Abstract

Fundo

O resveratrol, um composto phytopolyphenol que ocorre naturalmente, tem atraído grande interesse nos últimos anos devido às suas diversas características farmacológicas. Embora o resveratrol possui propriedades quimiopreventivos contra vários cancros, os mecanismos moleculares pelos quais ele inibe o crescimento celular e induz a apoptose ainda não são completamente compreendidos. O presente estudo foi realizado para examinar se via PI3K /AKT /FOXO medeia os efeitos biológicos do resveratrol.

Metodologia /Principais Achados

O resveratrol inibiu a fosforilação de PI3K, AKT e mTOR. Resveratrol, inibidores de PI3K LY294002 e wortmanina () e inibidor de AKT ligeiramente sozinho induziu apoptose em células LNCaP. Estes inibidores melhorado ainda mais o potencial de indução de apoptose de resveratrol. Superexpressão de tipo selvagem PTEN induzida ligeiramente apoptose. O tipo selvagem de PTEN e PTEN-G129E aumentada apoptose induzida pelo resveratrol, enquanto PTEN-G129R não teve nenhum efeito sobre os efeitos pró-apoptóticos de resveratrol. Além disso, o potencial de indução de apoptose de resveratrol foi reforçada por AKT dominante negativo, e inibida pelo do tipo selvagem AKT e AKT constitutivamente activa. Resveratrol tem nenhum efeito sobre a expressão de genes FKHR, FKHRL1 e AFX. A inibição da fosforilação FOXO pelo resveratrol resultou na sua translocação nuclear, ligação de ADN e a actividade de transcrição. A inibição da PI3K /Akt atividade transcricional FOXO induzida, resultando em indução de Bim, TRAIL, p27

/KIP1, DR4 e DR5, e inibição da ciclina D1. Do mesmo modo, a actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol foi ainda melhorada quando a activação da via PI3K /AKT estava bloqueada. A sobre-expressão da fosforilação de proteínas mutantes deficientes FOXO (FOXO1-TM, FOXO3a-TM e FOXO4-TM) a actividade de transcrição induzida FOXO, o qual foi ainda reforçada pelo resveratrol. A inibição de fatores de transcrição FOXO por shRNA bloqueada regulação positiva induzida pelo resveratrol de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/KIP1 e apoptose e inibição da ciclina D1 pelo resveratrol.

Conclusão /Significado

Estes dados sugerem que os fatores de transcrição FOXO mediar os efeitos anti-proliferativa e pró-apoptóticos de resveratrol, em parte devido à ativação da via apoptose extrínseca

Citation:. Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol induz a paragem do crescimento e apoptose através da ativação de fatores de transcrição FOXO em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10.1371 /journal.pone.0015288

editor: Irina Lebedeva, Enzo Vida Biosciences, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de setembro de 2010; Aceito: 04 de novembro de 2010; Publicação: 14 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto foi apoiado por uma bolsa (NIH R01CA114469 para RKS) dos Institutos Nacionais de Saúde (www.nih.gov). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata, uma das neoplasias mais comuns no mundo ocidental, surge através do desenvolvimento progressivo de uma ou mais lesões neoplásicas pré para adenocarcinoma, e, posteriormente, para a doença metastática [1]. Avanços recentes identificaram alterações genéticas importantes que podem iniciar a carcinogênese de próstata, e aumentar a probabilidade de progressão do cancro. células de câncer de próstata são apenas modestamente sensível ou até mesmo insensível aos efeitos citotóxicos de agentes quimioterapêuticos ou radioterapia. O aumento das concentrações de fármacos citotóxicos e doses mais elevadas de irradiação não conseguem melhorar a resposta a terapia e conduz a resistência à apoptose em células de cancro da próstata. Assim, é imperativo identificar agentes antineoplásicos que são não tóxicos e altamente eficaz na indução de apoptose em células de tumor preferencialmente.

Dados epidemiológicos suportam o conceito de que compostos que ocorrem naturalmente na dieta humana pode ser desprovido de toxicidade e têm longo duradoura efeitos benéficos sobre a saúde humana. O resveratrol foi mostrado exibir várias actividades quimioprotectores potenciais em modelos celulares e animais [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], incluindo a inibição da via PI3K /AKT [2], [6], [8], [10]. Temos demonstrado recentemente que Resveratol aumenta o potencial terapêutico de TRAIL por upregulating receptores de morte (TRAIL /DR4 e TRAIL-R2 /DR5) e também envolver via mitocondrial da apoptose [2], [3]. Deleção ou mutação de PTEN tem sido a principal causa para AKT constitutivamente activa levando a carcinogénese da próstata em seres humanos [11], [12]. Assim, o resveratrol pode ser candidato potencial a células com PTEN deleção ou inactivação da actividade de AKT e aumentada no tecido da próstata pré-cancerosas alvo.

sinalização PI3K desempenha um papel central em vias de transdução de sinal intracelulares envolvidos na transformação celular, crescimento celular, e tumorigênese. A inactivação dos resultados AKT em desfosforilação e activação de factores de transcrição FOXO, relatado para mediar a detenção do ciclo celular, a reparação do ADN, e a apoptose [13], [14]. Estes fatores de transcrição, pertence ao subgrupo ‘O’ da alado-hélice /forkhead-fator de transcrição da família, consistem principalmente de quatro membros FoxO1, FOXO3a, FOXO4 e FOXO6 [15]. proteínas FOXO são evolutivamente conservada fatores de transcrição envolvidos em vários processos celulares fundamentais, funcionando como ponto final para os programas de transcrição envolvidos na apoptose, resposta ao estresse e longevidade [16], [17], [18], [19], [20]. Revogação da função FOXO é frequentemente observada no câncer humano [17], [21], pois os mecanismos de regulação das proteínas FOXO estão recebendo cada vez mais atenção na pesquisa do câncer. As proteínas reguladoras FOXO integrar entradas a partir de uma variedade de vias de sinalização a montante, mais importante ainda, em resposta ao factor de crescimento e stress sinalização [17], [21]. Recentemente, factores FOXO foram estabelecidas como supressores tumorais, promovendo a transcrição de moléculas pro-apoptóticas como FasL e Bim quando a via PI3K /AKT é regulada negativamente devido ao nutriente ou privação de soro e stress celular [22], [23], [24 ]. modelos triplos rato knockout provaram as propriedades supressores de tumor de Foxos, como ratos, simultaneamente, faltando os principais membros da subfamília FOXO mamíferos, FOXO1, FOXO3a e FOXO4, são propensas a desenvolver hemangiomas e doenças linfoproliferativas [25]. Por outro lado, o indivíduo ou inactivação emparelhado de FOXO1, FOXO3a ou FOXO4 resultou em um fenótipo menos grave, apoiando a ideia de redundância funcional desses fatores FOXO [25]. Além disso, tem sido mostrado expressão forçada de FOXO para inibir a tumorigénese em modelos de xenoenxerto em ratinhos nus [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Portanto, a reactivação de FOXO com base nas suas propriedades supressoras de tumores é considerada como uma estratégia muito atraente anti-cancro. Desde que as proteínas FOXO foram relatados para ser mediadores críticos de apoptose induzida por fármacos anti-cancerígenos, postulamos que a expressão FOXO ou atividade transcricional pode ser evento importante na mediação dos efeitos do resveratrol.

Os objetivos do nosso estudo foram examinar a efeitos PI3K /Akt na regulação dos fatores de transcrição FOXO e seus produtos de genes alvo, e avaliar se via PI3K /AKT /FOXO regula efeitos anti-proliferativa de resveratrol em células cancerosas da próstata. Os nossos dados demonstraram que a inibição da via PI3K /AKT FOXO de ligação ao ADN e a actividade de transcrição melhorada, resultando na regulação dos seus produtos de genes (TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27

/KIP1 e ciclina D1). A inibição da via PI3K /AKT ou sobre-expressão de FKHR, FKHRL1 e AFX melhorada actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol. Em contraste, a inibição da FKHR, FKHRL1 ou AFX bloqueada a expressão induzida por resveratrol de TRAIL, DR4, DR5, Bim e p27, e inibiu a expressão de ciclina D1. Estes dados sugerem que o resveratrol induz a apoptose e parada de crescimento por meio da ativação de fatores de transcrição FOXO e inibição da via PI3K /AKT ativa fatores de transcrição FOXO e aumenta ainda mais antiproliferativa e efeitos pró-apoptóticos de resveratrol.

Resultados

a inibição da via PI3K /AKT intensifica a apoptose induzida pelo resveratrol em células de cancro da próstata

o primeiro examinados os efeitos da inibição farmacológica de Akt por LY294002, wortmanina ou inibidor de AKT na apoptose induzida pelo resveratrol em células LNCaP (Fig. 1A). Resveratrol apoptose induzida em células LNCaP. Da mesma forma, o LY294002, ou wortmanina AKT inibidor de apoptose induzida ligeiramente, mas significativamente. O pré-tratamento das células LNCaP com LY294002, wortmanina ou inibidor de AKT aumentou significativamente a apoptose induzida pelo resveratrol às 48 h. Estes dados sugerem que a inibição da actividade /AKT da PI3K pela abordagem apoptose induzida pelo resveratrol reforçada farmacológica.

(A), as células LNCaP foram pré-tratados com LY294002 (1 uM), wortmanina (1 uM) ou inibidor de AKT (100 nM) durante 2 h, seguido por tratamento com resveratrol (20 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, as células foram recolhidas e a apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. Os dados representam a média ± SE. *, # E ** = significativamente diferente do controle (P 0,05). (B), as células LNCaP foram transientemente transfectadas com vector vazio, PTEN-WT, PTEN-G129E ou PTEN-G129R. O meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com ou sem o resveratrol (20 uM) durante 48 h, e a apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. Os dados representam a média ± SE. *, **,% E $ = significativamente diferente do controle (P 0,05). (C), as células LNCaP foram transientemente transfectadas com vector vazio, WT-AKT, CA-AKT ou DN-AKT. O meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com ou sem o resveratrol (20 uM) durante 48 h, e a apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. Os dados representam a média ± SE. *, **, # E% = significativamente diferente do controle (P 0,05). (D), Efeitos de resveratrol na expressão de PI3K, AKT e mTOR. As células LNCaP foram tratadas com resveratrol (20 uM) para vários pontos de tempo. As transferências de Western foram realizadas com anticorpo anti-fosfo-PI3K, fosfo-AKT, anti-AKT e anticorpos fosfo-mTOR. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Os dados são representativos de três experiências.

O tumor PTEN gene supressor é muitas vezes inativado em cancros da próstata humanos. A inactivação de PTEN pode causar a fosforilação constitutiva e activação de AKT, levando a um crescimento celular aumentado e a progressão do tumor. Como as células LNCaP expressam AKT constitutivamente activa, buscou-se examinar o papel da via PI3K /AKT na apoptose induzida pelo resveratrol. As células LNCaP foram transfectadas com vector vazio ou plasmídeo que expressa tipo selvagem PTEN, PTEN-G129E, ou PTEN-G129R e incubadas na presença ou ausência de resveratrol (Fig. 1B). Resveratrol apoptose induzida em células LNCaP transfectadas com vector vazio. A transfecção de células LNCaP com PTEN tipo selvagem aumentou significativamente a apoptose induzida pelo resveratrol. A sobre-expressão de PTEN-G129E-G129R ou PTEN em células LNCaP significativamente o resveratrol inibiu a apoptose induzida do que as transfectadas com o tipo selvagem de PTEN. Estes dados sugerem que a inibição da actividade de AKT por sobre-expressão de PTEN aumenta o potencial de indução de apoptose de resveratrol.

Uma vez que a sobre-expressão de PTEN intensifica a apoptose induzida pelo resveratrol, que AKT expressão regulada por AKT tipo selvagem (WT-AKT), constitutivamente AKT ativa (CA-AKT) e AKT negativo dominante (DN-AKT). As células LNCaP foram transientemente transfectadas com vector vazio, WT-AKT, CA-AKT ou DN-AKT e tratou-se com ou sem o resveratrol (20 uM). A transfecção de células LNCaP com vector vazio, WT-AKT ou CA-AKT não teve nenhum efeito na apoptose (Fig. 1C). Resveratrol apoptose induzida em células transfectadas vector vazio. A sobre-expressão de WT-AKT ou CA-AKT em células LNCaP inibia a apoptose induzida pelo resveratrol. A sobre-expressão de DN-AKT sozinho induziu apoptose significativa. Curiosamente, a sobre-expressão de DN-AKT aumentada apoptose induzida pelo resveratrol. No geral, estes dados sugerem que a inibição da via PI3K /Akt por meios genéticos e farmacológicos intensificar a apoptose induzida pelo resveratrol em células de cancro da próstata.

Resveratrol inibe a fosforilação de PI3K e AKT

Desde PI3K /AKT via inibe a apoptose induzida pelo resveratrol, procurou-se analisar os efeitos do resveratrol sobre a fosforilação de PI3K e AKT (Fig. 1D). As células LNCaP foram tratadas com resveratrol e fosforilação de PI3K e AKT foi examinada por meio da análise de mancha de Western. O resveratrol inibiu a fosforilação de PI3K e AKT de um modo dependente do tempo. A fosforilação destas quinases foi abolida em 48 h. Resveratrol não teve efeito sobre a expressão de AKT total.

Desde mTOR é um down-stream de AKT, nós próxima procurou examinar se o resveratrol também regula a fosforilação de mTOR. Como mostrado na Fig. 1D, o resveratrol inibiu a fosforilação de mTOR. Estes dados sugerem que o resveratrol pode inibir a fosforilação de ambas as proteínas de PI3K /AKT e mTOR, e, assim, desempenhar um papel importante na mediação de efeitos anti-apoptóticos de resveratrol.

resveratrol não tem qualquer efeito sobre a expressão de FKHR, FKHRL1 e AFX, mas inibe a fosforilação de proteínas FOXO

via PI3K /AKT foi mostrado para regular a fosforilação de proteínas FOXO [33]. Por conseguinte, medida a expressão de genes FOXO por RT-PCR, e a fosforilação das proteínas FOXO por análise de Western blot. O resveratrol não teve efeito sobre a expressão de FKHR, FKHRL1 e AFX como medido por RT-PCR (Fig. 2A). A seguir, procurou examinar se resveratrol regula a fosforilação de proteínas FOXO. Como mostrado na Fig. 2B, o resveratrol inibiu a fosforilação de FKHR, FKHRL1 e AFX. Estes dados sugerem que o resveratrol pode inibir a fosforilação de proteínas, que são FOXO para baixo fluxo de AKT, e desfosforilação de FOXO pelo resveratrol pode resultar na sua activação através da translocação nuclear.

(A), Efeitos de resveratrol na expressão de FKHR, FKHRL1 e AFX. As células LNCaP foram tratadas com resveratrol (10 ou 20? M) durante 6, 12 ou 24 h. O ARN total foi isolado e a análise de RT-PCR foi realizada para medir a expressão de FKHR, FKHRL1 e AFX. (B) Efeitos de resveratrol na fosforilação de proteínas FOXO. As células LNCaP foram tratadas com resveratrol (20 uM) durante 0-48 h, e as análises de Western blot foram realizadas para medir a expressão de fosfo-FKHR, fosfo-FKHRL1 e fósforo-AFX. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), o resveratrol induz a translocação de FKHR ao núcleo. As células LNCaP foram semeadas em lâminas septadas e transfectadas com GFP-FKHR ou GFP-FKHR-TM (fosforilação deficiente mutante triplo). O meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com ou sem o resveratrol (20 uM) durante 24 h. As células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com DAPI e visualizados sob um microscópio de fluorescência. cor verde = FKHR, cor vermelha = núcleo (para maior clareza a cor do núcleo foi mudada de azul para vermelho), co-localização amarelo = de FKHR ao núcleo. (D), painel esquerdo, as células LNCaP foram tratadas com resveratrol (20 uM) para vários pontos temporais (0-24 h). Os extractos nucleares foram preparados e o experimento gelshift foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Pista apenas 1 = sonda, pistas 2-9 = resveratrol amostras tratadas, pista 10 = sonda fria (50 ×), e pista 11 = Sonda SP1 frio. Os dados são representativos de três experiências. Painel da direita, as células LNCaP foram não tratadas ou tratadas com resveratrol (20 uM) na presença ou ausência de LY (1 uM) ou inibidor de AKT (100 nM) durante 24 h. Os extractos nucleares foram preparados e o experimento gelshift foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. Pista 1 = sonda única, pista 2 = sonda fria (50 ×), pista 3 = SP1 frio, pista 4 = controle, pista 5 = resveratrol, pista 6 = LY, pista inibidor 7 = AKT, pista 8 = resveratrol mais LY, pista 9 = + resveratrol inibidor de AKT. Os dados são representativos de três experiências.

Resveratrol aumenta a translocação de tipo selvagem e mutante FKHR ao núcleo e melhora a interação do DNA FOXO

A seguir, examinou a translocação nuclear de FKHR pelo resveratrol usando tipo selvagem e construções de GFP-FKHR mutantes. As células LNCaP foram transfectadas com GFP-FKHR ou GFP-FKHR-TM (mutante triplo) e tratou-se com resveratrol durante 24 h (Fig. 2C). A translocação de tipo selvagem e mutante deficiente fosforilação FKHR foi observada por microscopia de fluorescência. Resveratrol induzida a translocação nuclear de ambos tipo selvagem e mutante FKHR. No entanto, a translocação nuclear de FKHR-TM foi muito mais elevado do que o tipo selvagem FKHR.

próxima examinada a interacção ADN-FOXO por ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA). Um ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) é uma técnica de electroforese de afinidade comum utilizada para estudar a interacção de ADN-proteína. O tratamento de células LNCaP com resveratrol resultou numa interacção ADN-FOXO melhorado (Fig. 2D, painel esquerdo). A incubação da sonda fria com o extrato nuclear resultou na actividade de ligação de DNA-FOXO reduzida. Por comparação, a incubação da sonda SP1 frio não específica não tinha efeito na ligação FOXO-ADN. A combinação de LY294002 ou inibidor AKT com resveratrol ligeiramente reforçada a actividade de ligação-DNA FOXO, do único agente sozinho (Fig. 2D, painel da direita). No geral, estes dados sugerem que o resveratrol pode aumentar a translocação nuclear FOXO e actividade de ligação a ADN.

de inibição da via PI3K /AKT e fosforilação de proteínas mutantes deficientes FOXO FOXO aumentar a actividade de transcrição induzida pelo resveratrol

próxima examinar se a inibição da via PI3K /AKT aumenta a actividade transcricional induzida FOXO-resveratrol em um ensaio de gene repórter de luciferase, que mede a função FOXO (Fig. 3A-C). Temos tido uma primeira abordagem farmacológica para inibir a actividade de PI3K /AKT utilizando Wortmannin, LY-294002, e inibidor AKT IV. A wortmanina, LY-294002, inibidor de AKT IV e o resveratrol sozinho induziu actividade de transcrição FOXO. Além disso, o tratamento de combinação de Wortmannin, LY-294002, ou inibidor de AKT IV com resveratrol reforçou ainda mais a atividade FOXO. Estes dados sugerem que a inibição da via PI3K /Akt actuar sinergicamente com resveratrol para induzir a actividade de transcrição FOXO.

(A), a inibição farmacológica de /Akt FOXO actividade induzida pelo resveratrol reforçada PI3K em células LNCaP. As células LNCaP foram transientemente transfectadas com 6X DBE-luciferase e pRL-TK plasmídeos, durante 24 h como descrito em outro lugar. Após a transfecção, as células foram pré-tratadas com wortmanina (10 uM), LY-294002 (10? M) ou inibidor de AKT IV (1? M) durante 2 h, seguido por tratamento com ou sem o resveratrol (20 uM) durante 24 h. As células foram recolhidas para ensaios de luciferase de pirilampo /Renilla usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega). contagens de luciferase foram normalizados utilizando

Renilla

controle de transfecção de luciferase. Os dados representam a média ± S.D. *, #, ** = Significativamente diferente do controlo, P 0,05. (B), a superexpressão da atividade FOXO dominante AKT negativo reforçada induzida pelo resveratrol. As células LNCaP foram transientemente transfectadas com 6X DBE-luciferase mais plasmídeos pRL-TK com WT-AKT, CA-AKT ou DN-AKT durante 24 h. Após a transfecção, as células foram pré-tratadas com resveratrol (20 uM) durante 24 h. As células foram recolhidas para ensaios de luciferase de pirilampo /Renilla usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega). contagens de luciferase foram normalizados utilizando

Renilla

controle de transfecção de luciferase. Os dados representam a média ± S.D. *, # E ** = significativamente diferente do controlo, P 0,05. (C), o Regulamento da actividade induzida pelo resveratrol FOXO por tipo selvagem ou mutante de PTEN. As células LNCaP foram transientemente transfectadas com 6X DBE-luciferase mais plasmídeos pRL-TK com PTEN-WT, PTEN-G129E ou PTEN-G129R durante 24 h. Após a transfecção, as células foram pré-tratadas com resveratrol (20 uM) durante 24 h. As células foram recolhidas para ensaios de luciferase de pirilampo /Renilla usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega). contagens de luciferase foram normalizados utilizando

Renilla

controle de transfecção de luciferase. Os dados representam a média ± S.D. *, , $ e ** = significativamente diferente do controle, P 0,05. (D), a fosforilação de mutantes deficientes FOXO aumentar a actividade transcricional induzida FOXO-resveratrol. As células LNCaP foram transientemente transfectadas com vector vazio ou construções que codificam FOXO1-TM, FOXO3a-TM, ou FOXO4-TM em conjunto com 6X DBE-luciferase e pRL-TK plasmídeos para 24 h. Após a transfecção, as células foram lavadas, tratadas com resveratrol (20 uM) durante 24 h, e colhidas para ensaios de luciferase de pirilampo /Renilla utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega). contagens de luciferase foram normalizados utilizando

Renilla

controle de transfecção de luciferase. Os dados representam a média ± S.D. * E ** = significativamente diferente do controle, P . 0,05

A seguir, examinou os efeitos da AKT sobre a atividade FOXO induzida pelo resveratrol em células LNCaP (Fig 3B.). A atividade de AKT foi regulamentada por tipo AKT selvagem (WT-AKT), constitutivamente AKT ativa (CA-AKT) e AKT negativo dominante (DN-AKT). As células LNCaP foram transientemente transfectadas com vector vazio, WT-AKT, CA-AKT ou DN-AKT e tratou-se com ou sem o resveratrol (20 uM). A transfecção de células LNCaP com vector vazio, WT-AKT, ou CA-AKT teve nenhum efeito sobre a actividade de transcrição FOXO. Por comparação, a transfecção de células com DN-AKT actividade de transcrição induzida FOXO significativa. Resveratrol, induzem a atividade transcricional FOXO em células transfectadas com vector vazio. A sobre-expressão de WT-AKT ou CA-AKT em células LNCaP inibia a actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol. Curiosamente, a sobre-expressão de DN-AKT melhorada actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol. No geral, estes dados sugerem que a inibição da actividade de AKT pela abordagem genética aumenta a atividade transcricional FOXO induzida pelo resveratrol em células de câncer de próstata.

Uma vez que as células LNCaP expressa PTEN mutante resultando em ativação constitutiva da AKT, procurou-se analisar o papel de PTEN em actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol (Fig. 3C). As células LNCaP foram transfectadas com vector vazio ou plasmídeo que expressa tipo selvagem PTEN, PTEN-G129E, ou PTEN-G129R e tratou-se com ou sem o resveratrol. PTEN-peso ligeiramente induzida atividade transcricional FOXO. Resveratrol induzida actividade de transcrição em células FOXO LNCaP transfectadas com vector vazio. A transfecção de células LNCaP com o tipo selvagem de PTEN ou PTEN-G129E aumentou significativamente a actividade de transcrição induzida FOXO-resveratrol. Por comparação, a sobre-expressão de PTEN-G129R em células LNCaP tinha actividade transcricional FOXO semelhante ao de células de LNCaP tratadas resveratrol /vector vazio. Estes dados sugerem que a inibição da actividade de AKT por sobre-expressão de PTEN aumenta a actividade transcricional FOXO.

próxima examinado se o resveratrol induz a activação transcricional de FOXO na presença ou ausência de FOXO1-TM, FOXO3a-TM, ou FOXO4- TM (fosforilação deficiente mutante triplo) (Fig. 3D). As células LNCaP foram transfectadas com o constructo repórter p6xDBE-luciferase na presença ou ausência de plasmídeos que expressam FOXO1-TM, FOXO3a-TM, ou FOXO4-TM. Após a transfecção, as células foram tratadas com resveratrol durante 24 h, e a actividade da luciferase foi medida. A transfecção de células com plasmídeos que expressam FOXO1-TM, FOXO3a-TM, ou FOXO4-TM actividade de transcrição induzida FOXO em comparação com o vector vazio (controlo). FOXO actividade transcricional induzida pelo resveratrol foi ainda melhorada na presença de fosforilação de mutantes deficientes FOXO1, FOXO3a, e FOXO4. Estes dados indicam que a ativação da transcrição FOXO fatores aumenta ainda mais a atividade transcricional FOXO induzida pelo resveratrol.

A inibição da via PI3K /AKT regula Bim, p27

/KIP1, ciclina D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5

a seguir, examinou o efeito de inibir a via PI3K /AKT na expressão de Bim, p27

/KIP1, ciclina D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5. Estes genes são alvos directos do factor de transcrição FOXO. As células LNCaP foram pré-tratados com LY-294002 ou inibidor de AKT IV, seguida por tratamento com resveratrol durante 24 h, e a expressão de Bim, p27, a ciclina D1, TRAIL, DR4 e DR5 foi medido por transferência de Western (Fig. 4). LY-294002 e AKT inibidor IV induzida a expressão de Bim, p27

/KIP1, TRAIL, DR4 e DR5, e inibiu a expressão da ciclina D1. O tratamento de células com resveratrol reforçado os efeitos da LY-294002 ou AKT inibidor IV na expressão de Bim, TRAIL, DR4 e DR5. No entanto, a combinação de LY-294002 ou inibidor de AKT IV com resveratrol teve nenhum efeito sobre a expressão de p27

/KIP1 e ciclina D1. Estes dados sugerem que a inibição da via PI3K /AKT pode regular a expressão de Bim, p27

/KIP1, ciclina D1, TRAIL, DR4 e DR5, que são alvos de transcrição de FOXO. Resverarol também pode regular a expressão destes alvos transcricionais FOXO.

células LNCaP foram pré-tratados com LY294002 (10 uM) ou inibidor de AKT (AKT-I, 1 uM) durante 2 horas e tratou-se com ou sem o resveratrol (20 ^ M) durante 48 h. As células foram colhidas para medir a expressão de Bim, p27

/KIP1, ciclina D1, TRAIL, DR4 e DR5 por análise de transferência theWestern. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

A inibição da expressão FOXO por shRNA inibe os efeitos antiproliferativos de resveratrol e bloqueada da caspase-3 da actividade induzida pelo resveratrol e apoptose

se o resveratrol induz a apoptose através da activação de factor de transcrição FOXO, a inibição de proteínas FOXO deveria bloquear os efeitos anti-proliferativos de resveratrol. As células LNCaP foram transfectadas com shRNA expressar FKHR, FKHRL1 ou AFX e tratadas com resveratrol (Fig. 5). O resveratrol na apoptose induzida LNCaP /FKHR mexidos, LNCaP /FKHRL1 mexidos e LNCaP /AFX mexidos células de uma forma dependente da dose (Fig. 5A). A inibição da FKHR, FKHRL1 ou AFX por shRNA bloqueado efeitos anti-proliferativos de resveratrol. Estes dados sugerem que o resveratrol inibe a viabilidade celular através da regulação dos factores de transcrição FOXO.

(A), a inibição do factor de transcrição por blocos FOXO shRNA efeitos anti-proliferativos de resveratrol. As células LNCaP foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX ou shRNA controlo scrambled respectivo e tratadas com resveratrol (20 uM) durante 48 h, e a viabilidade celular foi medida. (B), a inibição de factores de transcrição ou FOXO ROS (espécies reactivas de oxigénio) por NAC bloqueia a apoptose induzida pelo resveratrol. As células LNCaP foram transfectadas com uma mistura de plasmídeos que expressam FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA mais AFX shRNA ou controlo mexidos. Após a transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram pré-tratados com NAC durante 2 h, e tratou-se com resveratrol (20 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, a apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. (C), a inibição de factores de transcrição ou FOXO ROS por NAC bloqueia induzida pelo resveratrol actividade da caspase-3. As células LNCaP foram transfectadas com uma mistura de plasmídeos que expressam FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA mais AFX shRNA ou controlo mexidos. Após a transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram pré-tratados com NAC durante 2 h, e tratou-se com resveratrol (20 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, a actividade da caspase-3 foi medida de acordo com as instruções do fabricante.

próxima procurado para examinar se a inibição do efeito de expressão induzida FOXO-resveratrol caspase-3 e apoptose actividade (Fig . 5B e C). O resveratrol induziu a actividade da caspase-3 e apoptose em células LNCaP /mexidos. O pré-tratamento de LNCaP /células mexidos com NAC inibiu a actividade induzida pelo resveratrol caspase-3 e apoptose. A inibição da expressão FOXO por shRNA resveratrol inibida induzida a actividade da caspase-3 e apoptose. Interessantemente, o pré-tratamento de LNCaP /células FOXO shRNA com NAC bloqueada da actividade induzida pelo resveratrol caspase-3 e apoptose. Estes dados sugerem que o resveratrol, induzem a atividade da caspase-3 e apoptose através da geração de ROS, e inibição da FOXO (FKHR, FKHRL1 e AFX) inibe a atividade da caspase-3 e apoptose.

Regulamento do Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/KIP1 e ciclina D1 por genes FOXO (FKHR, FKHRL1 e AFX)

fatores de transcrição FOXO foram mostrados para regular genes relacionados com o ciclo de apoptose e celulares [14], [34]. Desde resveratrol regulada a expressão de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/KIP1 e ciclina D1, procurou-se analisar se esses efeitos do resveratrol são mediadas através de fatores FOXO de transcrição que foram inibidas por shRNA (Fig. 6). Resveratrol induzida a expressão de Bim (Bim

EL, Bim

L e Bim

S), TRAIL, DR4, DR5 e p27

/KIP1, e inibiu a expressão de ciclina D1 em LNCaP /mexidos células. A inibição da FKHR, FKHRL1 ou AFX por shRNA atenuado induzido pelo resveratrol Bim, TRAIL, DR4, DR5 e p27

expressão /KIP1. Por comparação, a inibição da FKHR, FKHRL1 ou AFX por shRNA atenuou ligeiramente os efeitos inibidores de resveratrol na expressão de ciclina D1. Estes dados sugerem que o resveratrol pode regular a apoptose (Bim, TRAIL, DR4 e DR5) e os genes relacionados com o ciclo celular (p27

/KIP1, e ciclina D1) por meio de fatores de transcrição FOXO. Curiosamente, a indução de TRAIL e seus receptores DR4 e DR5 por resveratrol resultará na activação da via extrínseca da apoptose.

(A), as células LNCaP foram transfectadas com plasmídeos expressando FKHR shRNA controlo ou mexidos. Após a transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com resveratrol (0-20 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, as células foram colhidas para medir a expressão de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 e ciclina D1 através da análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B), as células LNCaP foram transfectadas com plasmídeos expressando FKHRL1 shRNA controlo ou mexidos. Após a transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com resveratrol (0-20 uM) durante 48 h. No final do período de incubação, as células foram colhidas para medir a expressão de Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27 e ciclina D1 através da análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), as células LNCaP foram transfectadas com os plasmídeos que expressam AFX shRNA controlo ou mexidos. Após a transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram tratadas com resveratrol (0-20 uM) durante 48 h.