Abstract

Fundo

A sobre-expressão das cinases Aurora promove a tumorigénese de células. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil pré-clínico de um inibidor da quinase pan-Aurora, BPR1K653, como um candidato para a terapia anti-câncer. Uma vez que a expressão da bomba de efluxo de droga, MDR1, reduz a eficácia de vários compostos quimioterapêuticos em cancros humanos, este estudo também destinado a determinar se a potência do BPR1K653 podia ser afectado pela expressão de MDR1 em células cancerosas.

achados principais

BPR1K653 especificamente inibe a atividade da Aurora-a e Aurora-B cinase em baixas concentrações de nano-molar

in vitro

. A actividade anti-proliferativa de BPR1K653 foi avaliada em várias linhas de células de cancro humano. Os resultados do ensaio mostraram que clonogénico BPR1K653 foi potente em alvejar uma variedade de linhas celulares de cancro independentemente da origem do tecido, o estado de p53, ou a expressão de MDR1. Ao nível celular, induzida BPR1K653 endo-replicação e subsequente apoptose em ambas as células cancerosas MDR1-negativas e positivas MDR1-. É importante notar que mostraram uma actividade potente contra o crescimento de tumores de xenoenxertos de carcinoma cervical humano KB e células KB-VIN10 MDR1-positiva KB-derivados em ratinhos nus. Finalmente, BPR1K653 também exibiu propriedades farmacocinéticas favoráveis ​​em ratos.

Conclusões e significado

BPR1K653 é um novo e potente composto anti-cancro, a sua potência e não é afectado pela expressão do fármaco múltiplos resistente proteína, MDR1, em células cancerosas. Portanto, BPR1K653 é um composto anti-câncer promissor, que tem potencial para o tratamento de várias doenças malignas, particularmente para pacientes com resistência aos medicamentos relacionada com a MDR1 após os tratamentos quimioterápicos prolongados

Citation:. Cheung CHA, Lin WH, Hsu JT -A, horas TC, Yeh TK, Ko S, et al. (2011) BPR1K653, um romance Aurora Kinase Inhibitor, exibe potente anti-proliferativa Actividade em MDR1 (P-gp170) células cancerosas mediada multirresistente. PLoS ONE 6 (8): e23485. doi: 10.1371 /journal.pone.0023485

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 13 de junho de 2011; Aceito: 18 de julho de 2011; Publicação: 24 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cheung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (NSC99-2323-B-400-006, NSC99-2323-B-400-007, NSC99-2120-M-006-005), Departamento de Saúde (DOH99-TD-C -111-004) e Institutos nacionais de Pesquisa em Saúde (CA-099-PP-02), Taiwan ROC Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a mitose é um passo fundamental no ciclo celular que está fortemente regulada por muitas proteínas. A expressão anormal ou a activação de estas proteínas reguladoras pode resultar na mitose aberrante, conduzindo ao desenvolvimento de cancros [1], [2]. Ao nível molecular, as quinases Aurora (Aurora-A, Aurora-B e Aurora-C) são serina /treonina cinases que funcionam como reguladores chave da mitose. Sob condições fisiológicas normais, que são essenciais para a formação do fuso, a maturação do centrossoma, a segregação cromossómica e a citocinese [3], [4]. Em condições patológicas, foi demonstrado que a Aurora cinases são sobre-expressos em vários cancros humanos e também desempenhado papéis importantes no processo de tumorigénese [5], [6], [7], [8]. Por exemplo, a Aurora-A cinase é sobre-expressa em adenocarcinomas do tracto gastrointestinal superior [6]. Além disso, uma correlação entre os níveis de expressão de Aurora-A e a progressão do tumor foi demonstrada em doentes com carcinoma da cabeça e do pescoço de células escamosas [9]. Por outro lado, a Aurora-B cinase é frequentemente sobre-expressa em gliomas malignos e NSCLC primária, particularmente glioblastomas [10], [11]. Uma vez que a sobre-expressão de Aurora-A e Aurora-B é frequentemente associada com a tumorigénese, estas moléculas têm sido alvo para terapia do cancro. O primeiro pan-Aurora inibidor da quinase prova-de-conceito, VX-680 (MK-0457, Tozasertib), foi desenvolvido em 2004 pela Vertex Pharmaceuticals (em colaboração com a Merck) com o objetivo de direcionar células cancerosas. Este inibidor específico tem se mostrado eficaz em alvejar as células cancerosas tanto

in vitro

e

in vivo

, e recebeu aprovação de os EUA Food and Drug Administration (FDA) para entrar ensaios clínicos [12 ], [13], [14]. Desde então, os esforços contínuos têm sido feitas por diferentes empresas farmacêuticas em busca de inibidores da quinase Aurora potenciais que apresentam melhor perfil terapêutico e especificidade como comparar com o primeiro inibidor da geração, VX680 [15], [16], [17], [18] , [19], [20], [21], [22], [23].

Apesar dos sucessos iniciais do desenvolvimento de vários inibidores de quinase Aurora, estudos recentes revelam que a eficácia de muitos destes desenvolvido e inibidores clinicamente testados, incluindo VX680, PHA-739358 e AZD1152, pode ser afectado pela expressão de proteína de resistência a múltiplas drogas MDR1 (P-gp170) em células cancerosas [24], [25]. De facto, a sobre-expressão de MDR1 também interfere com uma ampla gama de diferentes agentes quimioterapêuticos [2], [26], [27], [28], [29]. Para exemplos, a expressão da bomba de efluxo de droga trans-membrana, MDR1, reduz a sensibilidade das células cancerígenas ao paclitaxel, vincristina (agentes anti-microtúbulos), doxorrubicina (agente intercalante de ADN), mitoxantrona, VP-16 (inibidores da topoisomerase II) e imatinib (inibidor de tirosina-quinase) [28], [30], [31], [32], [33], [34]. Portanto, tem havido grande interesse em identificar compostos anti-cancro novas que podem superar a resistência relacionados com MDR1 e também apresentam melhor perfil farmacológico.

Neste estudo, um romance pan-Aurora inibidor da quinase intitulado BPR1K653 foi desenvolvido e foi avaliada a sua eficácia contra vários MDR1-negativo e MDR1-positivos células cancerosas. Os resultados do estudo mostram que, ao contrário dos agentes quimioterapêuticos acima mencionados, BPR1K653 é eficaz em alvejar as células cancerosas tanto MDR1-negativas e -positivas

in vitro

e

in vivo

. Além disso, BPR1K653 possui propriedades farmacocinéticas favoráveis ​​

in vivo

.

Resultados

BPR1K653 é um potente e seletivo pan-Aurora inibidor da quinase

In

ensaio de inibição in vitro da cinase revelaram que BPR1K653 (Figura 1A) inibiram a actividade de Aurora-a e -B-quinase com um IC

50 valor de 124 nM e 45 nM, respectivamente (Figura 1B e Tabela 1). A selectividade de BPR1K653 foi então avaliada em relação a diferentes quinases. BPR1K653 exibiu menor potência (isto é, IC

50 10? M) na inibição da actividade da ALK, CHK1, cMET, EGFR, FLT3, VEGFR1 e VEGFR2, em comparação com a Aurora-A e Aurora-B cinase (Tabela 1). A actividade celular de BPR1K653 também foi examinada. Activação de Aurora-A cinase requer uma auto-fosforilação no resíduo Thr288, ao passo que a fosforilação do resíduo Thr232 é um mecanismo fundamental para a regulação da Aurora-B activação [35], [36]. Aqui, a análise de mancha de Western revelou que a quantidade de fósforo-Aurora-A, -B e -C da cinase presente em células de cancro tratados com um HCT116 Aurora pan-inibidor de quinase, VX680 (controlo positivo), foi reduzida de uma forma dependente da concentração (Figura 1C). Redução de fósforo-Histona H3 (Ser10), um substrato directo de Aurora-B cinase, é amplamente utilizada como um indicador de inibição de quinase Aurora em células. Aqui, VX680 também reduziu a quantidade de fósforo-Histona H3 (Ser10) presente nas células de esperar (Figura 1C). Consistente com estes resultados, BPR1K653 induziu uma diminuição dependente da concentração no fósforo-Aurora-A, -B e -C da cinase em células HCT116. células HCT116 tratados com BPR1K653 também mostraram um decréscimo dependente da concentração em fósforo-Histona H3 (Figura 1C).

(A) estrutura química do composto anti-cancro BPR1K653. (B) BPR1K653 inibiu a actividade tanto da Aurora-A e Aurora-B cinase tal como revelado pela

In vitro

ensaio de inibição da quinase. (C) as células cancerosas HCT116 foram tratadas com várias concentrações de BPR1K653 e o VX680 inibidor de quinase Aurora-pan comercialmente disponível, e a expressão de várias proteínas foram analisadas por transferência de Western. Tubulina foi utilizada como controle interno.

BPR1K653 inibe a proliferação de várias linhas de células cancerosas humanas, independentemente das suas origens de tecidos e status de p53

Para determinar se BPR1K653 poderia inibir proliferação celular, um painel de 11 linhas celulares de cancro diferentes foi tratada com BPR1K653. Para comparação, as células foram também tratadas com dois inibidores de quinase Aurora bem caracterizados, VX680, e PHA739358. Foi demonstrado que a perda da função de p53 induz a resistência a múltiplos fármacos, em alguns tipos de cancro [37]. Aqui, os resultados do ensaio clonogénico revelou que BPR1K653 foi eficaz (isto é, IC

50 0,5 uM) contra vários tipos de células cancerosas, incluindo pulmão (A549), oral (Hone-1 e OECM-1) do colo do útero (KB) , cólon (HT29), bexiga (NTUB1) e leucemia /linfoma (MV4-11 e IM9), independentemente do seu estatuto p53 (Tabela 2). Além disso, foi mostrada a potência de BPR1K653 a ser maior do que a de VX680 e PHA739358 na maioria das linhas celulares tumorais testadas (Tabela 2). A IC

50 valores de VX680 e PHA739358 em várias linhas celulares de cancro (excepto em células OECM-1) foram 2-10 dobras maiores do que os de BPR1K653. O IC

50 anos de VX680 e BPR1K653 eram iguais em células OECM-1. Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que BPR1K653 é capaz de inibir a proliferação de vários tipos de células de cancro independentemente da sua origem de tecido e o estado de p53.

BPR1K653 é igualmente potentes na inibição do crescimento do múltipla proteína de resistência a drogas (MDR1) células cancerosas -expressing

tem sido amplamente demonstrado que a sobre-expressão de MDR1 (P-gp, bomba de efluxo de drogas) induz resistência aos fármacos a vários agentes quimioterapêuticos. Para determinar se a potência do BPR1K653 é anulada pela expressão MDR1 em células cancerosas, linhas celulares resistentes a múltiplas drogas de três-expressando MDR1 cancro, KB-VIN10, KB-S15 e NTU0.017 [2], [38], [39], [ ,,,0],40], foram tratadas com BPR1K653. Como mostrado na Tabela 3, o IC

50 valor de BPR1K653 para KB-VIN10 e KB-S15 foi semelhante aos das células KB MDR1-negativo parentais. O IC

50 de BPR1K653 para KB-VIN10, KB-S15 e KB foram 14 nM, 11 nM e 12 nM, respectivamente. Além disso, o CI

50 valor de BPR1K653 para as células que expressam NTU0.017 MDR1 foi também semelhante à das células MDR1 NTUB1-negativo parentais (Tabela 3). Estudos anteriores revelaram que inibidores da quinase Aurora, VX680 e PHA739358, são substratos de MDR1 [24], [25]. Consistentemente, todas as nossas linhas celulares de cancro que expressam MDR1 testados apresentaram uma resistência cruzada ao VX680 e PHA739358 (Tabela 3). Além disso, o nível de expressão MDR1 correlacionado com o nível de VX680 /PHA-739358 resistência em células de cancro KB-S15 (Figura 2) e KB-VIN10. Para determinar adicionalmente se a potência de VX680 e PHA739358 em KB-VIN10, KB-S15 e NTU0.017 células foram realmente afectada pela expressão de MDR1, as células foram co-tratados com o modulador de MDR1 (regulador negativo), o verapamil, e células foi determinada a viabilidade. Aqui, foi mostrada tratamento verapamil (10 uM) para ser capaz de restaurar /melhorar a sensibilidade para ambos VX680 e PHA739358 em todas as células cancerosas que expressam MDR1 testados (Tabela 3). No entanto, o tratamento de verapamil não podia aumentar ainda mais a sensibilidade à BPR1K653 tanto em células cancerosas MDR-negativas e que expressam MDR1 (dados não mostrados). Por outro lado, foi demonstrado que um derivado linha KB VP-16 de células de cancro resistentes, KB-7D, sobre-expressa um outro tipo de proteína de efluxo multi-droga ATP-dependente, MPR1 [41]. Curiosamente, o IC

50 valor de BPR1K653 para KB-7D era também semelhante à das células KB MRP1-negativo parentais (Tabela 3).

ARNm total foi extraído a partir de células, e RT-PCR foi realizada para detectar a expressão de MDR1 em células KB, KB-VIN10 e KB-S15. GAPDH foi utilizado como controle interno.

BPR1K653 induz endo-replicação em ambas as células cancerosas MDR1-negativas e -positivas

Outros experimentos foram realizados para confirmar as conclusões anteriores de que a eficácia de BPR1K653 não é afectada pela expressão em células MDR1. A inibição de quinases Aurora induz a endo-reduplicação de células, indicando pela formação de poliploidia [14]. Aqui, os resultados da microscopia de imunofluorescência e análise citométrica de fluxo mostrou claramente que BPR1K653 induzida a formação de populações poliploidia ( 4N) em células KB (Figura 3A e B, e A Figura S1A). As células KB-VIN10-expressando MDR1 tratadas com as mesmas concentrações de BPR1K653 como tinha sido aplicados às células KB também induziu a formação de poliploidia (Figura 3A e C, e a Figura S1A). Em contraste, VX680 somente induziu a formação de poliploidia em células KB, mas não em células KB-VIN10 sob as mesmas concentrações de tratamento (Figura 3A, B e C). No entanto, a formação da população poliploidia foi demonstrada em células KB-VIN10 co-tratadas com 10? M de MDR-inibidor, verapamil, e VX680 (Figura 3C). Estes resultados são consistentes com os resultados do ensaio clonogênica acima que a expressão da MDR1 em células de câncer afeta a eficácia do VX680, mas não da BPR1K653.

(A, B e C) células KB e KB-VIN10 foram tratados com BPR1K653 e VX680 durante 48 h. (A) Núcleo foram coradas com corante Hoechst azul e vermelho microtúbulos foram marcadas com o anticorpo anti-tubulina Alexa Fluor®-etiquetado. (B e C) As células foram incubadas com iodeto de propídio e subsequentemente analisadas por citometria de fluxo. células (D e E) de afiar-1 foram tratados com BPR1K653 durante 48 h. (D) Núcleo foram coradas azul com o corante Hoechst. (E) As células foram incubadas com iodeto de propídio e subsequentemente analisadas por citometria de fluxo.

Para determinar se BPR1K653 também induz a endo-replicação em outros que KB e o seu derivado, de afiar-1 células eram linhas celulares de cancro tratada com BPR1K653 e conteúdos celulares foram analisadas por microscopia e citometria de fluxo. Ambos microscopia de imunofluorescência e análise citométrica de fluxo mostrou claramente que BPR1K653 promoveu a formação de populações poliploidia ( 4N). Em células de afiar-1 de um modo dependente da concentração (Figura 3D e E)

BPR1K653 reduz Histona H3 fosforilação e expressão da ciclina B1 em ambos

análise de Western blot de células cancerosas -positivas MDR1-negativo e foi realizada para confirmar que a eficácia de BPR1K653 não é afectada pela expressão de MDR1 em células cancerosas. Histona H3 é um substrato directo de Aurora-B cinase, e células endo-replicação geralmente mostram a redução da expressão da ciclina B1. Nesta experiência, a inibição de histona H3 fosforilação e a regulação negativa da expressão da ciclina B1 foram mostradas em ambas as células KB e KB-VIN10 tratadas com as mesmas concentrações, 12 (IC

50), 24 (2 × IC

50) e 36 nM (3 × IC

50) de BPR1K653 de um modo dependente da concentração (Figura 4A e B). Consistente com estes resultados, o tratamento VX680 (isto é, 170 nM e 255 nM) também inibiu a fosforilação da histona H3 e a expressão da ciclina B1 em células KB (Figura 4A). No entanto, mesmo tratamento VX680 não podia induzir as alterações moleculares acima nas células KB-VIN10-expressando MDR1. tratamento Verapamil (10 uM) foi mostrado para restaurar a sensibilidade à VX680 em células KB-VIN10, como indicada por uma redução na fosforilação e expressão de ciclina B1 Histona H3 (Figura 4B).

(A) As células KB foram tratados com BPR1K653 e VX680 durante 48 h e a expressão de várias proteínas foram determinadas por análise de Western blot. intensidades de banda relativos foram mostrados. (B) As células KB-VIN10 foram tratados quer com BPR1K653 ou VX680 com /sem o verapamil durante 48 h, e a expressão de várias proteínas foi determinado por análise de Western blot. intensidades de banda relativos foram mostrados. células (C) de afiar-1 foram tratados com BPR1K653 durante 48 h, e a expressão de várias proteínas foi determinado por análise de Western blot. Actina foi utilizada como controlo interno.

Para determinar se BPR1K653 também reduz Histona H3 fosforilação e ciclina B1 expressão noutros que KB e o seu derivado, células de afiar-1 linhas celulares de cancro foi tratada com BPR1K653 e proteínas intracelulares foram analisados ​​por transferência de Western. A análise por Western blot demonstrou claramente que tanto a fosforilação da histona H3 e expressão da ciclina B1 foram diminuídas nas células Hone-1-tratados BPR1K653 (Figura 4C).

BPR1K653 induz a apoptose em ambos cancro MDR1-negativo e -positivo células

estudos anteriores revelaram que a segmentação Aurora cinases induz células endo-replicação e apoptose celular subsequente [14]. Para determinar se BPR1K653 é capaz de induzir apoptose em ambas as células MDR1-positivos e cancerosas -negativa, células KB e KB-VIN10 foram tratados com BPR1K653 e propriedades apoptóticas foram analisados ​​por Anexina-V, em tempo real de caspase-3 /-7 actividade ensaios de imagem e TUNEL. Aqui, tanto o volume citoplasmático e o tamanho do núcleo foram aumentados nas células KB e KB-VIN10-tratados BPR1K653, indicando que BPR1K653 induzida de células endo-replicação como esperado (Figura 5A e C, e a Figura S1A). A translocação da molécula de fosfatidilserina a partir do interior do folheto da membrana celular para o exterior da membrana indica a ocorrência de apoptose precoce. Os resultados do ensaio de Anexina-V mostraram que BPR1K653 induzida a translocação da molécula de fosfatidilserina em células KB e KB-VIN10, como indicando pelo marcador fluorescente verde (Figura 5A). BPR1K653 também induziu a actividade e fragmentação de ADN da caspase-3 /-7 tanto em células KB e KB-VIN10 sob as mesmas condições de tratamento (Figura 5B, C, D, e A Figura S1A). Em contraste, VX680 somente induziu a translocação da molécula fosfatidilserina, caspase-3 /-7 actividade e a fragmentação do ADN em células KB e não nas células KB-VIN10-expressando MDR1 (Figura 5A, B, C e D). Além disso, a clivagem de PARP foi apenas mostrado nas células KB-VIN10-expressando MDR1 tratados com BPR1K653 ou VX680 /verapamil (co-tratamento), e não com VX680 sozinho, conforme revelado pela análise por Western blot (Figura 5E).

células (A, B e C) e KB KB-VIN10 foram semeadas em lâminas de 8 câmaras bem durante a noite. As células (A) foram tratados quer com BPR1K653 ou VX680 durante 48 h. A translocação da molécula de fosfatidilserina em células foi analisada pelo ensaio de Anexina-V-FLUOS e as células foram visualizadas utilizando um microscópio permitiu-UV. Geral morfologia celular foi visualizado por microscopia de contraste de fase. (B) As células foram tratadas com quer BPR1K653 ou VX680 durante 60 h e MagicRed ™ -DEVD em tempo real da Caspase-3 /-7 kit de actividade (Immunochemistry Technologies LLC) foi utilizado para detectar a activação de caspase-3 /-7 em células , como indicado pela emissão de fluorescência vermelha. Núcleo azul foi contra-corada pela Hoechst 33342, e as células foram visualizadas em tempo real usando um microscópio invertido activado por UV. (C e D) de detecção de células com fragmentação de ADN por ensaio de TUNEL. As células KB e KB-VIN10 foram tratados quer com BPR1K653 ou VX680 durante 72 h. fragmentações de DNA foram analisados ​​utilizando o TMR-vermelho

In Situ

kit de detecção de morte celular. Núcleo com a fragmentação do DNA foi manchado de vermelho. Núcleo foi blue contra-coradas por DAPI. As células foram analisadas por um microscópio permitiu-UV. (C) fotos representativas foram mostrados. (D), as células marcadas foram contadas, e a percentagem de células em apoptose foi calculado da seguinte forma: Valor total do vermelho fluorescente marcado (DNA fragmentado) Núcleo disponíveis montante total ÷ do azul fluorescente núcleo marcado disponível × 100. As experiências foram repetidas duas vezes. (E) BPR1K653 induz a clivagem de PARP em células cancerígenas KB-VIN10. As células KB-VIN10 foram tratados com BPR1K653 (2 × IC

50 de KB) ou VX680 (2 × IC

50 de KB) com /sem verapamil por 72 h. A clivagem de PARP foi determinada por análise de Western blot. Actina foi utilizada como controlo interno.

BPR1K653 também induziu apoptose em células de afiar-1, como indicado pela indução de actividade caspae-3 /-7

In vitro

(Figura S1B).

BPR1K653 suprime o crescimento de ambos os xenotransplantes MDR1-negativas e câncer -positivo humanos

in vivo

Embora os resultados acima mostraram que BPR1K653 exibe potente anti-câncer efeito

in vitro

, foram realizados experimentos para determinar se BPR1K653 também é capaz de inibir a atividade de cinases Aurora e o crescimento de ambos os tumores MDR1-negativos /positivos

in vivo

. células KB foram cultivadas como

s.c. tumores

em camundongos nus. Quando xenotransplantes KB bem estabelecidas eram palpáveis ​​com o tamanho do tumor de -75 mm

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de cinco animais cada controle e tratamento veículo. Os ratinhos tratados receberam ou 15 mg /kg de BPR1K653 ou 30 mg /kg de VX680

i.p.

Durante 5 dias /semana, durante 2 semanas consecutivas. Os resultados da análise imuno-histoquímica das secções de tecido de tumor mostraram que a administração de BPR1K653 reduziu a quantidade de células positivas de fósforo-Histona H3 presentes nos tecidos do tumor, em comparação com o controlo (10% versus 60%) (Figura 6A). Também foi observada uma redução na taxa de crescimento do tumor em ratos tratados com qualquer um ou BPR1K653 VX680 5 dias /semana, durante 2 semanas consecutivas. Houve uma diminuição ~73% no volume do tumor no dia 30 nos animais tratados com BPR1K653 (P 0,05). Além disso, houve uma diminuição ~68% no volume do tumor no dia 30 nos animais tratados com VX680 (P 0,05; Figura 6B). BPR1K653 foi bem tolerado na dose de 15 mg /kg sem quaisquer sinais de toxicidade no modelo de tumor de xenoenxerto de KB como a perda de peso do corpo após o tratamento era inferior a 10% no grupo de tratamento como em comparação com o grupo de controlo (Figura 6C ). Para determinar se a inibição do crescimento do tumor em ratinhos tratados com BPR1K653 estava relacionado com os aumentos de populações de células de cancro apoptóticas, os tumores foram removidos cirurgicamente a partir de ratos de 12 dias de pós-tratamento de tecidos e secções foram analisadas por ensaio de TUNEL. Os resultados do ensaio de TUNEL mostrou que a quantidade de células apoptóticas presentes no tecido do tumor de ratos tratados BPR1K653 foi significativamente maior do que aqueles nos ratinhos de controlo (55% versus 7%) (Figura 6D). Isto é consistente com o resultado da

in vitro

experiência anterior que BPR1K652 é capaz de induzir apoptose das células cancerosas.

camundongos nus (A, B, C e D) Tendo carcinoma cervical humano KB xenoenxertos foram tratados com veículo de controlo (⧫), 30 mg /kg VX680 durante 5 dias /semana durante 2 semanas (nos dias 6-10 e 13-17; ▴) ou 15 mg /kg BPR0L075 durante 5 dias /semana, durante 2 semanas (nos dias 6-10 e 13-17; •). (A) BPR1K653 tratamento reduziu a quantidade de células positivas de fósforo-Histona H3 presentes em tecidos tumorais. A análise imuno-histoquímica da expressão de fósforo-Histona H3 nas secções de tecido de tumor 24 h após a segunda administração BPR1K653. Núcleo foi tingido de azul /roxa por hematoxilina e fósforo-histona H3 foi rotulado na cor marrom. As células marcadas foram contadas, e a percentagem de células positivas de fósforo-histona H3 presentes em tecidos tumorais foi calculado da seguinte forma: Quantidade total de células com coloração marrom rotulados ÷ quantidade total de células disponíveis × 100. Experiência foi repetida duas vezes. Uma diferença estatisticamente significativa na quantidade de células positivas de fósforo-Histona H3 presentes nos tecidos do tumor em ratinhos tratados com controlo contra BPR1K653 é indicado por “*”. * P 0,05. (B) de medição do volume do tumor. Uma diferença estatisticamente significativa no tamanho do tumor em ratinhos tratados com controlo contra BPR1K653 VX680 e é indicado por “*”. * P 0,05. (C) Medição do peso do animal. análise (D) TUNEL das secções de tecido tumoral 12 dias de tratamento pós-BPR1K653. cortes de tecidos tumorais foram analisados ​​pelo FITC

In Situ

kit de detecção de morte celular e microscopia fluorescente. Tecido tratado com ADNase foi utilizado como controlo positivo. núcleo de fluorescência marcado verde indica a indução de fragmentação de ADN. Experiência foi repetida duas vezes. A análise quantitativa foi mostrado. Uma diferença estatisticamente significativa na quantidade de células apoptóticas presentes nos tecidos do tumor em ratinhos tratados com controlo contra BPR1K653 é indicado por “*”. * P 0,05. (E e F) a ratinhos nus portadores de P-gp170 /MDR expressando xenoenxerto KB-VIN10 foi tratado com controlo de veículo (⧫), 30 mg /kg VX680 durante 5 dias /semana durante 3 semanas (nos dias 19, 12-16 -23 e 26-30; ▴) ou 15 mg /kg BPR0L075 por 5 dias /semana durante 3 semanas (nos dias 12-16, 19-23 e 26-30; •). (E) Medição do volume do tumor. Uma diferença estatisticamente significativa no tamanho do tumor em ratinhos tratados com controlo contra BPR1K653 VX680 e é indicado por “*”. * P 0,05. (F) Medição do peso do animal. Os dados são a média ± DP do volume do tumor (mm

3) em cada ponto de tempo (n = 5; * P 0,05).

Notavelmente, BPR1K653 também é tão eficaz para MDR1- expressando xenoenxerto de tumor como é em células cultivadas que expressam MDR1. Aqui, foi utilizada KB-VIN10 xenoenxerto tumoral para avaliar a eficácia de BPR1K653 contra tumores que expressam MDR1

In vivo

. Devido às propriedades de crescimento lento de KB-VIN10, os ratinhos tratados receberam ou 15 mg /kg de BPR1K653 ou 30 mg /kg de VX680

ip

durante 5 dias /semana, durante 3 semanas consecutivas, em vez de 2 semanas quanto em ratinhos KB-implantado. Em comparação com os ratinhos de controlo, o crescimento de tumores KB-VIN10 foi significativamente inibida em ratinhos tratados com 15 mg /kg de BPR1K653. Houve uma diminuição de ~ 50% do volume do tumor no dia 42 nos animais tratados com BPR1K653 (P 0,05). Em contraste, VX680 não apresentam efeito significativo de inibição de crescimento do tumor em murganhos transplantados com células KB-VIN10 (Figura 6E). Além disso, BPR1K653 foi bem tolerado na dose de 15 mg /kg (5 dias /semana, durante 3 semanas consecutivas), sem sinais de toxicidade no modelo de tumor de xenoenxerto de KB-VIN10 como a perda de peso do corpo após o tratamento era inferior a 10 % no grupo de tratamento como em comparação com o grupo de controlo (Figura 6F). Assim, BPR1K653 exerce potente eficácia anti-tumoral para ambos os xenotransplantes tumorais MDR-negativas e MDR-expressam.

Farmacocinética de BPR1K653 em ratos

Finalmente, os estudos farmacocinéticos de BPR1K653 foram acessados ​​durante um 24 h período para examinar as concentrações plasmáticas de BPR1K653 após uma única administração intravenosa (Tabela 4). Após uma única administração de BPR1K653 a uma dosagem de 5 mg /kg a ratos, BPR1K653 alcançada uma concentração plasmática máxima de 10 uM (5463 ng /mL) a 2 minutos após a dosagem, e a concentração de plasma estimada BPR1K653 manteve-se a uma concentração de 3,9 nM (2,1 ng /mL) 24 horas após a dosagem. A semi-vida plasmática, a eliminação corporal total e volume de distribuição em estado estacionário (Vss) foram de 3,9 ± 0,7 horas, 49,3 ± 10,6 mL /min /kg e 10,6 ± 5,1 L /kg, respectivamente.

Discussão

Aurora cinases têm surgido como reguladores-chave da mitose e evidências indicam anormalidades na sua expressão e actividade estão intimamente relacionados com o desenvolvimento e progressão de vários cancros. Neste estudo, nós desenvolvemos um pan-Aurora inibidor da quinase romance BPR1K653 e demonstrou ainda mais a sua eficácia na segmentação vários tipos de cancros

in vitro

. Nossos estudos co-cristalografia de raios-x permeáveis ​​tinha demonstrado as interações físicas entre o composto precursor de BPR1K653 e Aurora cinases [42], e o

in vitro

Estudo de inibição atual quinase confirmou a especificidade alvo de BPR1K653. Consistente com as alterações moleculares observados em células tratadas com Aurora-B cinase e os oligos específicos de ARNip com inibidores de quinase Aurora-pan diferentes, tais como VX680 e SNS-314 [14], [43], [44], tratamento BPR1K653 também induz endo replicação de células e reduz a quantidade de Histona H3 fosforilada presente em células. Além disso, BPR1K653 é capaz de induzir apoptose de células de cancro, mas não autofagia (Figura S2), que é o resultado comum em células tratadas com inibidores de quinase Aurora [43]. Curiosamente, BPR1K653 é activa em toda a p53 de tipo selvagem testados /-negative /linhas celulares de cancro -mutant em baixas concentrações nano-molar (IC

50 20 nM), apesar da capacidade limitada de outro inibidor de cinase pan-Aurora VX680 para induzir a endo-replicação e subsequente apoptose tem sido demonstrado nas células cancerosas com a função normal de checkpoint dependente de p53 pós-mitótico no outro estudo [14]. Tomados em conjunto, BPR1K653 está inibindo selectivamente Aurora cinases, e ao contrário VX680, é capaz de atingir vários tipos de células cancerígenas, independentemente do seu status de p53.

A resistência aos medicamentos é um problema comum na gestão de doenças neoplásicas, e a eficácia de muitas drogas quimioterapêuticas está limitada pelo facto de que eles são substratos para a bomba de efluxo de MDR1 (P-gp170). Por exemplo, o inibidor de quinase Aurora AZD1152 /foi mostrado AZD1152-HQPA (Barasertib) para ser o substrato de MDR1 [24]. Além disso, nossos inibidores Aurora quinase de referência, VX680 (Tozasertib) e PHA-739358 (Danusertib), foram mostrados anteriormente ineficaz na segmentação do SA-Dx5 (resistente a doxorrubicina) que expressam MDR1, MB-231-PTX e H460-PTX (ambos paclitaxel ) células cancerosas resistentes por outros investigadores [25]. Neste estudo, BPR1K653 mostrou-se igualmente eficaz contra duas linhas derivadas de KB MDR1-positivos células de câncer (KB-VIN10 e KB-S15) e uma linha de células de câncer de MDR1-positivos dervided-NTUB1 (NTU0.017)

in vitro

. Esta característica é distinta das dos inibidores de quinase Aurora bem caracterizados, VX680 e PHA-739358, porque os nossos células cancerosas MDR1-positivos testados são mais resistentes a estes agentes quimioterapêuticos do que as suas células MDR1-negativo parentais. De facto, a co-incubação de inibidor de MDR1, verapamil, foi demonstrado ser eficaz no re-sensibilizar as células cancerosas que expressam tanto a MDR1 VX680 e PHA-739358, ao passo que o mesmo tratamento não pode aumentar a sensibilidade nem a BPR1K653 em MDR1- negativo (KB e NTUB1), nem células que expressam MDR1 (KB-VIN10, KB-S15 e NTU0.017). Importante, BPR1K653 também é eficaz na inibição do crescimento de células cancerosas ambas MDR1-negativo e KB-expressando MDR1 KB-VIN10

in vivo

, apoiando ainda mais a hipótese de que a sobre-expressão da bomba de efluxo de drogas MDR1 comuns poderiam não interfere com a eficácia de direccionamento BPR1K653 em células cancerosas. Dado que os compostos quimioterapêuticos, tais como paclitaxel, vincristina (agentes anti-microtúbulos), doxorrubicina (agente intercalante de ADN), tretinoína (

all-trans-retinóico, ácido

), mitoxantrona, VP-16 (inibidores da topoisomerase II) e imatinib (