Abstract
Fundo
A desregulamentação dos
EGFR
sinalização é comum em cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e esta descoberta levou ao desenvolvimento de inibidores da tirosina quinase (TKI) que são altamente eficazes em um subconjunto de NSCLC. Mutações do
EGFR
(m
EGFR
) e copiar o número de ganhos (CNGs) de
EGFR
(g
EGFR
) e
HER2
(g
HER2
) foram relatados para prever a resposta TKI. Mutações no
KRAS
(m
KRAS
) estão associados com resistência primária à TKI.
Metodologia /principais conclusões
Foi investigada a relação entre mutações, CNGs e resposta ao TKI de um grande painel de linhas celulares de NSCLC. Genes estudadas foram
EGFR
,
HER2
,
HER3 HER4
,
KRAS
,
BRAF
e
PIK3CA
. As mutações foram detectados por sequenciação, enquanto CNGs foram determinadas por PCR quantitativa (qPCR), hibridação in situ fluorescente (FISH) e matriz de hibridação genómica comparativa (aCGH). Os valores de IC50 para a gefitinib TKI (Iressa) e erlotinib (Tarceva) foram determinados pelo ensaio de MTS. Para qualquer um dos sete genes testados, mutações (39/77, 50,6%), cópia ganhos numéricas (50/77, 64,9%) ou ambos (65/77, 84,4%) eram frequentes em linhas de NSCLC. Mutações do
EGFR
(13%) e
KRAS
(24,7%) eram frequentes, enquanto eles eram menos frequentes para os outros genes. As três técnicas para determinar GNC estavam bem correlacionados, e dados qPCR foram utilizados para outras análises. CNGs eram relativamente frequente para
EGFR
e
KRAS
em adenocarcinomas. Enquanto mutações foram em grande parte mutuamente exclusivos, CNGs não eram.
EGFR
e
KRAS
linhas mutantes demonstrado frequentemente mutante desequilíbrio específico alelo ou seja, a forma mutante era geralmente em grande excesso em comparação com a forma de tipo selvagem. Numa base molar, a sensibilidade a gefitinib e erlotinib foram altamente correlacionadas. Na análise multivariada, levou aos seguintes resultados:
1. m
EGFR Comprar e g
EGFR Comprar e g
HER2
foram fatores independentes relacionados com a sensibilidade gefitinib, em ordem decrescente de importância.
2. m
KRAS
foi associada ao aumento da resistência in vitro a gefitinib.
Conclusões /Significado
Nossa in vitro estudos confirmam e ampliam as observações clínicas e demonstrar a importância relativa dos dois
EGFR
mutações e CNGs e
HER2
CNGs na sensibilidade à TKI
Citation:. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, Soh J, Shigematsu H, Zhang W, et al. (2009) alterações em genes do EGFR via de sinalização e sua relação com tirosina-cinase EGFR Inhibitor Sensibilidade em linhas celulares de cancro do pulmão. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10.1371 /journal.pone.0004576
editor: Alfred Lewin, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 16 de setembro de 2008; Aceite: 18 de dezembro de 2008; Publicação: 24 de fevereiro de 2009
Direitos de autor: © 2009 Gandhi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi recebidas do Programa especializada de Investigação de Excelência em Câncer de pulmão (P50CA70907) e Detecção precoce Research Network, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Fundos de ambos os subsídios foram utilizados para apoio salarial e para o desempenho de ensaios. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Dr. Gazdar é um consultor pago /professor para AstraZeneca PLC. Dr. Garcia recieves Research Funding 10.000 da AstraZeneca, Genentech e OSI; Honorarium 10.000 da Roche. Dr. Minna recebe apoio para pesquisa da AstraZeneca PLC.
Introdução
O cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1]. Apesar dos recentes avanços no diagnóstico e multimodalidade terapias para o câncer pulmonar, o prognóstico permanece pobre, com taxas de sobrevida em 5 anos de apenas 16% para todas as etapas [2].
O cancro do pulmão é caracterizada pelo acúmulo de múltipla alterações genéticas e epigenética incluindo mutações somáticas e o número de cópias do gene ganhos ou de ambos, que resulta na activação de oncogenes ou inactivação de genes supressores de tumor [3]. receptor do factor de crescimento epidérmico (
EGFR) desregulação tem sido observado em vários tipos de tumores, incluindo cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLCs) [4]. Hirsch et. ai. identificada frequente
EGFR
proteína sobre-expressão (62%) no CPNPC de subtipos de células escamosas e adenocarcinoma [5].
EGFR
sobre a expressão é frequentemente associada com prognóstico adverso [6]. O receptor tirosina-quinase (RTK) de super-família de receptores de superfície celular serve como mediadores da sinalização celular por factores de crescimento extra-celulares. Os membros da família ERBB de RTK incluindo
EGFR (HER1 /ErbB1)
,
HER2 (ERBB2 /EGFR2)
,
HER3 (ErbB3 /EGFR3) Comprar e
HER4 (ErbB4 /EGFR4)
têm recebido muita atenção dada a sua forte associação com a proliferação maligna.
O RAS /MAPK e PI3K /AKT são as principais redes de sinalização entre
EGFR
ativação para proliferação e sobrevivência celular [7]. Como discutido abaixo,
EGFR
genes de vias de sinalização têm sido relatados para ser mutado em NSCLC. Dependendo da localização geográfica,
EGFR
e
KRAS
mutações foram identificadas em ~ 10% -30% dos CPNPC [3], [8].
EGFR
mutações estão independentemente associadas com a histologia de adenocarcinoma, Etnia asiática, status e sexo feminino nunca ter fumado. Mutações do
KRAS
também alvo adenocarcinoma histologia, mas por outro lado diferem de
EGFR
mutações, porque eles são relativamente raros em asiáticos e ocorrem com mais frequência em homens e fumantes [9]. Menos comumente, mutações somáticas também foram encontrados em outro
genes EGFR
da via, incluindo
HER2
(~ 2%) [10],
HER4
(~ 2%) [ ,,,0],11],
BRAF
(~ 2%) [12], e
PIK3CA
(~ 4%) [13], [14].
Número de ganhos de cópias do gene (CNGs) devido à amplificação focal ou polissomia cromossómica, é um dos outros mecanismos principais de activação do oncogene [15]. Lockwood et ai. múltiplos componentes identificados da
EGFR
sinalização da via eram frequentemente amplificados e sobre-expresso em NSCLC. Curiosamente, eles também descobriram que
EGFR
gene da via amplificação foi mais frequente no subtipo adenocarcinoma do NSCLC.
Por causa da desregulamentação frequente de
EGFR
genes da via em NSCLC, EGFR tornou-se uma das primeiras moléculas racionalmente selecionados para terapia-alvo. inibidores Enquanto que as abordagens orientadas iniciais utilizados anticorpos monoclonais que bloqueiam a interacção ligando-receptor, as abordagens mais recentes têm utilizado reversíveis pequenas moléculas de tirosina-cinase (TKI). A actividade de tirosina-quinase de
EGFR
é necessário para as respostas bioquímicas induzidas por este receptor [7], [16], [17]. Dois TKI, gefitinib (Iressa, AstraZeneca) e erlotinib (Tarceva, Genentech) têm sido amplamente utilizados no tratamento de NSCLC avançado ou recorrente. As respostas foram observadas em subconjuntos, etnia asiática nomeadamente Oriente, sexo feminino, nunca ter fumado status e adenocarcinoma histologia [18], [19], [20]. Subsequentemente,
EGFR
mutações foram identificadas no domínio tirosina-quinase, e previsto para a resposta ao inibidor da tirosina quinase do mesmo subconjunto de pacientes [21], [22], [23]. De acordo com uma meta-análise de 1170 pacientes, mais de 70% dos CPNPC com
EGFR
mutações respondeu a TKI, ao passo que 10% dos tumores sem
EGFR
mutação respondeu [24]. No entanto, outros estudos indicaram que não sejam fatores
EGFR
mutações podem desempenhar um papel na determinação da resposta e sobrevivência após a terapia de TKI.
EGFR
ganho de número de cópias do gene foi associado com melhorou significativamente a sensibilidade TKI e sobrevivência em um grande estudo não selecionada com controles adequados [25]. Além disso, outros membros da
EGFR
família isto é,
HER2
[26] e
EGFR3
[27] podem ser fatores importantes envolvidos na sensibilidade TKI. A maior complexidade é a observação clínica de que mutações somáticas de
KRAS
conferir resistência intrínseca ao TKI [28].
Para entender melhor a relação entre a sensibilidade TKI e desregulamentação do
EGFR
genes da via, examinamos a mutação e copiar status de número de sete desses genes (
EGFR
,
HER2
,
HER3
,
HER4
,
KRAS
,
BRAF
, e
PIK3CA
) em um grande painel de linhas celulares de cancro do pulmão e correlacionados os dados com sensibilidade in vitro para TKI.
Materiais e Métodos
linhas de tumor de células
Foram estudados um total de 112 linhas de células que consistem em 77 NSCLC e 32 do cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) e três linhas de cânceres de células pequenas em locais extrapulmonares (cancros extrapulmonar pequenas células, ExPuSC) [29]. Todas, excepto três destas linhas celulares foram estabelecidos pelos autores [30] num dos dois locais. As linhas celulares iniciadas no NCI têm o prefixo NCI-H enquanto as linhas estabelecidas na UT Southwestern têm o HCC prefixo. NCI-H3255 foi obtido de Dr. Bruce Johnson (Centro de Lowe para Thoracic Oncology, Instituto de Câncer Dana-Farber, Boston, MA) [22]. PC-9 (originalmente a partir da Universidade de Medicina de Tóquio, Tóquio, Japão) foi obtido do Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Calu-3 foi adquirido a American Type Culture Center (Manassas, VA). Também investigamos oito linhas imortalizadas humanas epiteliais brônquicas celulares (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT e HBEC34KT), que foram iniciadas por nós [31].
Na maioria das células tumorais as linhas foram mantidas em RPMI1640 suplementado com soro de 5-10% de bovino fetal (FBS). Algumas linhas de células foram cultivadas em ACL4 (para linhas de NSCLC) e HITES (por linhas SCLC) suplementado com 5% de FBS. Todas as linhas celulares foram mantidas em HBEC de queratinócitos-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) com extracto de pituitária de bovino (BPE) e factor de crescimento epidérmico recombinante (EGF) [31]. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO
2.
Obteve-se a impressão digital genética de cada linha celular (sistema PowerPlex 1,2, Promega, Madison, WI) e cada a linha de células apresentou um perfil genético único, que era idêntica aos perfis obtidos a partir da American Type Culture Collection.
DNA e RNA de extracção
o ADN genómico foi obtido a partir de sedimentos de linhas celulares de fenol-clorofórmio padrão (01:01) a extracção seguida por precipitação com etanol [32] ou usando DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). O ARN total foi obtido a partir de linhas celulares utilizando RNeasy Mini Kit Além disso (QIAGEN). cDNA foi preparado como descrito anteriormente [14].
Gene Sequencing
sequenciamento de DNA e análise mutacional para
EGFR
(exons 18-21),
HER2
(exons 19 e 20),
KRAS
(códons 12, 13 e 61),
BRAF
(exons 11 e 15) e
PIK3CA
(exons 9 e 20) foram realizadas como relatado por nós anteriormente [10], [14], [32].
HER3
exões (18-21) e
HER4
(exons18-23) estado de mutação foram analisadas por amplificação por PCR de ADN genómico ou de cDNA e sequenciação directa dos produtos de PCR [10]. As mutações nestes genes foram determinadas utilizando os iniciadores de PCR listados (Tabela S6). Todos os PCRs foram efectuados em volumes de 25 l contendo 100 ng de ADN utilizando ADN-polimerase HotStarTaq (Qiagen Inc., Valencia, CA). O DNA foi amplificado durante 32 ciclos a 34 a 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C a 68 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos, seguido por extensão de 7 minutos a 72 ° C. Todos os produtos de PCR foram incubadas utilizando exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ) e sequenciadas directamente utilizando Applied Biosystems PRISM Dye Terminator método de sequenciação cíclica (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Todas as mutações foram confirmadas por sequenciação independente em ambas as direções.
cópia de avaliação número
número de cópias ganhos pode ser avaliada por uma série de metodologias. Para amostras clínicas, hibridação in situ fluorescente (FISH) é frequentemente utilizado, uma vez que pode discriminar entre as células não malignas do tumor e. Estudos laboratoriais de linhas de células tumorais (que estão isentas de células não-malignas) utilizam frequentemente PCR quantitativa (qPCR). Um método alternativo é matriz de hibridização genômica comparativa (aCGH). Porque as comparações diretas desses métodos raramente têm sido relatados [33], utilizamos todos os três métodos.
em tempo real qPCR
número de cópias do gene foram determinados utilizando PCR em tempo real quantitativa empregando o Chromo4 PCR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para determinar o número de cópias de um gene alvo, utilizou-se os genes de controlo localizados no mesmo cromossoma, como o gene-alvo (Tabela S6). As proporções resultantes foram comparadas com as taxas similares de células diplóides (os valores médios das oito linhas celulares HBEC. Metodologia TaqMan foi utilizado excepto para
PIK3CA
[14]. Os iniciadores e as sondas foram escolhidos por TaqMan Primer Express ™ 1,5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). Os iniciadores foram adquiridos a Invitrogen e sondas de Biosearch Technologies (Novato, CA). As sequências dos iniciadores e sondas estão apresentados na Tabela S6. As curvas padrão foram construídas com diluições em série de produtos de PCR específicos. misturas de amplificação (25 ul) continha a amostra de ADN (20 ng), 10 × tampão TaqMan (2,5 uL), 200 uM de dNTP, 1,25 U HotStar Taq ADN ™ polimerase, 200 nM de cada iniciador e 100 sonda nM. as condições dos ciclos térmicos constituídos 5 min a 95 ° C e 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 30 s. Todas as amostras foram analisadas em triplicado. o parâmetro C
t é definido como o número do ciclo fraccionai a que a fluorescência gerado por clivagem da sonda passa um limiar fixo acima da linha de base. O número de cópias do gene alvo em amostras desconhecidas é quantificada através da medição C
sub valores de t e usando uma curva padrão para determinar o número de cópias [34]. o número de cópias do gene foi calculada usando a seguinte equação: g = (S
T /S
C) /(N
N /T
C).
PIK3CA
número de cópias foi avaliada como descrito por nós anteriormente [14].
caminho Tiling aCGH
aCGH foi realizada como descrito anteriormente [14], [15]. desequilíbrios genômicos foram identificados utilizando aCGH-Smooth [35], como descrito anteriormente [36].
ensaios FISH
ensaios FISH Dual-cor foram realizadas de acordo com um protocolo padrão [37], [38 ]. Os conjuntos de sondas, EGFR /CEP7 e PathVysion e o CEP7 controlos foram obtidos a partir de Abbott Molecular (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 foi obtido a partir de Qbiogene; sonda BRAF foi gerado a partir do clone bacteriano clone artificial (BAC) usado para aCGH. Os números de cópias dos genes-alvo (marcadas em fluoróforos vermelhos) e as sondas CEP (rotulados em Spectrum Verde) foram verificados em pelo menos 100 células em interfase e 20 esfregaços de metáfase. As imagens foram capturadas e fundiu-se com a estação de trabalho Cytovision (Imagiologia Aplicada, San Jose, CA).
-Sub clonagem
O DNA genômico foi isolado do mutante
EGFR
ou
KRAS
linhas e células NSCLC usado como um modelo para a amplificação PCR de
EGFR
ou
KRAS
. Os iniciadores e as condições de reacções de PCR foram como descrito anteriormente. Os produtos de PCR foram clonados no vector pCR2.1-TOPO utilizando o estojo de clonagem TOPO TA (Invitrogen). Cerca de 20 clones (range15-25) foram selecionados para a sequenciação usando M13 iniciador directo ou correspondente
EGFR
ou
KRAS
primers. Os resultados são expressos como as percentagens dos alelos mutantes presentes no número total clonado.
TKI sensibilidade
O ensaio colorimétrico MTS (Promega) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Este ensaio baseia-se na conversão de MTS em formazan solúvel por enzimas desidrogenase endógenas encontradas em células metabolicamente activas. As células foram plaqueadas a 1 x 10
3-4 × 10
3 células /cavidade em cultura de tecidos tratados placas de 96 poços. No dia seguinte, TKI (gefitinib ou erlotinib) foi adicionado a cada placa numa série de diluições ao longo da placa de tal modo que oito diferentes concentrações do fármaco testado foram. No dia 5, foram adicionados 20 ul de MTS, seguido por uma incubação de 1 hora a 37 ° C e, em seguida, a absorvância foi lida a 490 nm num leitor de placas.
96 poços de placas de dados foram importados para uma Banco de dados in-house in vitro de drogas sensibilidade Assays (DIVISA por Luc Girard, manuscrito em preparação), onde IC 50 são calculados, bem como várias análises estatísticas. Para calcular os valores de IC50, os dados foram subtraídos-fundo (colunas 1 e 12 normalmente contido mídia com nenhuma célula ou drogas e serviu como valores de fundo), e equipado com o modelo RDC (R pacote RDC por Christian Ritz e Jens Streibig, https://www.bioassay.dk) para gerar uma curva sigmoidal a partir da qual foi determinada a concentração que inibe 50% das células (IC50).
Análises estatísticas
de Fisher bicaudal testes exactas foram determinadas usando o software Prism 4 (Graph Pad, San Diego, CA). valores P 0,05 foram considerados significativos. Outras análises estatísticas são discutidos nas categorias apropriadas na seção Resultados.
Resultados
Mutations (M) e CNGs (g) em linhas celulares de cancro de pulmão
Nós examinados 32 SCLC e três linhas de pequenos cânceres de células de sítios extrapulmonares (pequenos cânceres de células extrapulmonar, ExPuSC), para mutações somáticas e CNGs de
genes da via EGFR
. Encontramos um total de apenas três mutações em 35 linhas de células e todos os três foram
PIK3CA
mutações (Tabela S1). CNGs para
genes da via EGFR
foram raramente encontrados em SCLC (Tabela S2). Desde mutações somáticas e CNGs para
genes da via EGFR
eram raros no CPPC, limitamos nossos novos estudos para NSCLC.
Para qualquer um dos sete genes testados, mutações (39/77, 50,6% ), cópia ganhos numéricas (50/77, 64,9%) ou ambos (65/77, 84,4%) eram frequentes em linhas de NSCLC. Estes resultados são discutidos em maiores detalhes abaixo.
Mutations (m) de
genes EGFR
via em NSCLC
Foram examinadas as linhas de NSCLC, por mutações somáticas de
EGFR genes
pathway conforme listado na secção de Métodos. Encontramos um total de 40 mutações em linhagens de células 39 (50,6%) (Figura 1-A, Tabela S3). Estas mutações consistiu de 19
KRAS
(24,7%), 10
EGFR
(13%), cinco
BRAF
(6,5%), quatro
PIK3CA
(5,2%), um
HER2
(1,3%), um
HER4
(2,2%) e nenhum para
HER3
. m
EGFR
, m
BRAF Comprar e m
HER2
estavam presentes exclusivamente em adenocarcinomas, enquanto m
KRAS
foram mais freqüentes em adenocarcinoma e grandes histologia de células. m
PIK3CA
foram as únicas mutações que não têm como alvo a histologia de adenocarcinoma (Fig. 1c).
Figura 1-A. mostra a frequência de mutações e copiar ganhos número de
genes EGFR
via (
EGFR
,
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
,
HER2
,
HER3
e
HER4
). Quarenta mutações foram identificadas em 39 linhas de células. Mutações e copiar o número de ganhos foram mais frequentes para
EGFR
(13%, 40,3%) e
KRAS
(24,7%, 14,3%) do que outro gene. CNGs para
HER2
(18,2%) também eram comuns. Identificamos apenas um
HER2
e um
HER4
mutação somática. Os números acima das colunas indicam o número de linhas de células com mutações (colunas azul) ou ganhos no número de cópias (colunas vermelhas). 1b fig. A figura mostra o número de genes que demonstrem CNGs em linhas de células mutantes e de tipo selvagem. Das 77 linhas celulares examinadas, 39 (50,6%) tinham uma mutação em pelo menos um dos sete genes da via EGFR examinados. CNGs foram freqüentes em ambas as linhas de células mutantes e de tipo selvagem. 1c fig. mostra a frequência de mutações sobre a base do NSCLC subtipo. Mutações do
EGFR
e
BRAF
foram encontrados exclusivamente no subtipo adenocarcinoma. O único
HER2 foi
mutação em um adenocarcinoma em comparação com o
HER4
mutação somática, que foi identificado em uma mistura a cerca de células escamosas 1d fig. mostra frequência de ganhos no número de cópias (CNGs) (G 4 por qPCR), com base em NSCLC subtipo. CNGs para
BRAF
e
PIK3CA
foram vistos predominantemente no adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular, respectivamente. CNGs para o resto dos genes não favoreceu qualquer subtipo.
As mutações são
mutuamente exclusivas
Foram examinados por qualquer associação entre mutações somáticas em linhas de células individuais. A fim de testar a hipótese de que o
mutações do gene de EGFR
via são mutuamente exclusivos, utilizou-se simulações de Monte Carlo para calcular o valor de p empírica. A hipótese nula é que as mutações irão ocorrer de forma independente. Simulamos a distribuição conjunta de eventos de mutação entre estes sete genes utilizando as taxas de mutação marginais observadas e no pressuposto independente. Em cada simulação, observou-se o número de linhas de células com múltiplas mutações. Repetimos o simulações 10.000 vezes e obtida a distribuição empírica de o número de linhas de células com múltiplas mutações; em seguida, comparamos o número observado de linhas celulares com múltiplas mutações com este distribuição empírica para calcular o valor-p
Para este estudo, o valor-p unilateral é 0,0014.; portanto, rejeitou a hipótese nula e concluiu que mutações genéticas são mutuamente eventos exclusivos para estes genes em linhagens de células NSCLC, com uma excepção (Tabela 1). Grande linha de carcinoma de células NCI-H460 tinha tanto
KRAS Comprar e
PIK3CA
mutações.
Comparação de métodos para a determinação do número de cópia ganhos
aCGH , FISH e qPCR foram usadas para testar os números de cópias do gene para linhas celulares de NSCLC. Não há valor limite biológico claro para definir os números de cópias anormais para linhas de células humanas de NSCLC; foram selecionados os limiares que permitam obter o melhor acordo categoria positivo ou negativo entre os três testes. Especificamente, calculado estatística Kappa [39] entre os testes aCGH e qPCR mais de duas grades de corte dimensional como 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5; e, em seguida, fez o mesmo para os peixes e qPCR. Os valores de corte que alcançaram o melhor acordo entre os três testes foram os seguintes: 4 para qPCR, 3 para CGH e 4,5 por FISH; e usamos esses valores para definir a presença de ganhos no número de cópias em linhas celulares de NSCLC. Usando esses valores de corte e todos os dados disponíveis, houve concordância altamente significativa (p 0,001) entre os três métodos, como mostrado na Tabela 2.
gene EGFR
via CNGs
Como os dados qPCR foram completo para todas as linhas (enquanto subconjuntos foram testados pelos outros dois métodos que são mais trabalhoso e caro), foram utilizados dados qPCR para todas as análises posteriores. número de cópias ganhos eram frequentes ( 10%) para a
EGFR
,
HER2
,
HER3
e
KRAS
(Fig 1a, Tabela S4) . Em ganhos específicos para
EGFR
eram mais do que duas vezes mais frequente (40%) do que para qualquer outro gene. Em geral, com as exceções de g
BRAF
(limitado a histologia de adenocarcinoma), e g
PIK3CA
(em grande parte limitado a histologia de células escamosas), CNGs não mostrou qualquer tendência aparente histologia subtipo ( Fig. 1c).
Relação entre mutações e número do exemplar ganhos
Ao contrário de mutações, copiar o número de ganhos não eram mutuamente exclusivas, quer com outros CNGs ou com mutações (Fig. 2). Encontrámos CNGs para dois ou mais genes em 32,5% (25/77) de linhas de células (Tabela S4). No entanto, observamos uma associação significativa entre mutações de
EGFR
ou
KRAS Comprar e CNGs de seus respectivos genes (Fig 3a, 3b).
Figura 2a. mostra que copiam ganhos de número e mutações não são mutuamente exclusivas. Como é evidente a partir da figura CNGs para
EGFR
e
KRAS Quais são significativamente mais frequente em
EGFR
e
KRAS
linhas de células mutantes respectivamente (p 0,05 ). Houve apenas um
HER2
e
HER4
linha e células NSCLC mutante, portanto, eles não foram incluídos nesta figura. 2b a fig. mostra que o número de cópias ganhos não são mutuamente exclusivas e ganhos de um gene pode ocorrer na presença de ganhos para outros genes.
EGFR Comprar e
KRAS
genes preferencialmente tem ganhos no número de cópias (CNG) em linhas de células que abrigam os respectivos mutações (painéis a e b). Em linhas mutantes, o alelo mutante quase sempre é superior em comparação com o alelo selvagem (painéis c e d), um fenômeno que chamamos MASI. Na maioria dos casos MASI o alelo mutante demonstra CNGs; No entanto MASI podem também estar presentes em linhas de células possuindo um número diplóide cópia do oncogene, (adquirido dissomia uniparental) seja uniforme (NCI-H460) ou heterogéneos (NCI-H1975).
alelo mutante específico desequilíbrio (MASI) para
EGFR
e
KRAS
genes
Como observado acima CNGs de
EGFR
e
KRAS
foram mais frequentes em células abrigando linhas essas mutações. Empregando o método de sub-clonagem descrito anteriormente, nós investigamos se o
EGFR
e
KRAS
genes demonstrou preferencialmente CNGs específicos de alelos mutantes em linhas de células que abrigam as respectivas mutações (Fig. 3). Os dados, para testar se os alelos mutantes são amplificados em linhas de células mutantes de genes estão agrupados os dados com resultado binário. Cada linha de células é um aglomerado e a hipótese nula é de que a taxa de mutação é de 0,5. Porque o número de subclones de cada linha de células variou, foi utilizada a abordagem de análise para o resultado binário agrupado com vários tamanhos de fragmentação [40]. Em linhas mutantes, o alelo mutante foi quase sempre em excesso em comparação com o alelo de tipo selvagem, um fenómeno que chamamos MASI. O p-valor para
EGFR
linhas de células mutantes foi 0,019 e para
KRAS
linha de células mutante foi de 0,0003, indicando que os alelos mutantes eram preferencialmente dominante em ambos os casos. A maioria dos casos MASI eram devido ao aumento do número de cópias do alelo mutante. No entanto, em uma minoria de casos MASI também foi observado em células com números de cópias diplóides diplóides ou próximo (adquirida dissomia uniparental). Assim, usamos o termo MASI em oposição a mutante ganhos específicos de alelos.
Características de
EGFR
linhas de células mutantes
Os dados clínico-patológicas e moleculares da célula 10 NSCLC linhas que abrigam
EGFR
mutações encontram-se resumidos na Tabela 3. Todos continha uma das duas principais mutações no domínio de cinase, ou deleções do exão 19 (n = 7) ou mutação L858R no exão 21 (n = 3 ). As mutações foram vistos exclusivamente no adenocarcinoma e nunca fumaram ou doentes com exposição ao tabaco baixa (≤ 10 anos-maço). Um
EGFR
linha de células mutante foi desenvolvido no Japão e os nove restantes foram desenvolvidos na América do Norte. Dos nove desenvolvido na América do Norte, apenas um era de um indivíduo de etnia asiática. Além disso, identificou-se que
EGFR
mutações foram mais comuns no grupo de idade comparativamente mais jovem ( 55 anos).
Sete destas linhas celulares foram sensíveis a gefitinib. As três linhas resistentes apresentaram uma segunda mutação: ou a mutação de resistência associada T790M no exão 20 (N = 2) ou uma deleção homozigótica do
PTEN
gene e a sua ausência de proteína [41] (observações não publicadas dos autores ).
efeitos de mutações e copiar ganhos número da sensibilidade para TKI
para avaliar o efeito de mutações e copiar ganhos número da sensibilidade para TKI, foram analisados os valores de IC50 de 45 linhas de células NSCLC . Porque TKI sensibilidade clínica preferencialmente alvos adenocarcinoma histologia, que incluiu 31 adenocarcinomas. Todo o subconjunto incluído todo o
EGFR
,
HER2
e
HER4
linhas e células mutantes 12
KRAS Comprar e 3
BRAF
linhas celulares. Porque
PIK3CA
mutações favoreceu histologia não-adenocarcinoma apenas um
PIK3CA
linha de células mutante foi incluído. De todo o subconjunto 17 linhas eram do tipo selvagem para todos os genes testados (Tabela S5)
Encontramos uma excelente concordância entre os valores de IC50 entre gefitinib e erlotinib. (P 0,0001) (Figura 4, Tabela S7). Porque os nossos definidos para a sensibilidade gefitinib dados era mais extensa, eleito para utilizar os dados gefitinib para análises posteriores
Quarenta e cinco linhas de células foram testadas para sensibilidade a ambas as drogas ea concordância foi excelente (p 0,0001)..
Fig. 5 ilustra os padrões de sensibilidade das linhas de células testadas. A concentração in vitro de 1 uM utilizados em cultura de tecidos se correlaciona com a concentração plasmática de gefitinib em doentes tratados com a dose padrão de gefitinib isto é 250 mg por dia. Este limiar foi usado por investigadores no passado para distinguir sensível a partir de linhas de células insensíveis e /ou resistentes a [7]. Com base no limiar acima mencionado e a forma da curva, dividimos nossas linhas celulares em 3 categorias: Sensível (≤1 uM), intermediário ( 1 uM, mas ≤10 uM) e resistentes ( 10 uM ) como pode ser visto na Figura a Fig. 5. Os valores de IC 50 seguem uma linha que demonstrou um ponto de mudança de inclinação de aproximadamente 10 uM, e, assim, demonstrou uma distribuição bimodal aparentemente (Fig. 5). Como as linhas de células com valores abaixo de 1 uM foram considerados sensíveis, nos valores classificados arbitrariamente entre 1 e 10