Abstract

Fundo

fatores de transcrição ETS regulam vias de sinalização importantes envolvidos na diferenciação celular e desenvolvimento em muitos tecidos e surgiram como intervenientes importantes no câncer de próstata. No entanto, o impacto biológico de fatores ETS na tumorigênese de próstata ainda é debatido.

Metodologia /Principais Achados

Foi realizada uma análise da família de genes ETS usando dados de microarrays e PCR em tempo real em condições normais e tecidos tumorais, juntamente com estudos funcionais em linhas normais e células de câncer para entender o impacto na tumorigênese de próstata e identificar alvos principais destes fatores de transcrição. Encontramos desregulação freqüente de genes ETS com oncogênicos (ou seja, ERG e ESE1) e supressor de tumor (isto é, ESE3) propriedades em tumores de próstata em comparação com próstata normal. subgrupos de tumores (isto é, ERG

Alta, ESE1

Alta, ESE3

baixas e NoETS tumores) foram identificados com base em seu status expressão ETS e mostrou transcrição distinta e características biológicas. ERG

altos e ESE3

tumores de baixo tinha as assinaturas genéticas mais robustos com ambas as características distintas e sobrepostas. A integração de dados do genoma com estudos funcionais em várias linhas de células, demonstrou-se que ERG e ESE3 controlada em sentido oposto da transcrição da proteína Grupo Polycomb EZH2, um gene essencial no desenvolvimento, diferenciação, biologia das células estaminais e a tumorigénese. Demonstramos ainda que a NKX3.1 gene supressor de tumor prostático específico foi controlado pelo ERG e ESE3 tanto directamente como através de indução de EZH2.

Conclusões /Significado

Estes resultados fornecem novos insights sobre a papel da rede de transcrição ETS na tumorigênese de próstata e detectar as ligações não reconhecidas anteriormente entre a expressão aberrante de fatores ETS, a desregulamentação de efetores epigenéticos e silenciamento de genes supressores de tumor. A ligação entre a atividade ETS aberrante e silenciamento do gene epigenético pode ser relevante para o manejo clínico de câncer de próstata e desenho de novas estratégias terapêuticas

Citation:. Kunderfranco P, Mello-Grand M, Cangemi R, S Pellini, Mensah Um, Albertini V, et al. (2010) Transcrição ETS fatores de controle da transcrição de EZH2 e epigenética silenciamento do supressor de tumor Gene NKX3.1 no câncer de próstata. PLoS ONE 5 (5): e10547. doi: 10.1371 /journal.pone.0010547

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de novembro de 2009; Aceite: 12 de abril de 2010; Publicado em: 10 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kunderfranco et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de Oncosuisse (OCS-01913-08), Swiss National Science Foundation (FNS-31003A-118113) Fundação e Ticino para Cancer Research para GMC. MGM e CG foram apoiados pela Compagnia di San Paolo, Torino, Itália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro da próstata é o cancro mais comum e uma das principais causas de morte por câncer nos países ocidentais [1]. O câncer de próstata tem um comportamento clínico altamente heterogênea e pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que contribuem para essa heterogeneidade [1]. Recentemente, fatores ETS transcrição surgiram como elementos importantes na tumorigênese prostática devido à constatação de translocações recorrentes envolvendo genes ETS, o mais freqüente sendo a fusão TMPRSS2: gene erga levando à sobre-expressão de comprimento total ERG [2], [3] , [4]. No entanto, o impacto biológico de genes ETS translocados ainda é debatido. Relatos recentes sugerem que ERG sobre-expressão não é suficiente para induzir a transformação neoplásica e cooperação com outras vias oncogénicos, tais como perda de PTEN e PI3K /AKT desregulação, é necessário [5], [6], [7], [8], [9]. A família ETS humano inclui 27 membros que partilham um domínio de ligação ao ADN altamente conservado e são pontos nodais de várias vias de sinalização que controlam a proliferação celular, diferenciação e sobrevivência [10]. Embora exista um grande potencial de sobreposição, os fatores ETS individuais têm características distintas que se manifestam através da regulação positiva e negativa de diferentes subconjuntos de genes e processos biológicos [10]. Além disso, em muitos ETS tecidos fatores constituem redes reguladoras complexas com respostas celulares específicas, dependendo do equilíbrio entre os factores com funções semelhantes ou opostas [10]. A maioria dos factores de ETS, como aqueles translocado no cancro da próstata, promover a proliferação celular, sobrevivência e de transformação, enquanto outros funcionam como supressores de tumores [10]. Recentemente, descobriu-se que o fator ETS específico-epiteliais ESE3 era frequentemente regulada no cancro da próstata, proliferação de células afetadas negativamente e sobrevivência, e agiu como supressor de tumor em células epiteliais da próstata [11]. Assim, para entender o impacto global da desregulamentação gene ETS na tumorigênese e identificar alvos principais de fatores ETS desregulados, seria importante considerar todo o conjunto de genes ETS expressos em um dado tecido.

Neste estudo, através de uma análise abrangente da família de genes ETS em tecidos normais e tumorais da próstata, foram identificados subgrupos de tumores com padrões de expressão ETS distintas. Além alvos ETS já conhecidos, descobrimos genes previamente desconhecidos e caminhos ligados à actividade ETS aberrante. Ao integrar dados genômicos com estudos funcionais, estabelecemos que a proteína Polycomb Group (PCG) EZH2 é um alvo direto do ERG e ESE3, e um jogador chave no silenciamento transcricional da NKX3.1 gene supressor de tumor prostático específico. Tomados em conjunto, os nossos dados revelam alterações mais frequentes e mais complexas de genes ETS do que anteriormente reconhecidas e identificar genes importantes, como EZH2 e NKX3.1 contribuindo para a reprogramação de transcriptoma de células epiteliais da próstata em resposta a expressão aberrante de fatores supressor ETS oncogênicos e tumorais. Esses achados podem ser relevantes para o manejo clínico de câncer de próstata e concepção de novas estratégias terapêuticas.

Resultados

Gene ETS padrões de expressão Definir Prostate Cancer Subgrupos

Para obter uma abrangente vista da rede ETS transcricional no cancro da próstata, que examinaram a expressão da família de genes ETS em conjuntos de dados de microarray de cancro da próstata primário (

n = 59

) e na próstata normal (

n = 14

) amostras clínicas. Análise de dados de microarray mostraram que vários genes ETS foram diferencialmente expressos em amostras de tumor da próstata em comparação com o normal. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) foi utilizada para confirmar a expressão diferencial dos factores ETS mais frequentemente alterados (Fig. S1). Os genes ETS mais significativamente afetados foram ERG, ESE3 e específico do epitélio factor-1 ETS (ESE1 /ELF3 /ESX). Nós já mostrou que ESE3, que se expressa em células normais da próstata epiteliais, proliferação afetou negativamente e sobrevivência de células cancerosas da próstata e propôs que ele agiu como um supressor de tumor [11]. ESE1, que está intimamente relacionado com ESE3, é expressa em células epiteliais normais de vários órgãos, incluindo próstata, da mama e do pulmão e é conhecido por actuar como um oncogene, quando sobre-expressa em células epiteliais da mama [12], [13]. No entanto, a sobre-regulação de ESE1 em tumores da próstata ainda não foi relatada antes. No geral, a expressão desregulada de genes ETS foi muito frequente em tumores da próstata. Na verdade, a maioria dos tumores tinham pelo menos um gene ETS cima ou down-regulada em comparação com próstata normal e muitas vezes múltiplas ETS foram simultaneamente afetadas.

Nosso objetivo foi compreender como estas alterações ETS individuais e compostas poderia afetar a biologia de cancro da próstata. Usando dados QRT-PCR na expressão do gene ETS e dados genômicos avaliamos se os perfis de transcrição específicos foram associados com os padrões de expressão ETS distintas. Usamos vários critérios para minimizar os potenciais efeitos de confusão da presença de múltiplos fatores de ETS. Primeiro, os dados QRT-PCR foram usados ​​para classificar com precisão os tumores de acordo com o seu estado ETS expressão do gene. Em seguida, somente os tumores com expressão muito elevado ou muito baixo de um determinado ETS (isto é, ≥4 vezes mais elevada ou mais baixa do que o valor médio em próstata normal) foram atribuídos a um grupo e incluídos na análise. Utilizando estes critérios, aproximadamente, 80% dos cancros da próstata altamente tinha expressão desregulada de pelo menos um gene ETS predominante. Nesta base, foram identificados três grandes subgrupos de tumores caracterizados pela desregulação predominante de um fator ETS: i) tumores com alta expressão de ERG (ERG

alta,

n = 14

), ii) tumores com alta ESE-1 expressão (ESE1

alta,

n = 12

) e iii) tumores com baixa expressão ESE3 (ESE3

baixa,

n = 13

). Um quarto grupo (NoETS,

n = 14

) incluiu tumores que tinham níveis normais semelhantes de todos gene ETS (Fig. 1A). Oito tumores com ≥4 vezes sobre-expressão quer de ETV1, ETV4, ETS2 ou ETS1 foram excluídos da análise por causa de seus números limitados. ESE1 foi altamente expressa em 26 dos 59 (44%) tumores da próstata, mas apenas em 12, que foram incluídos no ESE1

grupo de alto expressando, foi a sobre-expressa apenas ETS. ESE3 foi regulada para baixo ≥4 vezes em 27 dos 59 (46%) tumores de próstata, mas apenas em 13 casos, que foram incluídos na ESE3

grupo de baixa expressão, que era a única ETS desregulamentado. Nós aplicamos uma abordagem semelhante a um conjunto de dados microarray à disposição do público a partir de um estudo independente [14] obtenção de uma distribuição semelhante de tumores de próstata em quatro subgrupos principais (Fig. S2). Curiosamente, em nossa série 6 e 8 dos 14 ERG

tumores elevados tinham concomitantemente desregulado expressão de ESE3 e ESE1, respectivamente (Fig. 1A). Da mesma forma no conjunto de dados públicos os 15 ERG

tumores elevados tinham concomitantemente desregulado expressão de ESE3 e ESE1 (Fig. S2A). Assim, ERG sobre-expressão poderiam coexistir de forma clara com expressão desregulada desses outros fatores ETS. Em nossa série de tumores, 11 dos 14 ERG

tumores elevados (79%) foram positivos para o TMPRSS2: transcrição de fusão erga avaliada por ponto final RT-PCR (Fig S3A.). Os outros ERG sobre-expressam tumores tinham provavelmente outros tipos de transcrições de fusão não detectados pelo ensaio. Sete tumores tinham níveis muito baixos de TMPRSS2: erga transcrição por ponto final de RT-PCR, a expressão normal do tipo de ERG por qRT-PCR e não foram incluídos no grupo ERG

alta. Nenhuma das amostras normais e 8 das 11 amostras de hiperplasia prostática benigna (BPH) examinados tinham evidência de TMPRSS2: erga transcrição (Fig. S3A). Os parâmetros clínicos e patológicos dos quatro subgrupos de tumor são mostradas na Fig. S3B. Não houve associação estatisticamente significativa entre os subgrupos ETS e qualquer um dos parâmetros clínicos /patológica avaliados.

A. Expressão do ERG, e ESE1 ESE3 determinada por qRT-PCR em tumores da próstata e pela próstata normal. Os tumores são agrupados de acordo com o fator de ETS predominantemente expresso. B. Análise de componentes principais. Os pontos representam amostras individuais com a sua localização determinada pelos componentes principais do transcriptoma. C número de genes expressos diferencialmente com Q≤0.1 em cada subgrupo ETS. D-E. Venn diagramas mostrando compartilhada e distintos genes diferencialmente expressos entre os subgrupos de tumores indicados.

Programas de transcrição em cancro da próstata Subgrupos

Foi utilizado Análise de Componentes Principais (PCA) para avaliar o grau global semelhança ou divergência das transcriptomes individuais de amostras normais e câncer de próstata. Como mostrado na Fig. 1B, tumores pertencentes a diferentes subgrupos formadas parcialmente grupos distintos que sugerem que a divergência nos programas de transcrição depende, pelo menos em parte nos seus padrões de expressão de genes ETS. ERG

altos e ESE3

tumores de baixo foram os mais distantes da próstata normal e em grande parte distinta dos outros subgrupos. Em seguida, foram comparados os perfis de transcrição dos subgrupos de tumor com o de próstata normal usando Gene Expression Profile Analysis Suite (GEPAS) [15] para identificar características comuns e distintos e extrair assinaturas de genes ETS específicas do. O número de genes diferencialmente expressos (Q≤0.1) em cada subgrupo é mostrado na Fig. 1C e as listas de genes são mostrados na Tabela S1. ERG

altos e ESE3

tumores de baixo tinha as assinaturas genéticas mais robustas com o maior número de genes diferencialmente expressos em relação à próstata normal, enquanto o número de genes diferencialmente expressos foi consideravelmente menor em ESE1

alto e tumores NoETS .

em seguida, cruzou as listas de genes diferencialmente expressos em relação à normal da próstata para determinar o grau de sobreposição e divergência entre os subgrupos de tumores (Fig. 1D-e). Notavelmente, ERG

altos e ESE3

tumores de baixo partilhada muitos genes diferencialmente expressos com uma grande sobreposição entre os dois sobre-regulada e jusante genes regulados, indicando que a expressão alterada de ERG e ESE3 teve efeitos parcialmente semelhantes. Por outro lado, ERG

altos e ESE3

tumores de baixo teve um grande número de características distintivas em relação ao n ETS (Fig. 1D) e (1E Fig.) Tumores ESE1

alta. Estas diferenças em conjunto sobreposição gene foram estatisticamente significativa (P 0,0001, teste Exato de Fisher). Os genes modulados tanto no ERG

alto e ESE3

tumores de baixo, mas não nos outros subgrupos de tumores, identificados através de um 3-way (Fig. 1D) e 4-way diagramas (Fig. S4) de Venn, estão listados na Tabela S2.

para entender as implicações funcionais das diferenças entre os subgrupos de tumor que usamos MetaCore, um conjunto de software para a análise funcional integrada dos dados de expressão gênica [16]. MetaCore permitiu mapear características comuns, semelhantes e únicos entre os subgrupos de tumor e definir comumente e diferencialmente afetadas vias Gene ontologia. Como mostrado na Fig. 2A, havia muitas características comuns e semelhantes entre os subgrupos de tumores. Por outro lado, ERG

altos e ESE3

tumores de baixo teve o maior número de características únicas. A parte superior geralmente afectada mapas GeneGo pathway (GGPM), mostrado na Fig. 2B, incluídos

resposta imune, a remodelação do citoesqueleto, desenvolvimento,

ciclo celular e

transcricional regulação

. Eles podem representar genes e vias normalmente activados em tumores, em comparação com o tecido normal. Os GGPMs diferencialmente afetadas foram predominantemente ou exclusivamente enriquecido em ERG

alto e ESE3

tumores de baixo (Fig. 2C). O topo diferencialmente GGMPs afectados incluídos

cell-integrina adesão mediada

,

citoesqueleto remodelação

,

aderência-ECM celular remodelação

e

adesão celular quimiocinas

, sugerindo que a activação destes percursos, relacionados com a migração celular e invasão, poderiam ser características predominantes destes tumores. Curiosamente, estes dados implicados também que a perda ESE3 teve consequências bastante semelhante à do ERG sobre-expressão do programa transcricional de tumores de próstata.

A. Número de características únicas, similares e comuns entre os genes diferencialmente expressos em comparação com próstata normal em ERG

alta, ESE3

baixos, ESE1

altos e NoETS tumores de acordo com MetaCore. B. comumente afetadas GeneGo Caminho Mapas nos subgrupos de tumores. C. diferencialmente afetados GeneGo Caminho Maps no ERG

alta, ESE3

baixo, ESE1

altos e NoETS tumores.

ERG aumenta a expressão EZH2 na próstata Tumores

a avaliação abrangente da expressão do gene ETS e dados genômicos mostrou assinaturas genéticas robustos e parcialmente sobrepostas nos ERG

altos e ESE3

tumores baixos, com muitos genes ativados e reprimidos. Em seguida, temos procurado ERG

altos e ESE3

assinaturas de baixo para genes alvo que possam agir como nós principais mediadoras os efeitos desses fatores ETS expressos de maneira aberrante no transcriptoma câncer de próstata. EZH2 estava entre os 169 genes regulados positivamente tanto no ERG

ESE3

Baixa tumores genes (Fig. S4 e Tabela S2), enquanto que não foi aumentado nos outros subgrupos de tumor elevada e. EZH2 também se correlacionou positivamente com o ERG e negativamente correlacionada com ESE3 em uma análise de correlação de todo o conjunto de dados microarray (Tabela S3). EZH2 é uma lisina histona H3 27 (H3K27) metiltransferase e um elemento-chave para o silenciamento do gene epigenético [17], [18]. H3K27 metilação é uma marca de histona que cria um ponto de ancoragem para o recrutamento de fatores cromatina remodelação adicionais induzir um estado de cromatina repressiva [17]. Assim, a indução de EZH2 associado com o ganho de ERG e perda ESE3 poderia contribuir para o assinatura ampla repressivo observado nestes tumores (Fig. 1C). EZH2 tem sido mostrado para ser regulados positivamente em cancros da próstata em comparação com próstata normal com níveis particularmente elevados em tumores metastáticos [19] e de alto grau. No entanto, alguns factores foram identificados que pode aumentar a expressão EZH2 em tumores da próstata [20], [21], [22], [23]. Descobrimos que EZH2 foi significativamente regulada para cima no ERG

tumores elevados em comparação com tanto da próstata normal e tumores NoETS (Fig. 3a), indicando que pode haver uma ligação directa entre a expressão de EZH2 e ERG que não tinha sido reconhecido antes. Consistente com este achado, EZH2 foi significativamente maior no ERG

elevado em comparação com NoETS tumores (P 0,0001). Também em um conjunto de dados independente (Fig. 3B)

A. EZH2 expressão em amostras de tecido. dados de microarray rácios são apresentados como log2 em comparação com a referência. expressão B. EZH2 em NoETS e ERG

tumores elevados no Wallace et al. conjunto de dados de microarray. expressão C. EZH2 em células LNCaP e 22Rv1 transitoriamente transfectadas com vazia (

ev

) ou expressão ERG (

Erg

) vector determinada por RT-PCR (

esquerdo

) e western blot (

direito

). nível D. EZH2 no ERG-expressando células 22Rv1 e LNCaP estáveis ​​determinados por RT-PCR controle e (

superior

) e Western blot (

parte inferior

). nível E. EZH2 em células VCaP transitoriamente transfectadas com siRNA específico do ERG (siERG) controle e determinada por RT-PCR (

esquerdo

) e Western blot (

direito

). F. ChIP nas linhas celulares indicadas, com anticorpo ERG e qPCR com conjuntos de iniciadores abrangendo o EBS no promotor EZH2. Positivo (promotor MMP3) e controlos (ETS2) negativos são mostrados na Fig. S6A-B e 7A, respectivamente. G Os espécimes de tecido de ERG

tumores alta e NoETS foram submetidos a chip com o anticorpo anti-ERG e analisadas por qPCR. ETS2 foi utilizado como controlo negativo (Fig. S7B). *, P 0,01; **, P . 0,0001

Em seguida, sondou a relação funcional entre ERG e EZH2 ea possibilidade de regulação direta de EZH2 pelo ERG em células de câncer de próstata, em que experimentalmente para cima e para baixo ERG -regulated. Nestes experimentos sobre-expressos ERG no ERG-translocação células cancerosas da próstata negativos 22Rv1 e LNCaP que não expressam endógena ERG. Após a transfecção, as células 22Rv1 e LNCaP expressa ERG para níveis semelhantes aos TMPRSS2: ERG células VCaP positivos translocação (Fig. S5A). Em paralelo, knock-down do ERG foi realizada em células VCaP usando uma siRNA específico ERG. O nível de ERG RNA e de proteína foi significativamente reduzido em células transfectadas de ARNip em comparação com células de controlo VCaP (Fig. S5b). Para validar os modelos celulares, examinámos a expressão de genes, como MMP3, PLA-1 e CRISP3, que estavam no topo da lista de genes regulados positivamente em ERG

tumores elevadas e tinha sido anteriormente mostrado para ser controlado pelo ERG em outros sistemas celulares [6]. A expressão destes genes aumentada após a sobre-expressão do ERG em 22Rv1 e LNCaP (Fig. S5c) e diminuiu em cima do ERG knock-down em células VCaP (Fig. S5D). Estes resultados demonstraram a adequação dos nossos modelos celulares para investigar potenciais genes alvo ERG, juntamente com o valor preditivo das assinaturas genéticas que nós derivados de amostras clínicas de câncer de próstata.

Ambos transitória e expressão estável do ERG no ERG-negativos células LNCaP e 22Rv1 levaram ao aumento do nível de EZH2 (Fig. 3C-D). Além disso, mRNA e proteína EZH2 foram reduzidos em cima mediada por siRNA knock-down do ERG em células VCaP (Fig. 3E). As alterações na expressão de EZH2 observados sobre regulamentação acima e para baixo do ERG sugeriu a possibilidade de regulação direta pelo ERG. Foram identificados locais putativos ETS (EBSS) em 1 kb do TSS EZH2 por análise computacional e ChIP experiências realizadas de ligação para determinar se ERG foi capaz de se ligar a estes locais (Fig. 3F). A ligação do ERG ao promotor EZH2 foi observada em células positivas VCaP ERG translocação e em células LNCaP e 22Rv1 após expressão estável de ERG, enquanto nenhuma ligação foi observada em não-ERG expressando LNCaP parentais e células 22Rv1 (Fig. 3F). Da mesma forma, ERG foi ligado ao gene MMP3, um alvo conhecido ERG aqui utilizada como controlo positivo, apenas em clones que expressam ERG e em células de capnografia, (Fig. S6A). Nenhuma ligação do ERG foi visto ao promotor ETS2, o qual foi utilizado como um controlo negativo (Fig. S7A). A região do promotor ETS2 avaliada pelo chip incluído o local de início da transcrição e ambos ARN-polimerase II e Sp1 tinha sido demonstrado que se ligam a esta região em gel shift e ensaios de chip ([24] e dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes dados permitiram concluir que ERG actuou como um activador transcricional de EZH2 através da ligação ao seu promotor. Finalmente, para provar que esta interacção ocorreu também em amostras de tumor clínicas que realizamos chip para avaliar a ligação do ERG ao promotor EZH2 no ERG

altos e NoETS amostras (Fig. 3G). ERG foi associada ao promotor EZH2 no ERG

tumores altas enquanto ele estava ausente nos tumores NoETS, consistente com a hipótese de que ele controlava a transcrição deste gene. A especificidade foi demonstrada pela ausência de ligação do ERG ao promotor ETS2 nas amostras de tumor (Fig. S7B).

ERG reprime NKX3.1 na Próstata Tumores através de EZH2 e Histona H3K27 metilação

Além de genes regulados positivamente, o transcriptoma do ERG

tumores elevados incluídos numerosos genes cuja expressão foi significativamente reduzido em comparação com próstata normais, sugerindo que estes genes podem ser reprimido, quer directamente ou indirectamente por ERG. A lista de genes regulados por baixo no ERG

tumores elevados incluiu muitos genes relevantes que possam ter impacto significativo na biologia do câncer de próstata. Entre genes com funções supressoras de tumor conhecidos, nós nos concentramos em NKX3.1, que foi igualmente afectada em ERG

alto e ESE3

tumores de baixo. NKX3.1 é uma homeobox gene específico da próstata e um factor de transcrição que tem funções críticas no desenvolvimento da próstata e supressão de tumor [25]. A perda da expressão NKX3.1 é um evento frequente na tumorigénese da próstata e tem sido atribuída a vários mecanismos, incluindo a perda alélica, metilação e silenciamento pós-transcricional [25], [26], [27], [28]. Verificou-se que o nível de NKX3.1 foi significativamente reduzida em ERG

tumores elevados em comparação com os tumores de próstata e NoETS normais (Fig. 4A). Para determinar se a sub-regulação NKX3.1 foi funcionalmente ligada a sobre-expressão do ERG, examinou-se o nível de NKX3.1 em células de cancro da próstata sobre a modulação de ERG. ERG knock-down em células VCaP resultou num aumento da expressão do mRNA no NKX3.1 e nível de proteína (Fig. 4B). Por outro lado, o nível de NKX3.1 foi reduzida pela expressão estável do ERG em LNCaP negativo ERG e 22RV1 células, proporcionando evidência adicional de controlo de expressão NKX3.1 por ERG (Fig. 4B). Desde fatores ETS pode atuar como ativadores de transcrição ou repressores, dependendo do contexto promotor [10], [29], que procurou o promotor NKX3.1 para possível EBS que poderiam mediada ligação ERG. A análise computacional mostrou a presença de um EBS putativo no promotor NKX3.1. ChIP ensaios mostraram ligação do ERG a esta região do promotor em células de capnografia, (Fig. 4C). ERG ocuparam o promotor NKX3.1 também em células LNCaP e 22Rv1 ERG após expressão estável e, concomitantemente, para o silenciamento do gene (Fig. 4C). Assim, a ligação de GRE ao promotor NKX3.1 foi associada com a repressão da transcrição do gene. Observamos ocupação promotor NKX3.1 pelo ERG, também em amostras de tumor clínicos através da realização de chip no ERG

altos e NoETS tumores. ERG foi ligado ao promotor NKX3.1 no ERG

tumores elevados, consistentes com a hipótese de que ele controlada negativamente a transcrição do gene neste subgrupo tumor (Fig. 4D).

A. NKX3.1 expressão em amostras de tecidos normais e tumorais. nível B. NKX3.1 em células LNCaP transfectadas transitoriamente com vazia (

ev

) ou expressão ERG (

Erg

) vector determinada por Western blot (painel superior), nível de NKX3.1 em VCaP células transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo e siERG determinada por RT-PCR e transferência de Western (painel do meio), o nível de NKX3.1 ERG em células que expressam 22Rv1 e LNCaP estáveis ​​analisados ​​por RT-PCR e transferência de Western (painel inferior) e de controlo. C. A ligação do ERG ao promotor NKX3.1 determinado pelo chip e qPCR em linhas celulares indicadas. Os controlos negativos são mostrados na Fig. S7A. D. As amostras de tecido de ERG

alta do tumor e foram submetidos a NoETS chip com o anticorpo anti-ERG e analisadas por qPCR. Os controlos negativos são mostrados na Fig. S7B. E. VCaP, parental (controlo) e expressando ERG (ERG 18) células LNCaP transfectadas com EZH2 específica (siEZH2) e ARNsi de controlo e analisados ​​por RT-PCR. F. chip com um anticorpo para H3K27 metilado e qPCR com conjuntos de iniciadores abrangendo a EBS (

painel superior

) e um potenciador responsivo andrógeno (ARE) (

painel inferior

) na NKX3.1 gene. ETS2 foi utilizado como controlo negativo (Fig. S8A). a actividade do promotor G. NKX3.1 em células LNCaP transfectadas com o repórter promotor NKX3.1 humana, juntamente com os vectores de expressão indicados. actividade repórter de luciferase foi medida após 24 h. nível de proteína H. NKX3.1 em células LNCaP transfectadas transitoriamente com vazio (-) ou vector de expressão, quer ERG (PERG) ou EZH2 (pEZH2) determinada por Western blot. I. NKX3.1 metilação do promotor foi determinada por sequenciação de ADN tratado com bissulfito. círculos vazios e cheios representam locais CpG não metilados e metilados, respectivamente. *, P 0,01; ** P . 0.001

Para determinar se a indução de EZH2 por ERG poderia contribuir para o silenciamento de NKX3.1, nós knocked-down EZH2 no ERG células que expressam. knock-down de EZH2 em células VCaP aumento da expressão de NKX3.1, consistente com a hipótese de que o gene estava sob o controlo de EZH2 nestas células (Fig. 4E) mediada por siARN. Além disso, EZH2 knock-down no ERG LNCaP que expressam clones parcialmente restaurada expressão NKX3.1 a um nível semelhante ao das células LNCaP parentais (Fig. 4E). Para demonstrar ainda mais o papel de EZH2, que determinado pelo chip se o promotor NKX3.1 adquirida a H3K27 metilação marca característica da actividade de EZH2 em células em que o gene foi reprimida. Observamos aumento H3K27 metilação na região em torno do EBS, o que foi identificado no promotor, e ao nível de um melhorador responsivo androgénio (ARE), que é um importante regulador local no gene NKX3.1 [30] em ERG- células VCaP positivos translocação (Fig. 4F). Um enriquecimento semelhante de H3K27 metilação também foi observada em células LNCaP e 22Rv1 com expressão estável do ERG (Fig. 4F). Assim, NKX3.1 adquiriu uma característica marca repressivo da atividade EZH2 de forma ERG-dependente. Tomados em conjunto, estes dados estabelecido que NKX3.1 era um alvo de ambos ERG e EZH2. ERG reprimido NKX3.1 directamente através da ligação ao seu promotor e indirectamente através da indução de EZH2 e H3K27 metilação. ensaios de repórter de luciferase e as experiências de transfecção transiente apoiaram esta hipótese. a actividade do promotor e NKX3.1 nível de proteína foram reduzidas após expressão transiente de ERG em células LNCaP (Fig. 4G-H). Em contraste, a transfecção transiente de EZH2 sozinho não teve efeito sobre a actividade do promotor NKX3.1 no ensaio repórter ou nível de proteína NKX3.1 (Fig. 4G-H), indicando que EZH2 necessária ERG e expressão estável para silenciar NKX3.1. Estes resultados são assim consistentes com a capacidade de factores de ETS para agir activador, alternativamente, como transcrição e repressor [10], [29], e com a hipótese de que os factores de transcrição pode influenciar o recrutamento de efectores epigenética como EZH2 de promotores de genes [31].

Aquisição de marcas de histona repressivas, como H3K27 metilação, é apenas um dos vários mecanismos que contribuem para o silenciamento de genes supressores de tumores em células de cancro [18]. O promotor do gene NKX3.1 contém uma ilha CpG do gene e tem sido relatada a ser silenciado por metilação de CpG promotor em tumores da próstata [26]. Assim, determinou-se a metilação do DNA também estava envolvido no silenciamento NKX3.1 induzida ERG. bissulfito sequenciação revelou a ausência de metilação de CpG no promotor NKX3.1 em células ERG-translocação VCaP positivas e expressam ERG e células que não expressam LNCaP (Fig. 4a). Em contraste, o promotor NKX3.1 foi metilada no ERG-translocação PC3 negativo células de cancro da próstata que não expressam NKX3.1 (Fig. 4E), indicando que nestas células NKX3.1 foi silenciado por metilação de CpG promotor. Assim, induzida pelo ERG silenciamento NKX3.1 baseou-se essencialmente na EZH2 e foi independente da metilação do promotor, de acordo com a reativação de expressão NKX3.1 sobre EZH2 knock-down.

ESE-3 reprime EZH2 e ativa NKX3.1 transcrição

O transcriptoma do ERG

tumores alta e ESE3

baixa partilhada muitos genes em comum. Isto sugeriu que o ERG e ESE3 poderia afectar a transcrição de muitos genes em sentidos opostos e que a sobre-regulação do ERG e ESE3 sub-regulação poderia resulta em efeitos semelhantes parcialmente sobre o transcriptoma do cancro da próstata. Como se vê na ERG

tumores elevadas, EZH2 foi significativamente maior em ESE3

tumores baixos em comparação com tumores da próstata e NoETS normais (Fig. 5a). A relação inversa entre ESE3 e nível de expressão EZH2 também foi visto em um conjunto de dados microarray independente (Q 0,0004) [14] (Fig 5B;. S2D). Estas observações sugerem que ESE3 poderia regular negativamente EZH2 na próstata e perda de ESE3 poderia resultar num aumento da expressão de EZH2 em tumores da próstata. Para testar esta hipótese, geramos clones de células LNCaP (ESE3-

kd

) em que estavelmente knocked-down ESE3 usando shRNA constrói. Estes clones tinham níveis significativamente mais baixos de ESE3 comparação com células LNCaP parentais, que expressam níveis detectáveis ​​de ESE3 (Fig. S5E). Consistente com nossa hipótese,

kd

células LNCaP ESE3- teve maior expressão de EZH2 do que as células parentais (Fig. 5C). Para determinar se ESE3 controlada a expressão de EZH2 também em células epiteliais da próstata normais, de forma estável knock-down ESE3 em células imortalizadas LHS [32], o que temos mostrado previamente para expressar ESE3 [11]. Como mostrado na Fig.