(PARP-1)

Abstract

Poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) e autofagia desempenham papéis cada vez mais importantes no DNA reparação de danos e morte celular. Gemcitabina (GEM) continua a ser a primeira linha quimioterápico para câncer de pâncreas (PC). No entanto, pouco se sabe sobre a relação entre PARP-1 expressão e autofagia em resposta a GEM. Aqui demonstramos que GEM induz resposta DNA-danos e degradação de mono-ADP ribosylated PARP-1 através da via autofagia em células PC, que é resgatado por inibir a autofagia. Hipóxia e inanição de soro inibir a atividade autofágica devido à revogada mono-ADP-ribosylated PARP-1 degradação induzida pelo GEM. Ativação de quinases extracelulares regulamentados proteína (ERK) induzida por privação de soro mostra diferenças na localização intracelular, bem como a modulação da autofagia e PARP-1 degradação em GEM-sensível KLM1 e células KLM1-R resistentes ao. Nosso estudo revelou um novo papel da autofagia em PARP 1-degradação em resposta a GEM, e os diferentes impactos da via /sinalização ERK MEK sobre autofagia entre as células sensíveis-GEM e PC resistente à

Citation:. Wang Y, Kuramitsu Y, Tokuda K, Baron B, Kitagawa T, Akada J, et al. (2014) gemcitabina induz Poli (ADP-ribose) (PARP-1) Degradação da polimerase-1 a autofagia no cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (10): e109076. doi: 10.1371 /journal.pone.0109076

editor: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de outubro de 2013; Aceito: 08 de setembro de 2014; Publicação: 01 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por nenhuma subvenção. 24501352, www.jsps.go.jp/g-grantsinaid. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a gemcitabina (GEM) é atualmente o tratamento padrão para o cancro do pâncreas avançado e metastático (PC) em ambos os adjuvante e configurações paliativas, mas a resistência a GEM tem sido um grande problema como a sua taxa de resposta foi reduzido para 20% [1] – [4]. GEM podem inibir a síntese de ADN por direccionamento a ribonucleótido-redutase, que conduz à sua inclusão no ADN celular, provocando erros de replicação de ADN [5], [6]. Um estudo anterior relatou que o estresse replicação do DNA induzida pelo GEM, garfos de replicação paralisadas e desencadeou checkpoint vias de sinalização [7]. A inibição da quinase de ponto de verificação 1 (Chk1) com inibidores químicos sensibilização de células PC induzidos em resposta a GEM [8], [9]. Além disso células HCT116 reparação deficiente de incompatibilidade são mais sensíveis

in-vitro

para radiossensibilização mediada por GEM [8]. Embora a evidência mostrou a relação entre a reparação do ADN e sensibilização de células a GEM, os mecanismos responsáveis ​​pela reparação de danos no DNA induzidos por GEM não são claramente compreendidas.

A autofagia é uma via celular envolvido no volume de negócios de rotina de proteínas ou organelas intracelulares, com estreitas ligações com a doença e fisiologia humana [10]. disfunção autophagic está associada com o cancro, neurodegeneração, e infecções microbianas, assim como a resistência das células cancerosas a terapia anticancerígenos [11], [12]. GEM autofagia induzida em Panc-1 e células MiaPaCa-2, e a inibição da autofagia por 3-metiladenina (3-Me) ou membrana proteína vacúolo um knockdown diminuiu a apoptose em células tratadas com gemcitabina [13]. Por conseguinte, esta evidência indica que a autofagia pode desempenhar um papel essencial na apoptose de células PC em resposta a GEM.

Poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1) desempenha um papel crítico em muitos processos celulares e moleculares , incluindo a reparação de danos do ADN, a estabilidade do genoma, a transcrição e a apoptose [14]. PARP1 está envolvida na reparação de ambos os ADN de cadeia simples (ADNcs) e o ADN de cadeia dupla (dsDNA) quebras por ligação com extremidades de ADN e /ou interagir com as proteínas de reparação do ADN, exemplo subunidades (Ataxia Telangiectasia mutado) ATM e Ku ​​[15 ] – [18]. A inibição de PARP-1 aumenta a citotoxicidade dos agentes que danificam o ADN e a radiação

In-vitro

[19]. Os inibidores de PARP-1 foram relatados como potenciais fármacos quimioterapêuticos para o cancro da mama BRCA1 /BRCA2-deficiente e cancro do pulmão [20] – [21]. Assim, é necessário avaliar as mudanças de PARP-1 responsável por danos no DNA induzidos por GEM no PC.

No presente estudo, demonstramos que associada a microtúbulos de proteína 1A /1B-light chain 3 (LC3) , um fator chave de formação autophagosome, é regulada negativamente em KLM1-R em comparação com as células KLM1. GEM induziu uma resposta a danos no ADN e autofagia em células KLM1 e KLM1-R e sub-regulada de PARP-1. A inibição da autofagia bloqueou a degradação induzida pelo GEM de mono-ADP ribosylated PARP-1. A via de sinalização de MEK /ERK mostrou um efeito diferente sobre autofagia e degradação de PARP-1 induzida por GEM entre as células e KLM1 KLM1-R. Assim, destacamos uma nova visão sobre o caminho a autofagia na regulação da PARP-1 degradação em células PC.

Material e Métodos

Materiais

U0126 (9903S) e vortmanina (9951S) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Os anticorpos específicos para a p-ERK (sc-7383), ERK (SC-94200), p21 (SC-65595), Hsp27 (SC-13132), a PARP-1 (SC-8007 por Western blot e SC-1562 para confirmação e imunofluorescência), CTIP (sc-3970) e actina (sc-1616) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos específicos para LC3A /B (4108S), SIRT6 (12486), caspase-3 (9665) e PI3KCIII (4263S) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Os anticorpos específicos para Bcl2 (B3170), Ulk1 (SAB4200106) e Beclin1 (B6061) foram adquiridos da Sigma. Os anticorpos específicos para AMPKα1 (07-350) foi adquirida da Millipore.

cultura celular

Todas as linhas de células utilizadas neste estudo foram publicados anteriormente linhas celulares que foram fornecidos para nós como um presente . linha de células de pâncreas humano KLM1 (ID: TKG0490) foi clonado e estabelecido pelo Dr. Kobari M do Instituto de Departamento, Envelhecimento e Câncer, Universidade de Tohoku (Sendai, Japão) em 1996 [39]. GEM-sensível KLM1 e linhas celulares de cancro resistentes ao KLM1-R humanos pancreáticas foram generosamente fornecidos como um presente pelo Departamento de Cirurgia e Ciência em Kyushu University Graduate School of Medical Science. KLM1-R foi estabelecida expondo células KLM1 a GEM em estudos anteriores [40] – [41]. Estas células foram cultivadas no Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Gibco, 05918), suplementado com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS; GIBCO, 26140-079), e 2 mM de L-glutamina e incubadas, a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2.

transfecção transiente

KLM1 células foram semeadas e incubar a 37 ° C num CO

2 incubadora até as células estão 70% confluentes. As células foram transfectadas com ARNsi validado LC3B humana (SC-43390, Santa Cruz Biotechnology) ou ARNsi de controlo (SC-37007, Santa Cruz Biotechnology) seguindo um protocolo de transfecção siRNA (Santa Cruz Biotechnology).

Western blotting

As células foram lisadas com tampão de lise ((1% de NP-40, vanadato de sódio 1 mM, PMSF 1 mM, Tris 50 mM, NaF 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 165 mM, 10 ug /mL leupeptina, e 10 ug /ml de aprotinina) em gelo durante 1 h. os lisados ​​celulares foram, então, centrifugadas a 15000 × g durante 20 min a 4 ° C. o sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Lowry. quantidades iguais de proteína (20 ug) foram resolvidas por 5-20% de gel de SDS-poliacrilamida e, em seguida, transferidos para uma membrana de PVDF (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA).. a membrana foi incubada com o anticorpo primário adequado, a 4 ° C durante a noite seguida, a membrana foi lavada e incubada com uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. as imunotransferências foram visualizados com um reagente de quimioluminescência (Immunostar, Wako). Todas as experiências foram repetidas três vezes.

Imunofluorescência

As células foram cultivadas em lamelas de 15 mm redonda em placas de 12 poços a uma densidade de 1 × 10

5 células por poço. As células nas lamelas foram fixadas com paraformaldeído a 3,7% fresco em salina tamponada com fosfato (PBS) durante 30 min quando atingiram 70-80% de confluência. As amostras foram então lavadas com PBS, seguido de permeabilização com 0,1% de Triton X-100 durante 15 min. Após lavagem com PBS, foram incubadas em solução de bloqueio (soro de cabra 1% de soro de burro ou 1% em PBS com Tween 20 a 0,1%) durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram tratadas com um anticorpo primário em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. Após a incubação com o anticorpo primário, as células foram lavadas com PBS com Tween 20 (PBS-T) a 0,1% e incubadas com um anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS-T, os seus núcleos foram contra-coradas com DAPI 1,43 uM (4,6′-diamidino-2-fenilindol) durante 5 minutos. As lamelas foram lavadas com PBS-T, em seguida, montado de face para baixo sobre lâminas de microscópio com Fluoromount (BioSystems de diagnóstico, Pleasanton, CA, EUA). imagens confocais foram obtidos utilizando Nikon Plano de Apo 60X /objetivo 1,40, BZ-9000 (BIOREVO) e software Visualizador BZ-II (Keyence, Osaka, Japão) por um operador que não tinha conhecimento da condição experimental. Todos os parâmetros foram mantidos constantes dentro de cada experiência. As imagens digitais foram analisadas e a intensidade média foi medida usando o Image J. software.

Ensaio de Apoptose

Um número apropriado de células foi plaqueada e tratou-se durante 24 h. As células foram coradas utilizando Apo-BrdU

In Situ

kit de fragmentação de ADN de ensaio (80101, Biovision, Inc.) (dados não mostrados) ou caspases 3/7 kit de ensaio (12D51, Immunochemistry Technologies, LLC.). Estes experimentos foram realizados seguindo rigorosamente as instruções dos protocolos relativos.

Resultados

gemcitabina (GEM) induz a autofagia em células PC

Duas linhas celulares de cancro PC GEM-sensitiive KLM1 e resistente à KLM1-R, foram utilizados neste estudo. Estas linhas de células são definidos pela sua expressão de proteína de choque térmico 27 ​​(Hsp27) (Figura 1 A e B.), Que foi reportado como um marcador potencial para PC-resistente a GEM [22] – [24]. Além disso, a expressão de p21 foi demonstrado ser reduzida em KLM1-R em comparação com as células KLM1 (Fig. 1 B), indicando as diferentes fenótipos de ciclo celular entre elas. Em seguida, investigou autophagic actividade em células KLM1 e KLM1-R, que foi determinada pela expressão de LC3 [25]. Foi demonstrado que tanto a LC3-I e II foram regulados negativamente em KLM1-R em comparação com as células KLM1 (Fig. 1 B). Além disso, a infra-regulação da proteína quinase activada AMP-A1 (AMPKα1) e cinase 1 (Ulk1) UNC-51 como foram mostradas, ao contrário de fosfatidilinositol 3- quinase (PI3K CIII) ou em espiral espiralada-miosina como a proteína que interage com a BCL2 ( beclin-1), em KLM1-R em comparação com as células KLM1 (Fig. S1 a e B), indicando que a redução da actividade autophagic em células KLM1-R GEM-resistente pode estar relacionado com a regulação de AMPKα1 e /ou expressão Ulk1. Para determinar o efeito de autofagia induzida por GEM, as células foram tratadas com gema durante 5 horas (h) e, em seguida observadas por microscopia de imunofluorescência, utilizando coloração com anticorpo anti-LC3. Nesta configuração experimental, foi demonstrado que os pontos LC3 II foram aumentadas após as células foram expostas a GEM (Fig. 1 C). Estes dados sugerem que induz GEM autofagia em células PC.

(A) A expressão de Hsp27 foi testada por transferência de Western e a intensidade relativa foi medida por estudantil

t

teste (n = 3 ) (células B) e KLM1 KLM1-R foram lisadas e resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. Actina foi utilizada para normalizar os níveis de carga de proteína. (C) As células indicadas foram tratadas com 100 ug /mL de GEM durante 5 horas e a expressão de LC3A /B e formação de autofagossomas LC3-positivos foram examinadas por microscopia confocal. LC3A /B: verde e DAPI: azul. As setas indicam a autophagosome. Barra de escala, 20 ^ m.

GEM especificamente down-regula mono-ADP ribosylated PARP-1 de uma forma independente de caspase

Nós testamos o efeito do GEM em PARP-1 expressão em células PC utilizando uma análise western blot. KLM1 e KLM1-R mostrou uma redução notável de PARP-1, quando as células foram expostas a 10 ou 100 ug /mL de GEM durante 24 h (Fig. 2-A). Curiosamente, verificou-se que as bandas reduzidas de PARP-1 nos painéis induzidas GEM mostrou um ligeiro aumento no peso molecular do que nos painéis não tratados. Assim, este sugeriu que GEM especificamente induzida a sub-regulação de PARP-1, que foi mono-ADP ribosylated (Fig. 2 A). Zhiyong Mao

et ai.

Tinha definido a banda superior de PARP-1, tal como o mono-ADP ribosylated forma no resíduo de lisina 521, que foi induzida por sirtuina 6 (SIRT6) [26]. SIRT6 é um homólogo de mamífero da levedura Sir2 desacetilase e envolvidas na produção de citoquinas e a migração de PC [27]. Além disso, KLM1-R mostrou uma maior sensibilidade para GEM induzida por infra-regulação da PARP-1 do que as células KLM1. Dez? G /mL de GEM foi suficiente para reduzir significativamente tanto da expressão de PARP-1 em KLM1-R em comparação com as células KLM1 (Fig. 2 A). Para encontrar a explicação, nós, então, comparada a expressão de SIRT6 entre as células KLM1 e KLM1-R. Como era de esperar SIRT6 mostraram expressão forte (aproximadamente 1,5 vezes) em KLM1-R do que as células KLM1 (Fig. 2 A). Isto indicou que a eficiência de GEM na sub-regulação de mono-ADP ribosylated PARP-1 pode depender da expressão de SIRT6. Observamos também que GEM induziu a superexpressão da proteína CtBP-interagindo (CTIP), tanto em células KLM1-R (figura 2 A) KLM1 e. Porque as proteases da família da caspase cliva o substrato morte de PARP-1 a uma forma específica de 85 kDa observada durante a apoptose [28], que em seguida investigado se a caspase-3/7 foram relacionadas com a PARP-1 infra-regulação aqui. Nós revelou que o nível de actividade da caspase-3/7, bem como a apoptose não mostraram diferenças entre células KLM1 e KLM1-R, mesmo quando as células foram submetidos a tratamento GEM durante 24 h, como mostrado por Western blot (Fig. 2 A) e caspase-3 /7 ensaio de actividade (Fig. 2 B). Estes dados sugerem que GEM especificamente regulada para baixo mono-ADP ribosylated PARP-1 de um modo independente de caspases.

e células KLM1 KLM1-R (A) foram tratados por GEM com as concentrações indicadas, durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram resolvidas em SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. A expressão de PARP-1 foi confirmada repetidamente por um PARP-1 anticorpo distinto descrito em Materiais. Uma cabeça de seta indicada a forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. As setas indicam a posição da área de caspase-3 clivada. (B) As células indicadas foram tratadas como em (A) e, em seguida, coradas utilizando um kit de ensaio de caspases 3/7 (A). Caspase 3/7 atividade foi testado e medido por microscopia confocal e Imagem J. N. S., não significativo. As barras de erro, SD.

GEM suprime a expressão de mono-ADP ribosylated PARP-1 através da via de degradação autofagia

Como GEM induzida autofagia eo mono-ADP ribosylated PARP-1 infra-regulação de um modo independente de caspase, investigamos se mono-ADP ribosylated PARP-1 poderia ser diretamente degradadas por autofagia. células KLM1 e KLM1-R foram coradas com ambos os anticorpos anti-LC e anticorpo anti-PARP-1 após as células foram expostas a GEM durante 5 h e, em seguida, examinadas por microscopia de imunofluorescência. formação autophagosome induzida GEM foi encontrada para co-localizate com a PARP-1 em ambas as células e KLM1 KLM1-R (Fig. 3 A), que indica a relação entre a autofagia e PARP-1. Para testar GEM induzida por sub-regulação de mono-ADP ribosylated PARP-1 por meio de autofagia, LC3B siRNA, wortmanina (um inibidor de PI3K) e PMSF (um inibidor de protease vacuolar) foram utilizados para inibir a autofagia de células em resposta a jóia. GEM induzida PARP-1 mono-ADP ribosilação e sub-regulação KLM1, e a sub-regulação de PARP-1 foi revertida por LC3B knockdown (Figura 3 B). Esta redução de PARP-1 expressão pelo GEM em ambas as células KLM1-R KLM1 e também foram resgatados por tratamento com vortmanina ou PMSF (Fig. 3 C). Em conjunto, estes dados demonstraram que GEM induzida por sub-regulação de mono-ADP ribosylated PARP-1 foi mediada pela via de degradação autofagia.

células (A) e KLM1 KLM1-R foram tratadas com 100 ug /mL de GEM para 5 h. As células tratadas foram coradas com anticorpos específicos contra LC3A /B e PARP-1 e, em seguida, detectados por microscopia confocal. LC3A /B: verde, PARP-1: vermelho e DAPI: azul. Barra de escala, 20 mm. As setas indicam a coloração amarela de co-localizações entre autophagosome e PARP-1. células (B) KLM1 foram expostos a GEM durante 24 h após knockdown LC3B. células (C) e KLM1 KLM1-R foram expostas a GEM durante 24 h na presença ou ausência de qualquer PMSF ou wortmanina nas concentrações indicadas. Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos contra a PARP-1. A cabeça da seta indica a forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. A expressão de PARP-1 foi confirmada repetidamente por um PARP-1 anticorpo distinta descrito em Materiais.

privação de soro induz a ativação e diferente localização da quinase regulada por sinal extracelular (ERK) em KLM1 e KLM1- R células

para determinar o efeito da privação de soro sobre a actividade de ERK e autofagia, as células foram cultivadas em meio fresco com ou sem FBS durante 24 horas e examinadas por transferência de western e microscopia de imunofluorescência. Demonstrou-se que a ERK foi activada por privação de soro e em células KLM1 KLM1-R e que GEM não tem nenhum efeito sobre a actividade de ERK (Fig. 4 A). A seguir nós examinamos a localização intracelular de fosfo-ERK em células por imunofluorescência KLM1 e KLM1-R. Interessantemente, foi mostrado uma notável diferença na localização intracelular de p-ERK entre eles. De acordo com inanição de soro, p-ERK foi parcialmente translocado para o núcleo em células KLM1; Pelo contrário, ERK activada estava presente exclusivamente no citoplasma de células KLM1-R (Fig. 4 B). Estes resultados sugeriram que a privação de soro induzida por activação de ERK em ambos KLM1 e KLM1-R, mas resultou numa diferença na localização intracelular entre eles.

(A) células KLM1 e KLM1-R foram cultivadas em meio com ou sem FBS ou expostos a 10 ug /mL de GEM durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos contra o p-ERK e ERK. (B) e (C) As células indicadas foram coradas com anticorpos específicos contra o p-ERK, Hsp27 e LC3A /B, depois as células foram cultivadas em meio com ou sem FBS durante 24 h. DAPI: azul e p-ERK: vermelho (B) e LC3A /B: verde e Hsp27: vermelho (C). Barra de escala, 20 ^ m.

inanição Serum suprime a degradação PARP-1 induzida pelo GEM por inibir a autofagia através da via de sinalização ERK

A seguir, examinaram a atividade autofágica após a privação de soro em KLM1 e células KLM1-R em combinação com um inibidor extracelular (ERK) da cinase regulada por sinal (MEK), U0126, para avaliar os efeitos da via de MEK /ERK em autofagia. Foi demonstrado que a expressão de LC3 foi reduzida por privação de soro ao longo de um curso de tempo de 24 h em células KLM1 e KLM1-R (Fig. 5 A e B) e resgatado por U0126 em KLM1 (Fig. 5 A), mas muito menos KLM1-R (Fig. 5 B). A atividade da ERK ainda mostrou uma tendência crescente na KLM1-R quando tratados com U0126 (Fig. 5 B), indicando uma tolerância a U0126 em KLM1-R em comparação com células KLM1. Estes dados indicam que a inibição autofagia induzida por privação de soro foi mediada pela via de sinalização /ERK MEK. De acordo com inanição de soro, U0126 não teve efeito sobre a expressão de células B de leucemia /linfoma 2 (Bcl-2) em células KLM1 e KLM1-R e a redução do p21 foi retardado pelo tratamento com U0126 em KLM1 mas não em células KLM1-R ( Fig. S2 a e B), o que sugere que o inibidor de MEK teve eficácia diferente sobre a progressão do ciclo celular entre as células e KLM1 KLM1-R. Porque o inibidor de MEK diferente mostrou eficácia na modulação da autofagia entre as células e KLM1 KLM1-R sob a privação de soro, foi investigada a sua eficácia sobre a degradação de PARP-1 em resposta a jóia. Com efeito, a degradação de PARP-1 induzida por GEM foi inibida por privação de soro em ambas as células e KLM1 KLM1-R de um modo independente de caspases e inverteu-se apenas em células KLM1 por U0126 (Fig. 5 C e D). Além disso, o tratamento por U0126 sozinho não teve nenhuma influência sobre a PARP-1. Estes dados sugeriram que a privação de soro e suprime autofagia induzida GEM-PARP-1 degradação através da activação da via de sinalização de ERK, com células KLM1 e KLM1-R mostrando diferentes sensibilidades ao U0126 inibidor MEK.

(A) KLM1 e células KLM1-R foram expostos a 10 ug /mL de GEM na presença ou na ausência de 20 uM de U0126 para os cursos de tempo indicados. Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos contra o p-ERK e LC3A /B. (B) e células KLM1 e KLM1-R (C) foram cultivadas em meio com ou sem FBS e entretanto exposta a um ou ambos GEM e U0126 na concentração indicada. Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. A cabeça da seta indica a forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. As setas indicam a posição da área de caspase-3 clivada. A expressão de PARP-1 foi confirmada repetidamente por um PARP-1 anticorpo distinta descrito em Materiais.

hipóxia suprime a autofagia e induziu-GEM PARP-1 degradação

A hipóxia leva a célula parada do ciclo através da síntese de p21 diminuiu [29]. Nós confirmamos que a expressão da p21 foi regulada para baixo e Hsp27 foi regulada em 1% O

2 hipóxia por 24 horas em células KLM1 e KLM1-R; No entanto, a hipoxia não teve nenhuma influência sobre a expressão de fosfo-ERK e Bcl-2 (Fig. 6 A). Sob condição hipóxica, tanto a expressão AMPKα1 e Ulk1 foram regulados negativamente em células KLM1 e KLM1-R e a expressão de LC3 em KLM1 foi para o mesmo nível que em células KLM1-R não tratados (Fig. 6 A), indicando que a hipóxia induzida mudança fenotípica em KLM1 levando a uma condição KLM1-R-like e inibição da autofagia. Assim, nós testamos se hipóxia inibiu a degradação PARP-1 induzida pelo GEM. A análise por Western blot demonstrou que a induzida por GEM PARP-1 degradação foi notavelmente suprimidos por hipoxia de um modo independente de caspases em ambos KLM1 e células KLM1-R (Fig. 6 B). Estes resultados indicaram que a hipóxia suprime a degradação de PARP-1 induzida por GEM por redução da actividade de autophagic.

(A) células KLM1 e KLM1-R foram cultivadas em condições normais ou 1% O

2 hipoxia durante 24 horas e, em seguida os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. (B) As células indicadas foram cultivadas em condições normais ou 1% O

2 hipoxia em conjunto com 10 ug /mL de GEM durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram resolvidas por SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. Uma cabeça de seta indica a forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. As setas indicam a posição da área de caspase-3 clivada. A expressão de PARP-1 foi confirmada repetidamente por um PARP-1 anticorpo distinta descrito em Materiais.

Discussão

A autofagia pode ser elevada pelo GEM no tratamento de células PC [13 ]. células PC mostrou ser mais sensível ao efeito citotóxico de GEM quando esta foi combinada com canabinóides através de espécies reactivas de oxigénio (ROS) mediada pela morte celular autophagic [30]. Neste estudo, foi demonstrado que a actividade foi reduzida em autophagic GEM-resistente KLM1-R em comparação com as células sensíveis ao KLM1. Por isso, reactivação de autofagia pode ser uma estratégia útil para resensitising PC para GEM. No entanto pouco se sabe sobre o papel da autofagia em resposta a danos no DNA induzidos pelo GEM. Há evidências de que a autofagia importante está relacionado com o tratamento de quebras de cadeias duplas (DSB) e morte celular em resposta a danos no ADN em levedura através da degradação de proteínas de recombinação Sae2 acetilado (CTIP humano) [31]. Inibição /ablação de histona desacetilases (HDACs) induz autofagia e acetilação de uma série de proteínas de resposta a danos no ADN (DDR), incluindo Sea2 Exo1 e [31], [32]. Aqui nós mostramos que GEM induz uma resposta danos no DNA (observado através CTIP superexpressão por western blot) e mono-ADP ribosylated PARP-1 degradação levando ao aumento da autofagia. Assim autofagia envolvidos na reparação do DNA dano pode ser através do controlo de PARP-1, em vez de degradação CTIP (levedura Sae2) em PC humana. No entanto, se a ribosilação de ADP de mono-PARP-1 é necessário para a degradação autofagia e como esta degradação específico é executado em resposta a GEM deve ser esclarecida em mais estudos.

ablação de PARP-1 não interfere com LAP reparação, mas atrasos reativação de garfos de replicação paralisadas [33]. Portanto, a degradação induzida pelo GEM de PARP-1 pode contribuir para garfos de replicação parado-GEM. Factores de resposta ORL ATM, Mre11, Rad50 e são necessários para a sobrevivência das células após a forquilha de replicação enrolando em resposta a danos no ADN induzida por GEM [34]. Restart de garfos de replicação paralisadas e reparação de garfos de replicação em colapso exigem atividade RAD51 e via mediada-RAD51 recombinação homóloga (HR), respectivamente [35]. Além disso, demonstra-se que CTIP é sobre-expressa em resposta a GEM no KLM1 e células KLM1-R (Fig. 2-A). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a reparação LAP é necessária para a sobrevivência de células, bem como células PC, após danos no ADN induzida por GEM. CTIP mostrou ser regulada para cima em ambos KLM1 e KLM1-R induzida pelo MPG, mas a sua estabilidade parece mais forte em KLM1-R, em particular ao longo de um raiva concentração de 10-100 ug /mL GEM, que expressa um nível mais elevado de SIRT6 em comparação com células KLM1 (Fig. 2-a). SIRT6 promove a estabilidade do ADN e de activação e estabilização de CTIP por desacetilação [31], [35], indicando um possível mecanismo para a menor sensibilidade de KLM1-R para GEM em comparação com células KLM1. Além disso, estudos recentes sugerem que os inibidores de PARP são particularmente letal para as células deficientes em recombinação homóloga (HR) através de proteínas desregulação de extremidade não-homóloga propenso a erros juntar [36]. Da mesma forma, por conseguinte, a combinação de um tipo de inibidor de RH com MPG (tal como um supressor de PARP-1) pode ser uma estratégia terapêutica potencial para o PC. No entanto, não é uma limitação importante, porque privação de soro e hipoxia (mimetizando microambientes tumorais

in vivo

) inibir a degradação de PARP-1 induzida por GEM por redução da actividade de autophagic (Fig. 5 e 6). Assim, o candidato preferido para a terapia de combinação com a gema não só deve inibir os componentes de LAP mas também promover autofagia, por exemplo, um inibidor de histona-desacetilases, a saber, o ácido valpróico [37]. Mais estudos são necessários para testar se este inibidor poderia melhorar a morte celular PC em resposta a GEM.

O U0126 inibidor MEK mostra diferentes efeitos sobre o nível de autofagia e PARP-1 degradação em resposta a GEM entre KLM1 e KLM1 células -R, indicando que, possivelmente, existem limitações sobre a estratégia terapêutica para a segmentação do EGFR /Ras via /ERK no PC. Presume-se que as diferenças observadas dependem de uma das três possibilidades:. 1) as diferenças na localização intracelular de ERK activada entre KLM1 e células KLM1-R (figura 4 B); 2) um gabarito desconhecida via de sinalização para reactivação de ERK em resposta ao inibidor de MEK (Figura 5 B) [37], [38].; 3) soro induzida por infra-regulação da ULK1 em células KLM1-R levando a autofagia não controlada por ERK (Fig. S1 B).

Neste estudo, nós revelamos novos destaques que funciona GEM como um supressor de PARP-1, promovendo a via de degradação autofagia e apresentar as sugestões relacionadas sobre as características desejadas de possíveis candidatos para a terapia de combinação com GEM para PC.

Informações de Apoio

Figura S1. células

(A) e KLM1 KLM1-R foram lisadas e resolvidos em SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos. Actina foi utilizada para normalizar os níveis de carga de proteína. células (B) e KLM1 KLM1-R foram cultivadas em meio com ou sem FBS ou expostos a 10 ug /mL de GEM durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram resolvidas em SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109076.s001

(TIF)

Figura S2. células

KLM1 (A) e KLM1-R (B) foram expostos a 10 ug /mL de GEM no presente ou ausente, de 20 uM de U0126 para os cursos de tempo indicados. Os lisados ​​celulares foram resolvidas em SDS-PAGE e sondadas com anticorpos específicos contra a p21 e Bcl-2. As intensidades relativas dos western blot foram medidos e mostrado nesta figura

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109076.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Ikeda E. e D. Cui de nos deixar utilizar uma incubadora de hipóxia.