 ]. Anteriormente, verificou-se que o miR-145 foi regulada negativamente em células de cancro humano múltiplas e suprimiu a cascata invasão de metástases em GC por inibição da tradução da proteína N-caderina [9], [10].

Actualmente, o significado clínico de microRNA-214 (miR-214) no prognóstico de pacientes com GC é mal compreendido, e o papel exacto do miR-214 em CG permanece incerto. Aqui, nós investigamos a associação entre o miR-214 parâmetros de expressão e cliniopathological, bem como avaliou o efeito do miR-214 em comportamentos biológicos, incluindo proliferação celular, apoptose, migração e invasão das células GC.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

As amostras de tecido foram preparados de um modo semelhante ao descrito anteriormente [9]. Resumidamente, 80 amostras (de 65 homens, 15 mulheres; 58,3 ± 17,49 e 61,5 ± 9,162 anos, respectivamente) de tecidos GC foram obtidos de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica no Qi Lu Hospital da Universidade de Shandong, de 2004 a 2006. mucosa gástrica Nontumourous mais de 3 cm de distância de tumores foi selecionado aleatoriamente a partir de 18 desses pacientes e utilizados como controle. Nenhum dos doentes recebeu tratamento pré-operatório, tal como terapia de radiação ou quimioterapia. Os espécimes foram digitados histologicamente de acordo com Lauren e da Organização Mundial da Saúde (OMS) de classificações (IARC Press, Lyon, 2000), e classificados de acordo com a UICC 2002 classificação TNM.

declaração Ética

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Shandong, Shandong, China (código de aprovação: 201101015). Obtivemos consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos no nosso estudo.

cultura celular

Quatro tipos de linhas celulares GC humanos foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (MKN28 e MKN45, Manassas, VA , EUA) e do Instituto Shanghai Câncer (BGC823 e SGC7901, Xangai, China). A linha de mucosa gástrica imortalizado células epiteliais GES-1 foi obtido a partir de Pequim ComWin Biotech Co., Ltd. (Pequim, China). As células foram mantidas em RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa incubadora humidificada de células com uma atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C.

miARN extracção

Usando um Kit miRNeasy FFPE (Bioteke, Beijing, China), foram isoladas miRNA a partir de tecidos embebidos em parafina de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total das linhas de células foi extraído usando o reagente Trizol (Takara, Dalian, China) seguindo o protocolo do fabricante. A qualidade e quantidade das amostras de ARN foram avaliadas por métodos espectrofotométricos padrão (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e diluiu-se para 2 ng /ul para análise RT-qPCR

transcrição reversa seguido de tempo real. quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (RT-qPCR)

os níveis de expressão de miARN foram quantificados utilizando um kit SYBR Primescript miARN RT PCR (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante, com um Bio-Rad ™ CFX 96 C1000 real sistema -time. Resumidamente, as amostras de RNA foram convertidos em ADNc por uma etapa de um Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China), seguido de qPCR em tempo real e normalizado utilizando U6 ARN nuclear pequeno (RNU6B) pela 2

-ΔCT Método. Primers para miR-214 e foram U6 de GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Todas as reacções foram corridas em duplicado.

transfecção celular

células em crescimento exponencial (1,5 × 10

5) foram semeadas em placas de 12 poços 12 h antes da transfecção e foram transfectadas com 30 nM precursor de miR-214 (miR-214), anti miR-214-inibidor (miR-214 inibidor), ou o controle negativo (Ambion, Austin, TX, EUA) utilizando o reagente de transfecção X-tremeGENE (Roche Applied Science, Indianapolis, nA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção foi monitorizada por meio de RT-qPCR às 24, 48, e 72 h após a transfecção.

Para a expressão estável de miR-214, células SGC7901 e MKN45 foram transfectadas com lentivírus de miR-214 que expressam o vector HSA-LV3 -miR-214 ou um controlo negativo LV3NC, que tem GFP como um marcador de proteína, de acordo com o protocolo do fabricante (GenePharma, Xangai, China). Três dias após a transfecção, a expressão da proteína GFP foi monitorizada com um microscópio de fluorescência. As células transfectadas foram rastreados com puromicina (1,5 ug /mL) para os que expressam de forma estável o miR-214.

proliferação celular ensaio

Após a transfecção, as células foram tripsinizadas, contadas e semeadas em 96 bem placas a uma densidade de 5 x 10

3 células /poço. E, em seguida, a proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de proliferação EdU como relatado anteriormente [11]. Resumidamente, 24 h após a transfecção, as células foram cultivadas em triplicado, a 5 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços no dia anterior EdU incubação (Ribobio, Cantão, China). Após a marcação edu, as células foram tratadas com 100 ul de 1 × Apollo cocktail de reacção, coradas com 100 ul de Hoechst 33342 (5 ug /mL) e visualizados sob um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão). A percentagem de células positivas edu foi definida como a taxa de proliferação. Os dados foram obtidos a partir de três experiências independentes e apresentados como médias ± desvio padrão (SD).

apoptose celular ensaio

Três dias após a transfecção de miR-214 percursor ou inibidor, as células foram recolhidas e coradas usando o V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit Anexina (BestBio, Xangai, China) como anteriormente descrito [12]. Em resumo, as células foram tripsinizadas, recolhidas e, em seguida, coradas utilizando a Anexina V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação com Anexina V-FITC e PI, as células apoptóticas foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo. Cedo células apoptóticas foram definidos como a população que foi negativo PI e Anexina V-FITC positivo, enquanto que as células apoptóticas foram tarde PI positiva e Anexina V-FITC positivo. A taxa total de apoptose foi calculado como a taxa de apoptose precoce mais a taxa de apoptose tardia. Anexina V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KEYGEN, Nanjing, China) foi utilizado para o ensaio de apoptose de células transfectadas vetor lentivírus, semelhante aos protocolos anteriores. Cada experimento foi realizado em triplicado, e os dados foram apresentados como médias ± DP.

A migração celular e ensaios de invasão

ensaios de migração e invasão celular foram realizados conforme descrito anteriormente [13]. ensaio de migração foi realizada com Transwell insere membrana com tamanho de poro de 8,0 milímetros (formato de 24 poços, Corning, Nova Iorque, EUA). Para medir a capacidade de invasão de células de GC, as inserções foram anteriormente mencionados pré-revestido com a matriz Matrigel (BD Ciência, Sparks, MD, EUA). As células (1 x 10

5) foram ressuspensas em meio isento de soro e semeadas à câmara superior. As câmaras inferiores foram cheias com meio de cultura completo contendo 10% de FBS. Após incubação a 37 ° C durante 24 h, as células que migraram presentes no lado inferior da membrana foram fixadas, coradas e contadas. Cada experiência foi realizada em triplicado.

ensaio da luciferase

Os ensaios de luciferase dupla foram realizados como previamente descrito [9]. Os fragmentos 3’UTR do gene CSF1 contendo o sítio de ligação de miR-214 foi amplificado por PCR a partir de ARN celular MKN45 utilizando os iniciadores da Tabela S1, e inserido no sítio Xba1 do pmirGLO miARN alvo vector de expressão (Promega, San Lius Obispo, CA, EUA). O vector resultante foi denominado pmirGLO-CSF1. Para o ensaio repórter da luciferase, e MKN45 BGC823 células foram semeadas numa placa de 12 poços um dia antes da transfecção. As células foram co-transfectadas com 30 nM de miR-214 percursor ou inibidor de miR-214, o controlo negativo e 30 ng pmirGLO-CSF1 utilizando X-tremeGENE reagente de transfecção (Roche Applied Science). Após 48 horas da transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de luciferase duplo (Promega) e normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. Cada experiência foi realizada em triplicado.

Western blot

A 48 h após a transfecção com o miR-214 percursor ou inibidor, as células foram submetidas a análise de Western blot, conforme descrito anteriormente [19]. Resumidamente, a proteína foi extractada a partir de células ou tecidos. Os lisados ​​foram separados por electroforese, transferidos para membranas de nitrocelulose e colocados a hibridar com anticorpos contra CSF1 (1:1000, Epitomics) ou β-actina (1:1000, Santa). Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes.

A análise estatística

As análises foram realizadas com o pacote estatístico Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As diferenças foram analisadas com o Student

t

-test entre dois grupos ou com o one-way ANOVA entre os três grupos. A correlação entre a expressão de miR-214 e tamanho do tumor em GC primário foi calculada pela correlação de Spearman. Na curva de sobrevivência, os dados foram analisados ​​pelo teste log-rank. Para determinar em que medida a expressão de miR-214 pode eficientemente separar diferentes subsettings clínicos, receiver operating análise característica (ROC) foi construído e a área sob a curva (AUC) foi calculada para avaliar a capacidade de miR-214 de expressão para diferenciar entre os casos de câncer e casos nontumourous, e para distinguir tecidos metastáticos e tecidos não-metastáticos.

P

-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

miR-214 é regulada negativamente em tecidos de carcinoma gástrico e quatro linhas de células de GC, em comparação com a mucosa gástrica nontumourous

em comparação com 18 amostras de mucosa gástrica nontumourous, miR-214 foi regulada negativamente de forma significativa (cerca de seis vezes) em 80 amostras primárias gástricas de tecido (Figura 1A,

P

= 0,0001). A curva ROC (ROC) de miR-214 refletida forte separação entre tecidos GC e tecidos nontumourous, com uma área sob a curva (AUC) de 0,7764 (Figura S1A, 95% de intervalo de confiança (IC), 0,6466-0,9062). Consistentemente, a regulação negativa de miR-214 foi validado em quatro linhas de células gástricas. Como mostrado na Figura 1C, o nível de expressão de miR-214 nas linhas celulares GC MKN28, BGC823, MKN45, e SGC7901 foi marcadamente atenuado em comparação com 18 amostras de tecido gástrico nontumourous (

P

0,05).

(a) em comparação com os 18 mucosa gástrica nontumourous, miR-214 foi significativamente regulada negativamente em 80 tecidos gástricos primários (

P

= 0,0001). expressão de miR-214 era e en menor em tecidos gástricos primários com metástase (metástase) do que os tecidos gástricos primários sem metástase (Nonmetastais). (B) os tecidos gástricos primários foram ainda divididos em um grupo de baixo metástase e um grupo de alto a metástase de acordo com o número de metástase ganglionar. (O ponto de corte foi definido como seis, que é um limiar para distinguir N0~N1 e N2~N3 em fase TNM (UICC, 2002). MiR-214 foi drasticamente reduzida no grupo de alto metástase em comparação com grupo de baixo metástase (

P

= 0,0455). (C) miR-214 downregulation foi validado em quatro linhas de células gástricas. Comparado a linha de células bem moderadamente diferenciado MKN28, miR-214 foi marcadamente atenuada em mal linha de célula diferenciada MKN45 e BGC823 e moderadamente pouco diferenciado e altamente metastático linha de células SGC7901. no entanto, detectamos menor expressão de miR-214 em GES-1, uma linha de células epiteliais gástricas imortalizadas, em comparação com quatro células de câncer gástrico (

*

P

.. 0,05) (D) Associação entre a expressão de miR-214 e tamanho do tumor em GC primário foi calculada pela correlação de Spearman Nossos dados sugerem que miR-214 expressão foi inversamente correlacionada com o tamanho do tumor (Spearman r = -0,2673,

P

= 0,0083).

no entanto, foi detectada expressão ainda menor de miR-214 em GES-1, uma linha de células epiteliais gástricas imortalizadas, que em quatro linhas de células GC (Figura 1C ,

P Art 0,05). Especulamos a discordância pode ser devido, pelo menos em parte, à diferença entre amostras clínicas e linhas de células, porque uma linha de células, isolado a partir de um paciente com uma determinada doença, representa o assinatura expressão miARN de apenas uma amostra clínica e as alterações possam, durante a célula cultura

in vitro

; em outras palavras, as amostras de tecidos são muito mais semelhantes ao contexto humano de linhas de células. Assim, comentamos que o miR-214 expressão em tecidos humanos GC foi mais representativa e credível do que a encontrada em linhas celulares.

Diminuição da expressão de miR-214 em GC está associado a metástases em linfonodos e tamanho do tumor, mas não tem correlação com o prognóstico do paciente

Para determinar as possíveis implicações clínico-patológicas de expressão de miR-214 alterados, combinamos os resultados qPCR e parâmetros clínicos. As correlações entre o nível de expressão de miR-214 e as características clinicopatológicas de GC são resumidos na Tabela 1. miR-214 de expressão foi correlacionada inversamente com o tamanho do tumor (Tabela 1,

t

-test,

P

= 0,0265; Figura 1D, Spearman r = -0,2673,

P

= 0,0083) e metástases em linfonodos (Tabela 1, Figura 1A,

t

-teste,

P

= 0,0164). No entanto, não houve diferença significativa em outras características clinicopatológicas, tais como sexo, metástase distal, a OMS classificação histológica e tipo histológico de Lauren entre estes dois grupos.

Curiosamente, encontramos downregulation gradual de miR-214 entre mucosa gástrica nontumourous, nonmetastasis tecidos e tecidos de metástases (Figura 1A, one-way ANOVA,

P

= 0,0006). Para avaliar a expressão de miR-214 em GC como um novo biomarcador para metástase ganglionar, curvas ROC foram estabelecidos. Observou-se uma separação nítida entre as pacientes com metástase ganglionar e aqueles sem metástase ganglionar, com uma AUC de 0,5880 (Figura S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). Os tecidos gástricos primários foram divididos em um grupo de baixo metástase e um grupo de alto metástase de acordo com o número de metástase ganglionar (LNM): baixo metástase foi definida como os casos com menos de seis LNM, e os casos com mais de seis LNM foram considerados de alto metástase. Como esperado, a expressão de miR-214 foi drasticamente reduzida no grupo de alto metástase em comparação com o grupo de baixo metástases (Figura 1B,

P

= 0,045).

De acordo com a amostra de tecido dados indicando a correlação entre a expressão de miR-214 e LNM, verificou-se que, em comparação com a linha de células moderadamente bem diferenciado MKN28, o miR-214 de expressão foi marcadamente menos nas linhas celulares pouco diferenciados MKN45 e BGC823, e especialmente a linha de células metastática SGC7901 [14] (

P Art 0,05)

no entanto, os nossos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa de miR-214 expressão em 18 amostras de tecido gástrico primários e seus loci metástase secundária (Figura 1B. ,

P

= 0,2676). Estes resultados sugerem que a regulação negativa da expressão de miR-214 ocorreu na fase inicial de desenvolvimento LNM e manteve-se estável, sem atenuação adicional na fase tardia de metástase.

Para explorar ainda mais o efeito de miR-214 no prognóstico de pacientes, foram analisados ​​os níveis de miR-214 expressão em casos com diferentes condições de status recidiva e sobrevivência. No entanto, os nossos dados mostraram que não havia diferença acentuada entre o grupo recaída e o grupo nonrelapse, ou entre o grupo de sobrevivência e o grupo de morte (Figura 2A-B,

t

-test,

P

0,05). De nota, dividimos os pacientes em grupos de alto expressão e de baixa expressão com base no nível médio de expressão de miR-214, e as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostrou nenhuma correlação significativa entre miR-214 expressão e sobrevivência livre de recidiva (Figura 2C , taxa de risco (HR) 1,23, 95% de intervalo de confiança (IC) ,6596-2,285;

P

= 0,5781) ou a sobrevida global (Figura 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151;

P

= 0,5832) em pacientes com GC.

() as amostras de tecido a foram divididos em um grupo de liberação e um grupo nonrelease de acordo com a evolução dos pacientes. Nossos dados não mostraram nenhuma diferença significativa na expressão de miR-214 entre estes dois grupos (

P Art 0,05). (B) como em (a), excepto as amostras clínicas foram classificadas no grupo sobrevivência e grupo da morte (

P Art 0,05). (C, D) Os pacientes foram divididos em grupos de alto e baixo de expressão de expressão com base no nível mediano de miR-214 de expressão. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou nenhuma correlação significativa entre a expressão de miR-214 e sobrevida livre de recidiva (taxa de risco (HR) 1,23, 95% de intervalo de confiança (IC) 0,6596, 2,285;

P

= 0,5781) ou global sobrevida (HR 1,20, 95% CI 0,6667, 2,151;

P

= 0,5832), porém houve uma tendência de que alta expressão de miR-214 foi associado com menor sobrevida livre de recidiva (sobrevivência média: 28.00 meses contra 74,50 meses, para alta expressão e baixa expressão, respectivamente) ou sobrevida global (sobrevivência média: 40.00. meses versus 47,50 meses, para alta expressão e baixa expressão, respectivamente)

Efeito do miR-214 em células proliferação de células de GC

Para controlar a eficiência da transfecção, determinou-se o miR-214 de expressão por RT-qPCR às 24, 48, e 72 h após a transfecção no precursor de miR-214, ou inibidor de células transfectadas e continuamente detectado miR- 214 expressão de vectores lentivírus células tratados durante 4 semanas. Como esperado, a transfecção do precursor de miR-214 resultou eficientemente no sobre-expressão significativa de miR-214 (Figura S2A-B,

P

0,05) e inibidor de miR-214 reduziu notavelmente o miR-214 em expressão miR- 214 células transfectadas com inibidores do que os grupos negativos (Figura S3E-F, figura S4 a,

P

0,05). Além disso, verificou-se que as células transfectadas com vector de lentivírus LV3-HSA-miR-214 poderia conduzir a uma mudança de 7 a 96 vezes de miR-214 e expressão em SGC7901 células MKN45 (Figura S3A-D,

P

0,05), com 80% -90% de células que expressam a proteína marcador GFP (Figura S3A, B)

para determinar se o miR-214 pode afectar a proliferação de células de GC, ensaio de proliferação EdU foi usada para. detectar a capacidade de crescimento celular. Os nossos dados mostraram que a sobre-expressão de miR-214 com vectores lentiviurs ou miR-214 precursor não influenciam o crescimento de células de SGC7901 (Figura 3A-B, figura S2C-D, P 0,05) e linhas de células MKN45 (Figura S2E-F, figura S5A-B, P 0,05). No entanto, descobrimos que downregualtion de miR-214 pode promover a proliferação de BGC823 (Figura 3C-D,

P

= 0,0010) e GES-1 (Figura S4B-C,

P

= 0,0474), mas não MKN28 linha celular (Figura S5C-D,

P

= 0,0938), de uma maneira especifica para a célula.

(a, C) fotografias representativas que após a transfecção com lentivírus miR -214-expressando vector em SGC7901 células e inibidor de miR-214 em células BGC823 (ampliação de × 100). (B, D) A percentagem de células positivas edu, calculadas pelo celular EDU-marcado (vermelho) número em relação ao número total de células (Hoechst-manchado, azul), foi definida como taxa de proliferação. Os dados não mostraram nenhuma diferença significativa na taxa de proliferação entre o grupo LV3-HSA-miR-214 transfectadas eo grupo controle negativo em SGC7901 células (

P Art 0,05). Enquanto descobrimos que miR-214 transfecção inibidor poderia resultar em um surpreendentemente aumentar a capacidade de proliferação de BGC823 células (

P

= 0,0010).

Papel do miR-214 na migração celular e invasão de células GC

Como miR-214 expressão foi inversamente associado com metástase ganglionar, que estavam particularmente interessados ​​na capacidade miR-214 para afetar a migração e invasão celular. Os nossos resultados indicaram que as células transfectadas SGC7901 e MKN45-LV3 com HSA-miR-214 mostrou uma diminuição significativa migração e capacidade de invasão, em comparação com o LV3NC células tratadas (Figura 4A-B, Figura S6A-B,

P

0,05). E observamos que downregualtion de miR-214 pode facilitar a migração e invasão de MKN28 (Figura 4C-D,

P

= 0,0491 e

P

= 0,0127, respectivamente). Embora knockdown de miR-214 não afectou a migração das células GES-1 (Figura S4D-E,

P

= 0,0879), silenciamento de miR-214 conduziu a um aumento de mais de 40% nas propriedades invasivas destas células (

P

= 0,0046). No entanto, nossos dados mostraram que a transfecção de miR-214 precursor não ter um efeito robusto sobre a migração e invasão celular em SGC7901 (Figura S2G-H,

P Art 0,05) e MKN45 (Figura S2I-J,

P Art . 0,05) células, em comparação com os respectivos controles negativos

(a, C) imagens representativas de migração e invasão ensaios in SGC7901 e MKN28 células (ampliação de 200 ×) são mostradas . (B, D) As células migradas foram contadas escolhendo cinco campos aleatoriamente de cada câmara e calcular o número médio. Nossos resultados mostraram que LV3-HSA-miR-214 transfecção marcadamente diminuem a capacidade de migração e invasão de SGC7901 (

P

= 0,0143 e 0,0210, respectivamente). Enquanto knockdown de miR-214 com miR-214 inibidor promove a migração celular (

P

= 0,0491) ea invasão (

P

= 0,0127) em MKN28 células.

Influência de miR-214 sobre a apoptose de células de células de GC

Para examinar o efeito de miR-214 sobre a apoptose de células, foram realizados ensaios de apoptose utilizando o V-FITC /método de coloração de anexina PI. Os nossos resultados demonstram que a sobre-expressão (miR-214 precursor e o vector de lentivírus) e knockdown de miR-214 não poderia afectar a apoptose celular, obviamente, em comparação com os controlos negativos em linhas celulares de quatro GC (Figura 5, Figura S2K-N,

P

0,05) e linha celular imortalizada gástrica GES-1 (dados não mostrados). De fato, encontramos uma tendência de capacidade pró-apoptose de miR-214 precursor na linha de células MKN45 (Figura S2M-N,

P

= 0,0606), no entanto, a diferença não foi estatisticamente significativa.

(a, C, e, G) As células foram marcadas com Anexina V-PE /7-AAD ou anexina V-FITC /PI, e analisadas por citometria de fluxo. Todos estes números são representativos de três ensaios independentes. estatísticas Quadrante: necrose ou mecanicamente feridos células superior esquerdo (UL), as células de apoptose tardia no canto superior direito (UR), as células viáveis ​​no canto inferior esquerdo (LL) e as células da apoptose precoce na inferior direito (LR). (B, D, F, H) A percentagem de células da apoptose precoce, células de apoptose tardia e células totais de apoptose foram, respectivamente, comparados entre LV3hsa-miR-214 grupo transfectadas e grupo CN, ou entre 214 miR-grupo transfectadas com inibidor e inibidor NC grupo. Os nossos dados demonstraram que LV3-HSA-miR-214 ou miR-214 inibidor não tem qualquer efeito na apoptose de células em SGC7901, MKN45, MKN28 e BGC823 células (

P

0,05). Embora tenhamos observado uma tendência de capacidade pró-apoptose de miR-214 em linha celular MKN45, no entanto, a diferença não foi estatisticamente significativa (

P

= 0,0950).

MiR- 214 directamente metas e para baixo-regula QCA 1 em células cancerosas gástricas

para identificar alvos de miR-214, que usamos algoritmo TargetScan para prever miR-214 alvos no cancro gástrico humano. Entre os numerosos candidatos possíveis, nós escolhemos os sobre-expresso em cancros e proliferation- e genes associados à metástase, incluindo NOTCH2, FGFR1, CSF1 (Figura 6A), AGAP2, CREB1, para posterior análise. Os nossos resultados mostraram que o miR-214 precursor transfecção reduziu significativamente a actividade de um gene repórter de luciferase fundido com o CSF1 3′-UTR, com 29,60% e 30,61% de redução, em comparação com os grupos de controlo negativo (Figura 6B,

P

= 0,0227 e 0,0093, respectivamente, para as linhas de células MKN45 e BGC823). Considerando que, quando o miR-214 inibidor foi transfectado, atividade luciferase foi aumentada em 34,49% e 42,25% em MKN45 e BGC823 células em comparação com os controles (Figura 6C,

P

= 0,0115 e 0,0085, respectivamente).

(a) as sequências complementares do ARNm CSF1 3′-UTR são mostrados com a sequência de miR-214. (B) A actividade da luciferase em MKN45 e BGC823 células transfectadas com miR-214 e pmirGLO-CSF1 foi significativamente defunto em comparação com os controlos negativos (

P

= 0,0227 e 0,0093, respectivamente). (C) Depois de miR-214 foi transfectada inibidor, a actividade de luciferase foi aumentado dramaticamente nos MKN45 e BGC823 células em comparação com os controlos (

P

= 0,0115 e 0,0085, respectivamente). (D) O efeito de miR-214 em níveis CSF1 foram testados em lisados ​​celulares GC por western blot. (E). Os nossos dados mostraram que a expressão CSF1 relativa foi significativamente diminuída em células transfectadas com o miR-214 precrusor, em comparação com as células transfectadas com o controlo negativo (

P

= 0,0037 e 0,0066, respectivamente).

determinou-se ainda a expressão da proteína CSF1 por western blot em células transfectadas com CG o miR-214 percursor ou inibidor. Consistente com os resultados de luciferase, a expressão da proteína CSF1 foi significativamente diminuída em células SGC7901 e MKN45 (Figura 6D-E,

P

= 0,0037 e 0,0066, respectivamente) transfectadas com o miR-214 e precursor aumentada em MKN28 e BGC823 células (Figura S7A-B,

P

= 0,0049 e 0,0416, respectivamente) transfectadas com o miR-214 inibidor, em comparação com os respectivos controlos. Estes dados sugerem que miR-214 inibe a tradução QCA 1 em células cancerosas gástricas.

Discussão

Emergentes evidências destacou o impacto crucial de miRNA desregulação na tumorigénese de carcinomas humanos [3], [4] . MiARN desregulação promove a proliferação de células, confere resistência à apoptose, e aumenta a capacidade de invasão e metástase, através da repressão dos supressores de tumor a jusante ou induzir a acumulação de oncogenes-alvo, e, assim, está envolvido na iniciação, progressão, metástase e de tumores humanos.

Entre a infinidade de miRNAs, desregulação do miR-214 foi encontrado em muitos cancros humanos [15] – [22]. Regulação negativa de miR-214 em cancro cervical tem sido relatada por vários grupos, e miR-214 tem mostrado inibir o crescimento, a migração e a invasão de células de cancro cervical por oncogenes segmentação MEK3, JNK1, plexina-B1, e GALNT7 [15 ] – [17]. [28].