Abstract

Fundo

Existe pouca informação sobre os mecanismos pelo que contribuem para a carcinogénese miARNs pulmonar. O presente estudo foi realizado para examinar a expressão ea função dos miRNAs induzidos pela fumaça do cigarro condensado (CSC) em células epiteliais e de cancro do pulmão respiratórias humanas normais.

Metodologia

Micro-array e RT- quantitativa As técnicas de PCR (qRT-PCR) foram utilizados para avaliar a expressão do gene e miARN hospedeira em cultura de células, e os espécimes cirúrgicos. análise guiado por software, ARN reticular imunoprecipitação (CLIP), ensaios de repórter de luciferase ‘UTR 3, qRT-PCR, focado super-matrizes e Western Blot foram usadas para identificar e confirmar alvos de miR-31. imunoprecipitação da cromatina técnicas (chip) foram utilizados para avaliar as marcas de histonas e factores de transcrição no promotor LOC554202. contagem de células e de xenotransplante experimentos foram utilizados para avaliar os efeitos de miR-31 sobre a proliferação e tumorigenicidade de células de câncer de pulmão.

Resultados

CSC aumentou significativamente miR-31 expressão e LOC554202 ativado em epitélio respiratório normal, e células de câncer de pulmão; miR-31 e expressão LOC554202 persistiu após a interrupção da exposição CSC. Os níveis de expressão LOC554202 miR-31 e foram significativamente elevados em amostras de cancro de pulmão relativamente aos tecidos pulmonares normais adjacentes. Os ensaios de clipe e repórter demonstrado interacção directa de miR-31 com Dickkopf-1 (DKK-1) e DACT-3. A sobre-expressão de miR-31 diminuiu marcadamente Dkk-1 e os níveis de expressão DACT3 em células epiteliais respiratórias e cancro do pulmão normais. Knock-down de miR-31 aumentou níveis Dkk-1 e DACT3, e diminui revogada CSC-mediadas em DKK-1 e expressão DACT-3. Além disso, a sobre-expressão de miR-31 diminuiu SFRP1, SFRP4, WIF e-um, e aumento da expressão de Wnt-5a. CSC aumentou H3K4me3, H3K9 /14Ac e os níveis de C /EBP-beta dentro do promotor LOC554202. Knock-down de C /EBP-β revogada activação CSC-mediada de LOC554202. A sobre-expressão de miR-31 melhorou significativamente a proliferação e a tumorigenicidade de células de cancro do pulmão; knock-down de miR-31 inibiu o crescimento destas células.

Conclusões

A fumaça do cigarro induz a expressão de miR-31 direcionamento vários antagonistas de sinalização de células-tronco cancerígenas no epitélio respiratório normal e células de câncer de pulmão . miR-31 funciona como uma oncomir durante a carcinogênese pulmonar humana

Citation:. Xi S, Yang M, Tao Y, Xu H, Shan J, Inchauste S, et al. (2010) fumo do cigarro induz C /EBP-β-Mediated Ativação de miR-31 em Normal Human Epitélio respiratório e câncer de pulmão de células. PLoS ONE 5 (10): e13764. doi: 10.1371 /journal.pone.0013764

editor: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-Universidade de Munique, Alemanha |

Recebido: 01 de junho de 2010; Aceito: 04 de outubro de 2010; Publicação: 29 de outubro de 2010

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of fundos intramurais Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

genética, bem como a desregulação epigenética da expressão gênica durante a transformação maligna é atribuível em parte à expressão aberrante de micro-RNAs (miRNAs) [1], [2]. Estes pequenos (~21-mer) moléculas de ARN não codificantes regular a expressão do gene através da ligação a regiões não traduzidas ‘(3’ UTR 3) de mRNAs alvo, provocando a degradação ou repressão de transcrição de translação, dependendo do grau de complementaridade entre a sequência da semente miARN e o motivo de ARNm [3]. Aproximadamente 30% de todos os mRNAs são alvos potenciais de miRNA. Até à data, mais de 800 miARNs foram identificados em seres humanos, cada um dos quais tem como alvo vários genes relacionados com funcionalmente, mediando assim redes de regulação complexos [3], [4].

Uma variedade de miARNs têm sido implicados em a patogênese dos cancros do pulmão humanos, a grande maioria das quais são directamente atribuíveis ao tabagismo [5], [6]. Alguns destes função miARNs como oncogenes (oncomirs), enquanto que outros funcionam como supressores de tumores. Por exemplo, o miR-21, que é activado em parte, através da sinalização de EGFR reprime a expressão aberrante de PTEN e PDCD4, facilitando a proliferação, invasão e resistência à apoptose de células de cancro do pulmão [7] – [11]. Activação de miR-93, 98-miR-197 e miR inibe a expressão de FUS1, aumentando a progressão do ciclo celular e quimio-resistência em células de cancro do pulmão [12], [13]. A repressão do miR-15A e miR-16, que têm como alvo ciclinas D1, D2 e ​​E, ab-roga a regulação Rb mediada pelo ciclo celular em células de cancro do pulmão [14]. Além disso, a infra-regulação de let-7 membros da família de segmentação numerosos mRNAs que codificam as proteínas reguladoras do ciclo celular, tais como Ras, AURKA, AURKB e E2F5 aumenta a proliferação e tumorigenicidade de células de câncer de pulmão [7], [15], [16]. Curiosamente, várias alterações de miARN frequentemente observadas em cancros do pulmão, tais como a sub-regulação de deixar-7 e a sobre-expressão de miR-17-92, são detectados em células estaminais do cancro [17], [18], bem como no parênquima pulmonar pseudoglandular [19], sugerindo uma reprogramação embrionária de expressão miRNA durante a carcinogênese pulmonar.

Apesar de estudos recentes que demonstram perfis de expressão de miRNA correlacionando com a histologia do tumor, bem como tabagismo e prognóstico de pacientes com câncer de pulmão primário, [6], [20] – [22], há poucos dados disponíveis sobre alterações miRNA que contribuem diretamente para iniciação e progressão precoce destas doenças malignas. No presente estudo, utilizou-se um sistema de modelo in vitro para analisar alterações de miARN mediadas pelo fumo do cigarro condensado (CSC) no epitélio respiratório humano normal, e as células do cancro do pulmão derivados de fumantes, bem como os não fumadores. Relata-se que a CSC induz a expressão de miR-31 direcionamento vários antagonistas de sinalização Wnt, incluindo Dickkhopf-1 (DKK-1) e DACT3 no epitélio respiratório humano normal, assim como células de câncer de pulmão. Estas observações fornecem uma ligação mecânica direta entre o fumo do cigarro e ativação de um oncomir suprimindo antagonistas de sinalização de células-tronco durante a carcinogênese pulmonar induzida por tabaco.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e condições de tratamento

Todas as linhas de cancro de pulmão foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) e mantidas em meio RPMI suplementado com 10% de FCS, 10 mM de ácido glutâmico, e 1% de penicilina /estreptomicina. As células primárias humanas normais pequenas epiteliais das vias aéreas (SAEC) e células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE) foram obtidos a partir de Lonza, Inc (Frederick, MD), e cultivados conforme as instruções do fornecedor. células epiteliais brônquicas humanas imortalizadas (HBEC) foram generosamente fornecidos por John D. Minna (University of Texas Southwestern, Dallas, TX), e cultivadas em meios completos de queratinócitos-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com factor de crescimento epidérmico 5 ug /L ( EGF) e 50 mg /L de extracto de pituitária de bovino (BPE). condensados ​​de fumo de cigarro (CSC) derivados do Kentucky Referência 3R4F cigarros mistura pesquisa (Universidade de Kentucky) foram preparados como anteriormente descrito [23], e ressuspensas a uma concentração de 1 mg de alcatrão /mL em meio RPMI, a qual foi definida como 10% CSC [24 ]. Para as experiências de exposição ao fumo, as células foram cultivadas em placas de 10 cm em meios normais adequados (NM) com ou sem CSC (1%). O meio foi mudado diariamente com a adição de CSC fresco. As células foram subcultivadas, conforme necessário, e colhidas em vários pontos de tempo para análise.

Os tecidos humanos

espécimes câncer de pulmão primário e histologicamente adjacente parênquima pulmonar normal foram colhidas no intra-operatório de pacientes submetidos potencialmente curativa ressecções sobre NIH revisão interna protocolos aprovados pela Diretoria, requerendo consentimento informado por escrito. Todos os tecidos foram imediatamente congelados instantaneamente com uma porção de tecido colhidas enviado para confirmação histológica imediato por um patologista independente, anatómica de modo cego. As amostras de tecido foram e armazenado no Laboratório de Oncologia Torácica, com código de barras ramo Cirurgia, NCI. Para o isolamento microARN e análise de expressão, a fracção de ARN pequeno foi isolado com o kit de isolamento de RT2 qPCR-Grau miARN (Qiagen; Valência, CA), e expressão de miARN foi quantificada com a detecção de miARN Kit de qRT-PCR (ABI; Carlsbad, CA) .

miRNA superexpressão e inibição

Precursor e inibidor miRNAs PMIR-H31PA-1, o controle pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP negativo, MZIP31-PA-1, controle negativo pGreenPuro Scramble Hairpin foram adquiridos de SBI (Sistema Biosciences, mountain View, CA). miARN precursores ou inibidores (ambos a 50 nM) foram transfectadas em células utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

vectores repórter e construções de ADN

3 ‘UTRs de DKK1 (850 pb) e DACT3 (2461 pb) foi amplificado por PCR a partir de ADNc humano SAEC, e inserida a jusante do CMV-luciferase conduzido cassete Firefly no vector PMIR-REPORT (Ambion, Austin, TX) entre

Hind III

e

Spe I

sites. plasmídeos repórter mutante (3 ‘UTRs de DKK1 e DACT3) foram criados usando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Wilmington, DE). Todos os fragmentos de inserção foram confirmadas por sequenciação directa.

ensaios de repórter de luciferase alvo de miRNA

Para a validação alvo miRNA, cerca de 2 × 10

4 células SAEC por poço em placas de 24 poços foram transitoriamente transfectadas com 25 a 50 ng de cada uma construção repórter de luciferase de pirilampo (Promega, Madison, WI), 150-175 ng de vector pcDNA3 vazio, 200 ng PRTK-Luc (Promega) como controlo interno, e 30 pmol de pré-miR-31 (SBI, mountain View, CA). Luciferase de Renilla vector foi usado para normalizar a eficiência da transfecção. Aproximadamente 24 horas após a transfecção, as actividades da luciferase Renilla pirilampo e foram ensaiadas. unidades de luz relativas normalizadas representam a actividade da luciferase do pirilampo actividade /luciferase de Renilla.

Os ensaios de proliferação

As células foram plaqueadas a uma concentração de 5 × 10

4 culas por po em placas de 24 poços e cultivadas em nm, com ou sem a CSC mais transfecção de plasmídeo. Triplicado poços foram colhidas e contadas por meio de técnicas de exclusão de azul de tripano.

RT-PCR quantitativo

para o ARNm, ARN total foi preparado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) e o ADN genómico foi eliminado com ADN TURBO Kit livre (Ambion). Um? G de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando a transcriptase reversa iScript (Bio-Rad). A omissão de transcriptase reversa serviu como um controlo negativo. O ADNc foi amplificado utilizando Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). A PCR foi realizada como se segue: 5 min a 94 ° C, 35 ciclos de 60 s a 94 ° C, 60 s a 57-60 ° C, e 60 s a 72 ° C, seguido de 5 min a 72 ° C. Análise em tempo real quantitativa de RT-PCR foi realizada como descrito [25] utilizando Dkk-1, DACT3, SFRP1, SFRP4, WIF-1, e iniciadores de p-actina a partir de Applied Biosystems ou tecnologias de ADN integrado (Coralville, IA). Para o isolamento do microRNA e análise de expressão, expressão de miRNA isolado com o kit de isolamento RT2 qPCR-Grade miRNA (Qiagen) foi quantificada com a Detecção de miRNA Kit qRT-PCR (ABI).

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

As células foram reticuladas com formaldeído a 1%, lisadas e sonicada em gelo para gerar fragmentos de ADN com um comprimento médio de 200-800 pb [26]. Depois de pré-limpeza, 1% de cada amostra foi guardada como fracção de entrada. A imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos que reconhecem especificamente H3K4me3, H3K9ac, H3K14Ac (Abcam), ARN polimerase II (Upstate) ou controlo de IgG. O ADN foi eluído e purificado a partir de complexos, seguida de amplificação por PCR do promotor LOC554202 utilizando iniciadores e condições, como descrito [27].

siRNA e shRNA knockdown

células Calu-6 e H841 foram transientemente transfectadas com ARNsi de segmentação C /EBP-α e C /EPB-β, ou sequências de siRNA sham (Dharmacon, Lafayette, CO) utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). silenciamento de genes alvo foi confirmada através de técnicas de Western blot e RT-PCR.

análise Western blot

Os extractos de proteína foram geradas como previamente descrito [26]. As amostras foram separadas em geles de 4-12% de electroforese em gel de Tris-glicina SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas Immobilon P de membrana (Millipore, Billerica, MA); proteínas foram detectadas utilizando reagentes de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Os anticorpos usados ​​para a análise de Western foram cabra anti-Dkk-1, de ratinho anti-DACT3, e de cabra anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA).

matrizes de RT-PCR

sinalização Wnt RT-PCR super-matrizes (HAP-043A) foram obtidos a partir de SABiosciences (Frederick, MD). 1 ug de ARN total foi utilizado para a transcrição reversa e de toda a reacção de ADNc foi diluída e distribuído entre as 96 cavidades da placa de super-matriz. As reacções foram realizadas com RT

2 SYBR Green /ROX PCR Master Mix (SABiosciences). Os resultados foram analisados ​​usando o software fornecido pelo fornecedor https://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.

MicroRNA microarray análise

RNAs de baixo peso molecular (pequenos RNAs) foram extraídos placas de células utilizando um estojo de isolamento miRvana ™ miARN (Ambion, Austin, TX) usando o método de enriquecimento de miARN de acordo com o protocolo do fabricante. Trezentos nanogramas de pequenos RNAs de amostras de tecido foram marcadas directamente com kit de miRNA N-code rotulagem (Invitrogen) por protocolos do fornecedor. Resumidamente, miARNs maduros nas amostras de RNA foram primeiramente pequenas atado com poli (A); poli (A) atado miARNs foram então marcadas com uma sequência de captura seguido por hibridação com Cy5 /Cy3 marcado dendrímeros 3DNA. Para o processamento de dados de microarray e normalização, os chips de microarray foram digitalizados usando um scanner GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA) e intensidades ponto mediano foram gerados usando GenePix 5.0 (Axon Instruments, Union City, CA). dados de microarray foram processados ​​e normalizado (50%) usando GeneSpring (Agilent, CA). análises estatísticas e de agrupamento foram realizadas utilizando software GeneSpring. Os níveis de expressão de miRNAs foram submetidos à análise de 2 vias de variância (Anova) para CSC tratados vs condições não tratadas para as várias linhas celulares.

CLIP Ago (Identificação de mRNAs AGO-1-associado)

As células foram colhidas e as experiências foram realizadas CLIP usando família anti-atrás, ou anticorpos elF2C como descrito (28). Resumidamente, as células foram reticulados com irradiação de 400 mJ /cm

2 e adicional de 200 mJ /cm

2 em Stratalinker, e lisaram-se para gerar ARN /proteína (atrás) complexos de [28] – [30]. Depois de pré-limpeza, 1% de cada amostra foi guardada como fracção de entrada. A imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos específicos contra qualquer família atrás (Millipore, Billerica, MA), ou elF2C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ou IgG de controlo. O ARN foi isolado e purificado a partir de complexos, seguida de amplificação por PCR de 3 ‘UTR de miR-31 alvos.

experiências de xenoenxerto de murinos

células Calu-6 e H358 transfectadas com CMV-pCDH-MCS de controlo e o vector -EF1-copGFP PMIR-H31PA-1 foram suspensas em PBS a uma concentração de 1 × 10

6 células /100 uL, e inoculados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus contralaterais atímicos (10 ratinhos por grupo de tratamento por experiência ). Os ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana e os volumes dos tumores foram calculados com base nos diâmetros perpendiculares. Cerca de 21 dias e 35 dias mais tarde para Calu-6 e experiências H358, respectivamente, os ratinhos foram sacrificados e avaliados para tomada percentual de tumor, e a massa de xenoenxertos excisadas. Posteriormente, os tecidos de tumor foram congeladas rapidamente em azoto líquido, e armazenado para análise futura. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Instituto Nacional do Câncer, e estavam de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

Análise Estatística

As diferenças entre correspondida amostras dos mesmos pacientes com câncer de pulmão, como o tumor e tecido normal foram testadas com o teste de sinais com posto. Os grupos foram comparados com o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. intervalos de confiança para as diferenças de medianas entre dois grupos foram computados pelos métodos corrigido-bias e bootstrapping acelerado. As diferenças nos volumes dos tumores entre os flancos opostos de ratinhos portadores de tumor foram testados com o teste de classificações de Wilcoxon-assinado, a intervalos de 5 dias.

P valores

foram ajustados para testes múltiplos por reamostragem completa [31]. intervalos de confiança para a mediana das diferenças de flanco foram computados como intervalos de confiança exatos não paramétricos bicaudais com base no Wilcoxon signed-rank.

Primer Sequências

Enviado como Tabela S1.

resultados

Up-regulação do miR-31 em células em cultura expostas a CSC

As experiências preliminares usando técnicas de matriz foram realizados para examinar perfis de expressão miRNA em um painel de epitélio respiratório normal ( SAEC e NHBE), imortalizado células humanas epiteliais brônquicas (HBEC) e células do cancro do pulmão (Calu-6, H841, H1299, H1650, H1975 e) cultivadas em meio normal com ou sem CSC. Esta análise revelou perfis de expressão únicas basais miRNA coincidindo com a histologia (normal vs maligno). Além disso, as linhas de cancro do pulmão derivados de fumantes (Calu-6, H1299, H841) foram prontamente diferenciadas das dos não-fumantes (H1650, H1975) (M. Yang, manuscrito em preparação).

De particular interesse , acima mencionados experiências de micro-arranjo sugerido que o tratamento CSC induzida expressão de miR-31 em epitélio respiratório normal, bem como células de cancro do pulmão. Para investigar ainda mais este fenómeno, RT-PCR quantitativo experiências (qRT-PCR) foram realizadas para examinar o miR-31 de expressão em SAEC, HBEC, Calu-6, e H841 células cultivadas em meio normal (NM), com ou sem a CSC durante 5 dias . Estas experiências (Figura 1A) demonstraram que não tratada Calu-6 e H841cells exibiram níveis endógenos mais elevados de miR-31 relativamente a células SAEC e HBEC; análise adicional revelou que cinco dias de exposição CSC-regulada miR-31 expressão 5,5 vezes e 3,6 vezes na SAEC e HBEC, respectivamente em relação aos controles. Um tratamento similar aumentou miR-31 de expressão de 3,1 e 6,5 vezes em Calu-6 e células H841, respectivamente (Figura 1B). Tempo experimentos curso revelou-regulação de miR-31 em SAEC e H841 células dentro de 24 h após o início da exposição CSC, com expressão pico e estabilizando cerca de 96 h depois (Figura 1C). Curiosamente, a sobre-regulação de miR-31 por CSC persistiu durante 20 dias após a remoção de CSC a partir de meios de cultura (Figura 1B).

A) análise de qRT-PCR de endógena miR-31 de expressão de controlo normalizado com miARN ( RNU44) em SAEC, HBEC, Calu-6, e H841cells. níveis basais de miR-31 são mais elevados em cancros do pulmão em relação a células respiratórias cultivadas normais ou imortalizadas humanas epiteliais. B) Análise de qRT-PCR de miR-31 de expressão em SAEC, HBEC, Calu-6, e H841cells cultivadas em meio normal (NM), com ou sem a CSC durante 5 dias. Aumento da expressão de miR-31 foi evidente 20 dias após a descontinuação do tratamento CSC. Análise C) qRT-PCR demonstrando a activação dependente do tempo do miR-31 em SAEC e H841cells cultivadas em nm, com ou sem a CSC durante 0, 12, 24, 48, 72, 96, e 120 horas. D) Análise de qRT-PCR demonstrando miR-31 de expressão em cancros do pulmão humanos relativos aos tecidos pulmonares normais adjacentes emparelhados. miR-31 em níveis mais elevados do que os tumores eram de pulmão normal correspondente. Além disso, o miR-31 níveis foram significativamente maiores nos cancros do pulmão de ativos /ex-fumantes em comparação às de nunca fumaram.

miR-31 expressão em amostras de câncer de pulmão primário

adicionais experimentos de qRT-PCR foram realizadas para examinar o miR-31 os níveis de expressão de um painel seleccionado aleatoriamente dos cancros do pulmão de células não-pequenas primárias e parênquima adjacente histologicamente normais de pulmão (dados clínicos e patológicos resumidos na Tabela 1). Tal como mostrado na Figura 1D, o miR-31 de expressão foi aumentado (média de 4,13 vezes; gama 1,47-12,46 vezes) em cancros do pulmão relativamente aos tecidos pulmonares normais emparelhadas. Curiosamente, miR-31 níveis em cancros do pulmão de fumantes foram maiores do que os observados em não fumantes (5,2 vs 1,65 vezes, respectivamente; p 0,01). Colectivamente, estes dados confirmam experiências preliminares demonstram níveis mais elevados de miR-31 de expressão em células de cancro do pulmão em relação ao epitélio respiratório normais em cultura (Figura 1A), e sugeriu que a activação de miR-31 pode ser um fenómeno biologicamente relevante durante a carcinogénese pulmonar humana.

Efeitos de miR-31 em antagonistas de sinalização Wnt

análise guiada por Software demonstrou que vários antagonistas de sinalização Wnt incluindo Dkk-1 [32] e DACT3 [33] eram potencial miR-31 alvos. Para confirmar estes resultados, SAEC, HBEC, Calu-6, e células H841 foram transientemente transfectadas com o miR-31. experiências de RT-PCR quantitativa revelou -12 aumentos de dobragem em miR-31 de expressão em células de miR-transfectadas com 31 relativos aos controlos vetor (Figura 2A). A sobre-expressão de miR-31 diminuiu Dkk-1, bem como DACT3 (~5-8 dobra e ~1.5-7 vezes, respectivamente, em relação aos controlos) nestas quatro linhas de células (Figuras 2B). Estes efeitos apareceu um pouco mais pronunciada na SAEC normal e imortalizado HBEC, possivelmente devido a menores níveis de endógena miR-31 e níveis mais elevados de Dkk-1 e DACT3 nestas células em relação a células de câncer de pulmão Calu-6 e H841.

a) miR-31 foi sobre-expresso em SAEC, HBEC, Calu-6, e H841 células através de transfecção transiente de primários de miR-31 construtos. qRT-PCR análise confirmou elevado nível de miR-31 de expressão em-miR-31 transfectadas em relação às células de controlo. B) Análise de qRT-PCR de Dkk-1 e expressão em níveis DACT3 SAEC, HBEC, Calu-6, e células H841 com ou sem sobre-expressão de miR-31. A sobre-expressão de miR-31 diminuiu Dkk-1 e DACT3 em todas as quatro linhas celulares. C) qRT-PCR A análise demonstra uma diminuição dos níveis de miR-31 endógeno em SAEC, HBEC, Calu-6, e as células H841 após a transfecção transiente de anti-sentido-miR-31 (CP miR-31) constrói em relação aos controlos. D) Análise de qRT-PCR de Dkk-1 e expressão DACT3 níveis em células SAEC, HBEC, Calu-6 e H841, com ou sem a sub-regulação de miR-31. Knock-down de miR-31 aumenta os níveis basais de Dkk-1 e DACT3 nestas células. análise E) qRT-PCR demonstrando que knockdown de miR-31 bloqueia parcialmente diminuições de Dkk-1 e CSC-DACT3 mediada em SAEC. F) Análise de Western blot de expressão Dkk-1 e DACT3 no controlo parental e vector SAEC e Calu-6 células, bem como a SAEC e Calu-6 células que exibem expressão over-constitutivo ou knock-down de miR-31. Os valores de densitometria são normalizados para controle de b-actina. DKK-1 e nível DACT3 foram diminuídas, ou um pouco reforçada nestas células após a sobre-expressão, ou knock-down de miR-31, respectivamente.

experimentos subsequentes foram realizadas para determinar se o esgotamento dos endógena miR-31 afectada expressão de Dkk-1 e DACT3 em células epiteliais respiratórias em cultura. Tal como mostrado na Figura 2C, o miR-31 os níveis de expressão foram reduzidos ~7-10 vezes na SAEC, HBEC, Calu-6, e células H841 transientemente transfectadas com anti-sentido-miR-31 (CP miR-31) constrói em relação ao controle de vetores . Redução de miR-31 aumentou a expressão Dkk-1 bem como a expressão DACT3 nestas linhas celulares (~1.47-8 dobrar e ~4.7-9 vezes, respectivamente; Figura 2D). Experiências subsequentes revelaram que knockdown de miR-31 atenuou significativamente a diminuição CSC-mediadas em DKK-1 e DACT3 em SAEC, bem como células H841 (Figura 2E). Consistente com os resultados acima mencionados, a análise de Western blot revelaram que os níveis de proteína Dkk-1 e DACT3 em SAEC e células Calu-6 foram reduzidas por sobre-expressão de miR-31 (Figura 2F). Em contraste, knock-down de endógena miR-31 pareceu aumentar os níveis de proteína Dkk-1 e DACT3 em SAEC e células Calu-6, embora estas alterações não se correlacionou com precisão com alterações na expressão de ARNm, possivelmente devido, em parte, às proteínas de estabilidade e de anticorpos afinidades. Coletivamente, essas experiências sugerem fortemente que o miR-31 modula Dkk-1 e DACT3 através de mecanismos pós-transcricional e translacional-inibitórios nas células epiteliais e de cancro do pulmão respiratórias normais cultivadas.

Super-matrizes foram usadas para continuar a analisar a efeitos de miR-31 sobre a sinalização de Wnt na SAEC e células Calu-6. Esta análise revelou 7-14 vezes a sub-regulação de Dkk-1, bem como antagonistas de sinalização Wnt adicionais incluindo SFRP1, SFRP4, e WIF1, bem como um aumento de 5 vezes na CTNNB1, TCF7 e Wnt-5a (dados disponíveis sobre pedido). Subsequentes experiências de qRT-PCR confirmou repressão da SFRP1, SFRP4 e WIF-1 e aumento da regulação do Wnt-5a na SAEC e Calu-6 células sobre-expressão de miR-31 (Figura S1A). Colectivamente, estes dados sugerem que miR-31 activa a sinalização Wnt no cancro do pulmão cultivadas e células epiteliais respiratórias normais.

Dkk-1 e DACT3 são candidatos alvo directo de miR-31

experimentos adicionais foram comprometeu-se a examinar se o miR-31 interage diretamente com 3 ‘UTRs de Dkk-1 e DACT3. Resumidamente, as técnicas de ARN reticular de imunoprecipitação (CLIP) foram usados ​​para detectar a interacção de miR-31 com estes alvos potenciais em células SAEC [28]. A Figura 3A mostra os locais potenciais miR-31 vinculativa dentro das UTRs 3 de transcrições Dkk-1 e DACT3. análise de RT-PCR revelou que o anticorpo família AGO precipitado transcritos Dkk-1 e DACT3 no citoplasma de SAEC tratadas (Figura 3B). aumentos evidentes em produtos de PCR, correspondentes a 3 ‘UTR de Dkk-1 e DACT3 SAEC foram observados em que sobre-expressam o miR-31; Este fenómeno não foi observado em células SAEC miR-31-empobrecido. Nestas experiências, β-actina serviu como controlo negativo uma vez que não há sequências pode ser alvo de miR-31 (Figura 3B). Uma vez que o miR-21 foi encontrado para alvejar directamente a UTR 3 ‘de tecidos humanos PDCD4 [34], o ARN imunoprecipitada a partir de células que sobre-expressam SAEC miR-21 serviu como um controlo positivo para o grampo (dados não mostrados). Consistente com os resultados de Wnt SuperArray acima referidos, as experiências demonstraram CLIP adicionais interacção de miR-31 com SFRP4 (Figura S1B).

A) putativos locais alvo de miR-31 dentro Dkk-1 3 ‘UTR (topo) e DACT3 UTR 3 ‘(de fundo). B) transcritos alvo-miARN em RISC foram precipitados com anticorpos família atrás, depois induzido por UV a ligação cruzada de ARN para as suas proteínas de ligação, seguido de amplificação por RT-PCR. A sobre-expressão de miR-31 aumentou significativamente a precipitação de Dkk-1 e de destino DACT3 transcritos em células SAEC. β-actina serviu como controlo negativo uma vez que não há sequências na UTR 3 ‘que pode ser alvo de miR-31. C) Os ensaios de luciferase demonstrando redução da atividade luciferase na SAEC transfectadas com vetores PMIR-relatório com ou sem inserção 3 ‘UTR ou mutado 3’ UTR de antagonistas sinalização Wnt.

experimentos adicionais foram realizados utilizando pMiR- vetores relatório com 3 ‘UTRs wt ou mutantes de Dkk-1 ou DACT3, co-transfectadas transientemente com miR-31 construções primárias ou vetores de controlo em SAEC. Como mostrado na Figura 3C, as actividades da luciferase de peso 3 ‘UTRs de Dkk-1 e DACT3 foram reduzidos ~ 70% em comparação com o controlo de vector mutado ou 3’ UTR, respectivamente. Coletivamente, essas experiências sugerem fortemente que miR-31 interage diretamente com 3 ‘UTRs de Dkk-1 e DACT3.

alterações epigenéticas coincidindo com a ativação CSC-mediada de miR-31

Uma análise recente ChIP dos padrões de distribuição de H3K4me3, H3K9 /14Ac e H2AZ sugeriu que o gene hospedeiro para miR-31 é LOC554202 [35]. Como tal, experiências adicionais foram realizadas para analisar se a expressão de CSC modulado em LOC554202 SAEC. Consistente com os resultados relativos a miR-31 (Figura 1A), 5 dias de tratamento CSC induzida expressão de LOC554202, a qual foi mantida durante 20 dias após a remoção de CSC a partir de meios de cultura (Figura 4A); Estes resultados foram consistentes com os referentes a CSC mediada por sobre-regulação de miR-31 (Figura 1). experimentos qRT-PCR revelou que 6 de 7 amostras de câncer de pulmão primário expressar ≥2 vezes maior miR-31 níveis em relação aos tecidos pulmonares normais emparelhados também exibiu sobre-expressão de LOC554202 (Figura 4B).

A) RT- PCR análise demonstrando up-regulação da expressão LOC554202 na SAEC seguintes 5 dias de exposição CSC. Consistente com os dados referentes a sobre-regulação de miR-31 por CSC, expressão de LOC554202 persistiu durante 20 dias após a cessação da exposição a CSC. B) Análise de qRT-PCR demonstrando níveis de expressão LOC554202 em cancros primários de pulmão relativamente aos tecidos pulmonares normais adjacentes. C) Representação esquemática de LOC554202, o gene putativo de acolhimento de miR-31. A, B, C, e D representam as posições dos iniciadores emparelhados utilizados para análise de chip. análise D) ChIP retratando H3K4me3 e /14 níveis de acetilação H3K9 dentro de quatro regiões do promotor LOC554202 (~ 1 kb, 2 kb, 3 kb, e 5 kb do TSS) em SAEC cultivadas com ou sem CSC. Bonificações de ativação foram observadas na região promotora proximal após a exposição CSC.

A análise da sequência revelou nenhuma ilha clássico CpG na região promotora de LOC554202, sugerindo que este gene de acolhimento não é regulada principalmente através de mecanismos de metilação do DNA (dados não mostrados). experimentos ChIP posteriores demonstraram aumento dos níveis de H3K4me3 e H3K9 /14Ac marcas de ativação na região promotora proximal (0 a -1,5 k) do LOC554202 (que contém, presumivelmente, os elementos reguladores para miR-31) em SAEC após a exposição CSC (Figuras 4C e D ). Curiosamente, estas marcas de ativação na região promotora do LOC554202 na SAEC ainda estavam presentes 20 dias após a cessação do tratamento CSC. Estes resultados foram consistentes com os resultados de RT-PCR apresentado na Figura 4A.

Papel de C /EBP-β na activação de CSC-mediada de miR-31

Experiências adicionais foram realizadas para examinar os mecanismos mais pelo que medeiam a activação de CSC LOC554202. software de análise preliminar não revelou sequências XRE característicos dentro de 5 kb do local de início da transcrição presumido (TSS) para LOC554202, sugerindo que a regulação positiva de LOC554202 pela CSC não foi mediado primariamente via receptor de hidrocarboneto aromático sinalização [36]. No entanto, como mostrado na Figura 5A, esta análise revelou vários locais de ligação potenciais para C /EBP-β, que tem sido mostrado previamente para mediar a regulação positiva de Bcl-xL em células de cancro da mama expostos ao fumo de cigarro [37]. Como tal, experiências adicionais foram realizadas para determinar se este factor de transcrição contribuiu para a activação mediada por CSC de miR-31 em epitélio respiratório cultivadas.