Abstract
MicroRNA-449a é expressa em um nível baixo em vários tumores e células de câncer linhas e induz G1 prisão, apoptose e senescência. Para identificar a função de miR-449a no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), discutimos a relevância potencial de miR-449a às características clínicas e prognóstico em NSCLC. Nós também investigou o impacto de miR-449a sobre migração e invasão em células NSCLC. A expressão de miR-449a em tecidos e linhas celulares de NSCLC foi detectada através de RT-qPCR.
In vitro
, obter-de-função, as experiências de perda de função, e os ensaios de fluorescência foram realizadas para identificar o alvo potencial de miR-449a e a função de miR-449a em células NSCLC. MiR-449a foi regulada negativamente em ambos os tecidos e linhas celulares de NSCLC. Além disso, um nível de baixa expressão de miR-449a parecia estar correlacionada com metástases em linfonodos e baixa sobrevida.
In vitro
, miR-449 regulado a migração celular e invasão de células NSCLC como um potencial supressor de tumor, pelo menos em parte, pela segmentação de c-Met. Além disso, a expressão recíproca de miR-449a e c-Met foi mostrado em amostras de tecido de NSCLC. Este estudo indica que miR-449a pode ser associada com a progressão NSCLC, e sugere um papel crucial para miR-449a em NSCLC
Citation:. Luo W, Huang B, Li Z, Li H, Sun L, Zhang Q, et ai. (2013) MicroRNA-449a é regulada negativamente em Non-Small Cell Lung Cancer e Migração inibe e invasão por Segmentação c-Met. PLoS ONE 8 (5): e64759. doi: 10.1371 /journal.pone.0064759
editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de dezembro de 2012; Aceito: 17 de abril de 2013; Publicado em: 29 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Luo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation da China (No. 30.972.967) subsídios, Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da Educação Superior (nº 20092104110018), Programa de Liaoning excelentes talentos em University, Liaoning Provincial Natural Science Foundation (No. 20.102.122) e Shenyang Ciência e Tecnologia Programa (F10-149-9-41). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes, aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, que regulam a expressão do gene posttranscriptionally. Ao ligar-se a uma sequência complementar predominantemente encontrada na 3’UTR do ARNm alvo, quer miARNs degradam esses mRNAs ou inibem-los de serem traduzidos em proteínas. Cerca de 50% dos miRNAs humanos estão localizadas em locais frágeis e regiões genômicas envolvidas em cancros [1]. A evidência emergente mostra que miARNs estão correlacionados com vários cancros humanos e funcionar como oncogenes e supressores de tumor [2], [3], [4].
desregulação expressão MicroRNA em cancros humanos demonstraram que a desregulação de miARN está associada com muitos tipos de cancro, incluindo o cancro do pulmão [5], [6], [7], [8], [9]. Alta expressão de miR-155 e baixa expressão de let-7, o miR-126 são relatados para prever mau prognóstico de adenocarcinoma do pulmão [6], [7], [10]. Raponi e colegas descreveram expressões miRNA distintas no carcinoma epidermóide de pulmão (SCC), em comparação com o tecido pulmonar normal [11]. Com base na expressão de miARN desregulação, miARNs poderia proporcionar um novo método para o diagnóstico do cancro.
miR-449 é expresso a um nível baixo em várias linhas celulares de cancro e de tumores sólidos, incluindo os cancros da próstata [12], os cancros gástricos [13 ], cancros da bexiga [14] e câncer de pulmão [15]. Os alvos biológicos de miR-449 foram parcialmente identificados, e miR-449 induz a paragem em G1, a apoptose, e senescência por regulação dos factores chave no ciclo celular e apoptose, tais como histona-desacetilase 1 (HDAC1) [12], CDK6 [16] , [17], [18], Cdc25A [16], [18], a ciclina D1 (CCND1) [19], e SIRT1 [17]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel de miR-449a em progressão NSCLC. Neste estudo, descobrimos que miR-449a foi regulada negativamente em tecidos NSCLC e associado com personagens clínico-patológicas e prognóstico. Nós exploramos o efeito de miR-449a na migração de células NSCLC e invasão e a sua regulação do gene alvo c-Met. Foi observada expressão recíproca de miR-449a e c-Met em amostras de tecido NSCLC e os possíveis papéis de miR-449a e c-Met em progressão NSCLC são discutidos.
Materiais e Métodos
Amostras
amostras frescas de câncer de pulmão e tecido normal adjacente correspondente (NAT, 5 cm do tecido de câncer) foram obtidas de pacientes no primeiro hospital afiliado da China Medical University e Hospital do câncer Liaoning entre janeiro de 2008 e novembro de 2009 com o consentimento informado. (Ética Comitê de Revisão do hospital deu a aprovação). Nenhum dos 84 pacientes do estudo receberam qualquer terapêutica de radiação ou quimioterapia antes da cirurgia. Dez amostras de pulmão normais foram obtidos a partir consentindo pacientes durante a cirurgia para doença pulmonar benigno. Para a análise quantitativa miR-449, tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina (FFPETs) de casos de câncer de pulmão foram selecionados aleatoriamente de pacientes em Liaoning Hospital de Câncer de janeiro de 2004 a dezembro de 2005 com o consentimento informado e aprovação. informações clínico-patológico foi disponíveis e dois patologistas determinado independentemente diagnósticos e grau histológico com base nas diretrizes da Organização Mundial de Saúde. informações clínico-patológica e dados de seguimento estão resumidas na Tabela S1.
Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional local no primeiro hospital afiliado da China Medical University e Hospital do Câncer Liaoning. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e toda a investigação clínica foram realizados.
em tempo real Polymerase Chain Reaction quantitativa (RT-qPCR) de miR-449a
O RNA total foi extraído de fresco tecidos e células utilizando Trizol (Invitrogen, Nova Iorque, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. ARN de FFPETs foi separada através de um isolamento de miARN Kit Am1975 RecoverAllTM (Ambion, Austin, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. MicroRNA quantificação a partir de RNA extraído foi realizada utilizando TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, EUA). RT primer e sonda TaqMan de miR-449a (Applied Biosystems, Foster City, EUA) foram utilizados para análise de PCR em um 7900HT ABI (Applied Biosystems, Foster City, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. RNU6B, como um controlo interno, foi realizada da mesma maneira que anteriormente. Cada análise de RT-qPCR foi realizado em três experiências independentes, utilizando três amostras independentes. A quantidade relativa de miR-449a em tecidos e linhas celulares de NSCLC foram comparados com a expressão média de 10 amostras normais, utilizando a equação RQ = 2
-ΔΔCT [20], [21].
celular cultura e transfecção
O cancro do pulmão linha de células A549 humanas e linhas de células H1299 foram obtidas da American Type Culture Collection. Outras linhas celulares de NSCLC células BE1 e LH7 eram de papel publicado anterior da nossa equipa [8]. A549 foram cultivadas em modificou Eagle Médium da Dulbecco (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, EUA). BE-1, LH-7 e H1299 foram crescidas em meio RPMI-1640 (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, EUA). Em cada caso, o meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, EUA), 100 U /ml de penicilina, e 100 U /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO
2.
Um controlo negativo imitador, um mímico de miR-449a, um inibidor de controlo negativo e um inibidor de miR-449a, eram de RiboBio (Guangzhou, China). As células A549 e H1299 foram transfectadas usando HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha). Resumidamente, os complexos contendo imita ou inibidores foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante. A mistura foi adicionada às células a uma concentração final de 100 nM. Os quatro grupos foram: células transfectadas com um controlo negativo mímico, transfectada com um mímico de miR-449a, transfectada com um inibidor de controlo, transfectadas com um inibidor de miR-449a. Além disso, um pequeno ARN de c-Met interferente (siRNA) e um controlo negativo foram concebidos e sintetizados por GenePharma (Xangai, China) e transfectado em células A549. As sequências de c-Met siRNA foram 5′-GGA AGA AUA GUC CAU UTT GGG-3 ‘(sentido) e 5′-CGC CUC AAU UUC CUA UGA CTT-3’ (anti-sentido).
migração e invasão celular Assays
Transwell câmaras (Corning, Nova Iorque, EUA) com um tamanho de poro de 8 mm foram utilizados para ensaios de migração e invasão celular. As células foram cultivadas até 60% de confluência e transf ectadas com o miARN ou ARNsi. Após 24 horas, a migração para o ensaio, as células foram tripsinizadas e 5 × 10
4 células foram ressuspensas em meio isento de soro e colocadas na câmara superior. Como um quimioatractor, a câmara inferior continha 10% de FBS. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO
2 durante 16 horas, e as células foram removidos nonmigrating com um cotonete. células que migraram lavadas duas vezes com PBS e fixadas em 100% de metanol, coradas com hematoxilina. As células coradas foram visualizadas sob um microscópio (ampliação x 200), e o número de células migradas foi contado em cinco campos aleatórios. Para os ensaios de invasão, a câmara superior foi pré-revestido com Matrigel misturados com meio isento de soro (diluídas a 1:03, BD Biosciences, San Jose, EUA). Após a solidificação da mistura, 5 × 10
4 células em meio isento de soro, foram colocadas na câmara superior. A câmara inferior contém 10% de FBS como um quimioatractor. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO
2 durante 18 horas, e as células não invasoras foram removidos com cotonete. células invasivas foram fixadas, coradas e contadas. As células coradas foram visualizadas sob um microscópio (ampliação x 200), e o número de células migradas foi contado em cinco campos aleatórios. Os ensaios foram realizados em duplicado em três experiências independentes.
Análise RT-qPCR de miR-449a gene alvo
O ARN total foi extraído a partir de células, e a síntese de ADNc foi realizada com o kit de reagente PrimerScript RT ( Takara, Dalian, China). O ADNc resultante foi amplificado utilizando iniciadores de c-Met com SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian, China) com os parâmetros 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 s . Os iniciadores para c-Met foram F: 5′-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3 ‘e R: 5′- CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3′, e os iniciadores para endógena β-actina F foram: 5’-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ‘, R: 5’-ACATGCCGGAGCCGTTGT -3 ‘. Derreter análise da curva foi realizada no final dos ciclos para garantir a especificidade do produto. A quantidade relativa de c-Met, normalizada para p-actina, calculada com base na equação RQ = 2
-ΔΔCT.
Análise Western Blot
As amostras de tecido de 0,2 g foram moídas a pó em azoto líquido. pó e células de tecido foram extraídas com tampão de lise (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 2 mg /mL de aprotinina e 1 mM de PMSF) durante 30 min a 4 ° C. Uma quantidade igual de proteína foi separada em 10% de gel SDS-PAGE. Anti-c-Met (21220, Signalway Anticorpo, Maryland, EUA), anti-MMP2 (SC-13595, Santa Cruz, CA, EUA), anti-MMP9 (SC-13520, Santa Cruz, CA, EUA), anti- β-Actina (sc-1616, Santa Cruz, CA, EUA) foram utilizados seguiram as instruções do fabricante. software de imagem J (National Institutes of Health, Md, EUA) foi utilizado para medir a intensidade das bandas de proteínas.
Fluorescent Reporter Assay
A fim de realizar o ensaio repórter fluorescente, os seguintes iniciadores foram utilizados para amplificar o 3’UTR do gene c-Met a partir de ADNc humana (NM_000245):. iniciador directo 5′-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG -3 ‘, iniciador inverso 5′-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3’
o plasmídeo contendo c-Met 3’UTR a um repórter fluorescente foi construído (Sauer Biotechnology Inc, China). As células A549 foram semeadas em placas de 48 poços, cultivadas durante a noite, em seguida, co-transf ectadas com o controlo mímico, miR-449a mímico, controlo, inibidor de miR-449a seguido pela pcDNA3 /EGFP-c-Met 3’UTR vector repórter após 24 horas. A atividade aumentada verde proteína fluorescente (EGFP) foi normalizada para a actividade vermelho proteína fluorescente (RFP). Após 72 horas, as proteínas foram extraídos, e o F-4500 de fluorescência espectrofotómetro (Hitachi, Japão) foi usada para determinar a intensidade da fluorescência. Os ensaios foram realizados em duplicado em três experiências independentes.
Análise Estatística
SPSS13.0 pacote de software estatístico (SPSS, Chicago, EUA) foi utilizado para a análise estatística. Para RT-qPCR, o nível de miR-449a no cancro do pulmão e expressão emparelhado NAT foi log2 transformado. Todos os valores foram registados como média com desvio padrão (SD). A-amostras pareadas T-teste foi utilizado para analisar as diferenças na expressão de miR-449a entre câncer de pulmão e NAT combinados. Um teste do qui-quadrado foi utilizado para analisar a relação entre os níveis de expressão de miR-449a e personagens clínico-patológicas. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para analisar os dados classificados de grau histológico e estágio patológico. Spearman determinou a correlação entre a expressão de miR-449a e estágio patológico, e estado dos linfonodos. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para as curvas de sobrevida, e um teste de log-rank foi usado para comparação. regressão de Cox foi usado para examinar o efeito de co-variáveis. Os resultados dos experimentos com células foram analisadas por um amostras independentes T-teste e one-way ANOVA.
P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados de
1.. MiR-449a foi regulada negativamente em NSCLC tecidos e Associated com Linfonodo Metástase
Detectamos expressão de miR-449a por RT-qPCR em 84 amostras de tecido NSCLC frescos com NAT emparelhados. Comparado com o NAT, o nível de expressão de miR-449a (77/84) foi significativamente regulada negativamente em tecidos NSCLC (teste T pareado,
P = 0,004
,
t
= -2,997, Figura 1A). Regulação negativa de miR-449a detectado por RT-qPCR em tecidos NSCLC, também foi mostrado na boxplot (Figura 1B). RNU6B foi utilizado como padrão interno.
A. gráfico de barras emparelhado indica downregulation de miR-449a em tecidos NSCLC. resultado RT-qPCR de miR-449a em 84 tecidos NSCLC frescas e NAT emparelhados. experiências em triplicado foram concluídas para cada amostra, a expressão relativa foi calculada usando a equação RQ = 2
-ΔΔCT. Comparado com o NAT, miR-449a foi significativamente regulada negativamente em amostras de NSCLC (teste T pareado,
P = 0,004
,
t
= -2,997). B. Boxplot indica a regulação negativa de miR-449a em tecidos NSCLC. C. Correlação entre o nível de expressão de miR-449a e estágio patológico, status do nó de linfa de 84 amostras frescas emparelhados de doentes com cancro do pulmão. curva D. Kaplan-Meier para as taxas de 5 anos de sobrevida global (14,29%) dos 70 FFPET amostras de pacientes com câncer de pulmão. E. Em 70 FFPET amostras de pacientes com câncer de pulmão, a curva de Kaplan-Meier para pacientes com câncer de pulmão classificados como expressão alta ou baixa miR-449a, baixo nível de miR-449a expressão foi significativamente correlacionada com o paciente teste pior sobrevida (log-rank,
P
. 0,001)
para determinar os efeitos da expressão de miR-449a na iniciação e progressão tumoral, pacientes com NSCLC foram divididos em dois grupos, de baixa e alta expressão, de acordo com o nível de miR-449a em tecidos cancerosos (valor log2, mediana = 1,47) a expressão significa. Correlação entre a expressão de miR-449a e variáveis clínico-patológicas de câncer de pulmão são apresentados na Tabela 1. Foram observadas correlações significativas entre a expressão de miR-449a e estágio patológico (
P
= 0,012) (Mann-Whitney U). Em 17 casos apresentando estágio patológico III, 13 (76,47%) casos tiveram baixa expressão de miR-449a, enquanto a taxa baixa expressão era 16/32 (50,00%) de stageII patológica e 13/35 (37,14%) do estágio patológico I (Figura 1C). Mudanças na expressão de miR-449a também foram significativamente associados com metástase ganglionar. Em 40 casos de câncer de pulmão com metástase ganglionar, 25 (62,5%) tiveram baixa expressão de miR-449a. Por outro lado, em 44 casos sem metástase ganglionar, apenas 17 casos (38,64%) apresentaram baixa expressão de miR-449a (
P
= 0,029, teste do qui-quadrado; Figura 1C). Não houve correlação entre a expressão de miR-449a e sexo, idade, tipo histológico ou grau histológico.
Para melhor compreender a correlação entre a expressão de miR-449a e estágio patológico, metástases em linfonodos, a correlação de Spearman teste foi usado para posterior análise. Os resultados mostraram uma correlação negativa entre a expressão de miR-449a e estágio patológico (r = -0,276,
P
= 0,011), e metástases linfonodais (r = -0,238,
P = 0,029
).
2. Correlação entre a expressão de miR-449a e prognóstico de pacientes com câncer de pulmão
miR-449a expressão foi detectada em FFPETs de pacientes com câncer de pulmão 70 com dados de acompanhamento (Tabela S1). A curva de sobrevida global na Figura 1D mostra uma taxa de sobrevida global em 5 anos de 14,29% para 70 casos. De acordo com a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, pacientes com NSCLC com baixa expressão de miR-449a tiveram um prognóstico significativamente pior do que aqueles com alta expressão de miR-449a (teste-rank de log,
P Art 0,001; Figura 1E). Além de expressão de miR-449a, outros fatores clínico-patológicas, tais como grau histológico (teste-rank de log,
P
= 0,004), estágio patológico (teste-rank de log, P 0,001) e metástases linfonodais (log teste -rank,
P Art 0,001) também foram associados com o prognóstico de pacientes com câncer de pulmão de acordo com a análise de sobrevivência. A análise de regressão de riscos proporcionais de Cox univariada foi realizada para encontrar o fator mais fortemente preditivo de mau prognóstico de pacientes com câncer de pulmão. Descobrimos que a expressão de miR-449a (
P Art 0,001, hazard ratio [HR] = 0,345), grau histológico (
P
= 0,002, HR = 1,725), estágio patológico (
P Art 0,001, HR = 3,254), e metástases em linfonodos (
P Art 0,001, HR = 6,535) foram fatores preditivos de mau prognóstico de pacientes com câncer de pulmão (Tabela 2) .
multivariada Cox análise de regressão de risco proporcional mostrou que o nível de expressão de miR-449a (
P
= 0,041, HR = 0,558, 95% intervalo de confiança [CI]: 0.319- 0,976) foi um importante fator prognóstico independente favorável de outros fatores clínico-patológicas, por exemplo estágio patológico (
P
= 0,002, HR = 2,162, IC 95%: 1,338-3,491), status do nó de linfa (
P
= 0,001, HR = 3,104, IC 95%:. 1,615-5,966; Tabela 2)
3. MiR-449a foi regulada negativamente em linhas celulares de NSCLC e afetou migração e invasão
in vitro
Foi examinada a expressão de miR-449a em linhas celulares de 4 NSCLC: A549, BE-1, LH- 7, H1299 utilizando RT-qPCR. Como mostrado na Figura 2, em comparação com a expressão média de 10 amostras pulmonares normais, todas as 4 linhas de células mostraram regulação negativa significativa de miR-449a. Além disso, a expressão de miR-449a foi encontrado para ser consideravelmente diminuída na linha de células NSCLC altamente invasivo BE1 em comparação com a linha celular LH7 menos invasiva.
A quantidade relativa de miR-449a em linhas celulares de NSCLC 4 foram comparados ao nível médio de 10 amostras normais do pulmão com base na equação de expressão RQ = 2
-ΔΔCT.
expressão de miR-449a em ambos os tecidos e linhas celulares de NSCLC sugeriu que miR-449a foi associado com metástases. Portanto, nós exploramos os efeitos potenciais de miR-449a sobre migração e invasão em células de câncer de pulmão. De acordo com a expressão de miR-449a em linhas celulares de NSCLC, que seleccionado A549 e células H1299 linhas, que tinham expressão relativamente moderada de miR-449a, para ensaios de Transwell. Para determinar o efeito de miR-449a sobre a migração celular e invasão, A549 e células H1299 foram transfectadas com controlo imitador, imitador miR-449a, e o controlo inibidor de inibidor de miR-449a. Para assegurar efeitos de transfecção, RT-qPCR foi realizado para identificar a expressão de miR-449a após 24 horas (Figura S1). A expressão relativa de miR-449a em A549 e células H1299 transf ectadas com um mímico foi significativamente aumentada.
Como se mostra na Figura 3, em comparação com os controlos, as capacidades migratórias de células transfectadas com o imitador de miR-449a foram reduzidos por cerca de 42,9% para as células A549 e 36,4% para as células H1299. Em contraste, as células no grupo de inibidor de miR-449a apresentou maior capacidade de migração do que os controlos, as células que migraram aumentou de 62,5% para 48,5% e A549 para células H1299 (Figura 3). Os ensaios de invasão de Matrigel também foram realizadas, e exogenamente aumento de expressão de miR-449 reduziu o número de células invasivas significativamente de 44,8% para 38,2% e A549 para células H1299 (Figura 3). O número de células invasivas aumentada significativamente por 58,1% para 46,9% e A549 para células H1299 transf ectadas com inibidor quando o miR-449a (Figura 3)
A . B. MiR-449a regulada migração celular e invasão. As células A549 /H1299 foram transfectadas com controle Mimic, miR-449a Mimic, Controle inibidor e Inibidor de miR-449a, em seguida, submetido a ensaios de migração e invasão conforme descrito na Seção 2. Migração /células invasoras foram fotografadas para fotografias representativas após coloração com Hematoxilina. Ampliação original, × 200. C D. Número médio migrado /invasiva de células a partir de três experimentos independentes foi mostrado no gráfico de barras, a média ± SD. * P . 0,01
4. Mir-449a alvejado c-Met
Para determinar possíveis genes alvo de miR-449a em células NSCLC, foram utilizados três algoritmos para analisar potenciais alvos de miR-449a: TargetScan 5,2 (Junho de 2011), Miranda (agosto de 2010 ) e Diana-microT (Julho de 2011). No potencial lista alvo, c-Met, que tem dois locais previstos com miR-449a ligação está implicada como um mediador chave da migração celular, invasão e metástase em tumorigénese e a progressão do tumor numa variedade de tumores incluindo NSCLC (Figura S2). Examinamos se c-Met foi regulamentada pelo miR-449a em amostras de tecido NSCLC e
in vitro
. Para determinar a relevância clínica do miR-449a e c-Met, foram selecionados 27 pares das 84 amostras de tecido NSCLC frescos com NAT emparelhados acordo com a média do nível de expressão de miR-449a em 84 tecidos amostras cancerosas, incluindo 13 miR-449a baixo expressadores e 14 miR-449a altas expressadores. Como mostrado na Figura 4 A B, transferências de Western foram realizadas para analisar o nível de expressão de c-Met em estas 27 amostras par, c-Met expressão foi significativamente mais elevada em tecidos com NSCLC em comparação com NAT (emparelhado t-teste,
P Art 0,001,
t
= 6,352), enquanto que miR-449a foi regulada para baixo no mesmo painel de tecidos NSCLC, como detectado no Resultado 1 (Figura 4C). Além disso, os tumores com baixo nível de miR-449a expressão revelou altas concentrações de c-Met, enquanto os tumores com nível de miR-449a alta expressão realizada baixas concentrações de c-Met (
P
= 0,037, Figura 4D) . Estes resultados indicaram que uma correlação inversa entre miR-449a e expressão de c-Met em amostras de tecido
A . B. Expressão de c-Met detectado por Western blot em 27 pares de amostras frescas NSCLC. β-actina foi utilizado como um controlo interno. A intensidade das bandas de proteína foram medidas, o eixo y de boxplot foi baseado em OD. Os valores de Western Blot. C. Expressão relativa de miR-449a no mesmo painel de 27 amostras emparelhadas NSCLC. D. Expressão de c-Met foi mostrado agrupados por o nível de expressão significativo de miR-449a em 84 amostras de tecidos cancerosos. A expressão de c-Met em miR-449a expressadores baixa foi superior expressores elevados de miR-449a. A intensidade das bandas de proteína foram medidas, o eixo y de boxplot foi baseado em OD. Os valores de Western Blot (
P
= 0,037).
Para determinar se miR-449a alvo c-Met
In vitro
, nós transfectadas células A549 e H1299 células com miR-449a imitar ou inibidor e detectado o nível de ARNm de c-Met utilizando RT-qPCR às 48 h após a transfecção. A sobre-expressão de miR-449a diminuiu significativamente ARNm de c-Met em comparação com os controlos, enquanto que a inibição de miR-449a resultou num aumento de ARNm de c-Met (Figura 5A). A análise por Western blot foi realizada para testar a expressão da proteína de c-Met. Os resultados mostraram a sobre-expressão de miR-449a levou a uma diminuição dramática na proteína c-Met, enquanto que a redução do miR-449a um aumento notável da proteína de c-Met (Figura 5B). Estes resultados indicaram que miR-449a regulada a expressão de c-Met em ambos os níveis de mRNA e proteína.
A. O efeito de miR-449a em ARNm de c-Met em células NSCLC. As células A549 /H1299 foram transfectadas com um controlo Mimic, um mímico de miR-449a, um controlo inibidor e um inibidor de miR-449a, em seguida, o RNA foi extraído e submetido a RT-qPCR. A quantidade relativa de c-Met, normalizado para p-actina, foram comparados com o grupo Mock com base na equação RQ = 2
-ΔΔCT. * P 0,01. B. O efeito do miR-449a em proteína c-Met em células NSCLC. As células A549 /H1299 foram transfectadas com um mímico de controlo, um mímico de miR-449a, um controlo inibidor e um inibidor de miR-449a. Após 48 horas, a proteína celular foi extraído e submetido a análise de transferência de Western de c-Met. β-actina foi utilizado como um controlo interno. locais de ligação C. miR-449a na 3’UTR de c-Met foi avaliada utilizando ensaios de repórter fluorescentes. Com um vector contendo c-Met 3′-UTR, células A549 foram transfectadas com um mímico de controlo, um mímico de miR-449a, um controlo inibidor e um inibidor de miR-449a, em seguida, a proteína foi extraída e a intensidade da fluorescência foi determinada. * P . 0,05
Para determinar se c-Met foi o alvo directo de miR-449a, foram realizados ensaios de repórter fluorescentes. A 3’UTR do c-Met com dois locais de ligação previstos para miR-449a foi clonado num vector repórter fluorescente. Como mostrado na Figura 5C, a regulação positiva de miR-449a reduziu a intensidade de fluorescência de EGFP em culas transfectadas com um vector contendo c-Met 3′-UTR em comparação com os controlos, enquanto que no grupo inibidor de miR-449a a intensidade de fluorescência de EGFP aumentou significativamente . Estes resultados indicam que o miR-449a liga-se a região C-Met 3’UTR directamente.
Para confirmar ainda mais se o miR-449a regulada migração e invasão por meio de direccionamento de c-Met, c-Met siARN foi usada para silenciar C expressão Met. A análise por Western blot foi usado para validar os resultados (Figura 6A). Com alterações jusante para MMP2 e MMP9 (Figura 6B), a co-transfecção de inibidor de miR-449a e c-Met siARN aboliu os efeitos de miR-449a sobre a migração e a invasão de células A549 (Figura 6C D). Estes resultados sugerem que miR-449a pode ser crucial na regulação da migração celular, invasão e metástases tumorais através visando o oncogene c-Met.
A. oligonucleótidos C-Met siRNA foram usadas para silenciar a expressão de c-Met, e foi verificado o efeito. As células A549 foram transfectadas com um controlo negativo e um siRNA de c-Met, a proteína celular foi extraído e submetido a análise de manchas de Western de c-Met. β-actina foi utilizado como um controlo interno. B. Co-transfecção de um inibidor de miR-449a e um siRNA de c-Met foi realizada em células A549. As células foram transfectadas com um controlo, um inibidor de miR-449a e um inibidor de miR-449a além de um c-Met siRNA, proteína a partir destas células foi extraído e submetido a análise de manchas de Western de c-Met. β-actina foi utilizado como um controlo interno. C. Os efeitos de miR-449a sobre migração e invasão em células A549 foram abolidos após co-transfecção. As células A549 foram transfectadas com um controlo, um inibidor de miR-449a e um inibidor de miR-449a além de um c-Met siRNA, em seguida, submetido a ensaios de migração e invasão como descrito na Secção 2. Migração /células invasivas foram fotografadas por fotografias representativas depois coloração com Hematoxilina. Ampliação original, × 200. D. Média migraram /número de células invasiva a partir de três experimentos independentes foi mostrado no gráfico de barras, a média ± SD. * P . 0,01
Discussão
Nós descobrimos que miR-449a foi significativamente regulada negativamente em tecidos NSCLC e linhas celulares, de acordo com o relatório que miR-449 foi reduzida em vários humana tumores e linhas celulares de cancro [16]. Além disso, Liang e colaboradores descobriram que o miR-449 foi detectado em pulmão humano, testículo, e as trompas de Falópio, mas não em outros tecidos humanos normais [22], [23]. Além disso, observou-se a regulação negativa de miR-449 em cancro gástrico. A expressão de miR-449 foi baixa ou indetectável em 8 de 10 tecidos de câncer gástrico, embora não foi observada correlação entre a redução na expressão de miR-449 e características clínicas de câncer gástrico nos 10 pares de tecidos [13]. Recentemente, Jeon e colegas descobriram que miR-449a /b reduziu expressão em tecidos de câncer de pulmão, com o HDAC1 gene alvo sobre-expressos a nível mRNA [15]. No entanto, dados de um grande exemplo de conjunto sobre o estado de expressão de miR-449 e sua relevância para características clínico-patológicas não são claras. Aqui, usamos 154 amostras de NSCLC (incluindo 84 amostras frescas e 70 FFPET amostras) para detectar a potencial relação entre o estatuto de miR-449a e várias características clínico-patológicas de expressão, bem como a sobrevivência de pacientes com NSCLC. De acordo com os resultados de RT-qPCR em 84 casos de tecidos NSCLC frescas e NAT emparelhados, miR-449a foi significativamente reprimidos no CPNPC comparação com NAT emparelhados. A análise estatística foi realizada, e um baixo nível de miR-449a parecia estar correlacionada com o estádio patológico avançado, e metástases em linfonodos. Para nosso conhecimento, a nossa análise indicou pela primeira vez que o miR-449a foi associado com a metástase de linfonodos. Além disso, os dados de 70 FFPETs indicou que pacientes com câncer de pulmão com baixa expressão de miR-449a teve mau prognóstico. análise de regressão multivariada de Cox mostrou que o baixo nível de miR-449a expressão foi independentemente associada com pior prognóstico, bem como de palco e de nódulos linfáticos avançados metástases patológicas. Estes resultados sugerem que o miR-449a pode ser um indicador de prognóstico útil independente de outros factores clinicopatológicas.
Os mecanismos moleculares precisos para a expressão alterada de miR-449 em tumores permanece desconhecido. A família miR-34 que compartilha a mesma sequência de sementes com miR-449 é tumor-supressora e metilado no cancro do pulmão [24], [25], [26]. Além disso, a expressão de miR-449 é inactivado por histona H3lys27 (H3K27mes) e revertida por drogas epigenética para modificações de histonas [16]. Tomados em conjunto, os eventos epigenética aberrantes pode ser importante nos mecanismos por detrás de miR-449 desregulação. MiR-449a é localizada no primeiro intrão do cromossoma 5q11 CDC20B em que é frequentemente um local de anormalidade no cancro do pulmão [27], [28].