Abstract

A proteína MUC1 é expressão aberrante em muitos cancros de tumores sólidos. Em contraste com o seu agrupamento apical das células epiteliais saudáveis, é uniformemente distribuído sobre as células cancerosas. No entanto, uma ligação mecânica entre a expressão aberrante e câncer permaneceu uma incógnita. Relata-se que um produto de clivagem MUC1 ligada à membrana, que chamamos de MUC1 *, é a forma predominante da proteína em células cancerosas cultivadas e sobre tecidos cancerosos. Além disso, demonstra-se que a transfecção de um fragmento mínimo de MUC1, MUC1 *

1110, contendo um mero quarenta e cinco (45) aminoácidos do domínio extracelular, é suficiente para conferir as actividades oncogénicas que foram anteriormente atribuídos ao máximo proteína -length. Por comparação do peso molecular e da função, parece que a MUC1 e MUC1 * *

1110 são aproximadamente equivalentes. São apresentadas provas que suporta fortemente um mecanismo através do qual a dimerização do domínio extracelular da proteína MUC1 * activa a quinase MAP cascata de sinalização e estimula o crescimento celular. Estes achados sugerem métodos para manipular este mecanismo de crescimento para intervenções terapêuticas em tratamentos de câncer

Citation:. Mahanta S, Fessler SP, Parque J, Bamdad C (2008) Um fragmento mínimo de MUC1 Crescimento medeia das células cancerosas. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10.1371 /journal.pone.0002054

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 17 Dezembro, 2007; Aceito: 13 de março de 2008; Publicado: 30 Abril 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Mahanta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Todos os autores são funcionários de uma empresa de biotecnologia e participar de um plano de opção de ações

Introdução

MUC1 é um Type. I glicoproteína de membrana da família de mucina com uma vasta domínio extracelular consistindo de centenas de unidades de repetição em tandem, um único domínio transmembranar e uma cauda citoplasmática de terminal-C [1] – [5]. MUC1 é normalmente expressa na fronteira apical do epitélio saudável que revestem o trato respiratório, reprodutivo e gastrointestinal. Em nítido contraste com o padrão saudável de expressão que restringe MUC1 a superfícies luminais, tecidos cancerosos exibir um padrão de expressão aberrante em que MUC1 é uniformemente distribuída sobre a superfície do tecido inteiro [6], [7]. Estima-se atualmente que 75% de todos os cancros de tumores sólidos humanos expressam de forma anormal da proteína MUC1 [8].

A função da proteína MUC1 no estado saudável permanece incerto, embora a evidência está se acumulando rapidamente por seu papel como uma oncoproteína . A introdução de MUC1 em células previamente MUC1-negativa resulta numa taxa de crescimento aumentou [9], permite o crescimento celular independente de ancoragem [10] e torna as células resistentes à apoptose induzida por tratamento com agentes de quimioterapia convencionais [8]. As interacções entre MUC1 e membros da família ErbB foram relatados [11], [12]. MUC-1 está envolvido em diversas vias de sinalização intracelulares. Estes estudos centraram-se na cauda citoplasmática de MUC1 (MUC1-CT), que é talvez a melhor caracterizada porção da proteína [13]. A cauda de ácido amino 72 carrega os resíduos que podem ser fosforilada por Zap70, PCKδ, GSK3β, ErbB1, c-Src, Lyn e Lck. Além disso, os elementos de transdução de sinal do AP-2, p53, ER-α, β-catenina e Grb2 foram mostrados para se ligar ao MUC1-CT, presumivelmente em função do seu estado de fosforilação. Com efeito, estudos implicam a fosforilação da proteína MUC1-TC na activação da via de sinalização da MAP quinase [12]. Num desses estudos [14], a estimulação de anticorpos de domínio extracelular de uma proteína quimérica constituída por porções extracelulares e transmembranares de CD8, mas a cauda citoplasmática da proteína MUC1, resultou na fosforilação de ERK 1/2. activação de ERK mostrou ser dependente da fosforilação da proteína MUC1-TC e pode ser abolidos por um mutante de Ras dominante negativo ou por um inibidor de MEK, assim argumentando que a MUC1-CT medeia a sinalização de Grb2-SOS-Ras-MEK-ERK cascata que leva a divisão celular.

Estudos do domínio extracelular de MUC1 (ECD) são complicados pelo seu tamanho de cisalhamento (150-300 kDa), o facto de que é altamente glicosilada, e que é constituído por um número variável de repetições em tandem. Além disso, a proteína pode ser clivada, em seguida, liberta da superfície da célula. Shed MUC1, composto em grande parte de repetições em tandem, pode ser detectado no soro de pacientes em estágio II de câncer de mama [15]. Da mesma forma, as transferências de Western de lisados ​​de células cancerosas em cultura de MUC1-positivos mostram duas espécies de MUC1, uma alta espécies de peso molecular (150-300 kDa) que reage com os anticorpos que se ligam às repetições em tandem e um baixo espécies de peso molecular (20-35 kDa) que reage com os anticorpos que se ligam à cauda citoplasmática. sobrenadantes de células contêm apenas as espécies de elevado peso molecular MUC1. Alguns estudos fornecem evidências de que MUC1 auto-clivagem através de um domínio MAR dentro da proteína [16], [17]. Outros têm apresentado evidências de que TACE (ADAM 17) e MMP14 (MT1-MMP) decompor MUC1 [18], [19]. Os primeiros relatórios postulado que após a clivagem MUC1, os divulgados, porção de elevado peso molecular associados com a re-a ligada à membrana fragmento de baixo peso molecular, tornando-se assim o ligando para o receptor ligado à membrana [20].

O presente relatório centra-se na expressão e função do produto de baixo peso molecular de clivagem peso MUC1 que permanece-ligada à membrana após a maior parte do domínio extracelular foi clivada e libertada da superfície da célula.

resultados

Caracterização de um romance MUC1 anticorpos

a fim de investigar os padrões de expressão de MUC1 e seu produto de clivagem, bem como suas respectivas funções, precisávamos desenvolver anticorpos que poderão distinguir o produto de baixo peso molecular de clivagem do full-length proteína em células intactas e espécimes de tecidos. Os anticorpos que reconhecem os motivos repetidos em tandem (VU4H5, Santa Cruz) e a cauda citoplasmática (Ab-5, LabVision) estão comercialmente disponíveis (Fig. 1A). No entanto, os anticorpos que reconhecem a porção extracelular do produto de clivagem ligada à membrana não são. Para complicar, o local exato (s) em que MUC1 é clivada em células de câncer não é clara. Vários sítios de clivagem para MUC1 Foram relatados ou postulada [21], [22]. De facto, uma das enzimas que cliva MUC1, MMP14, podem clivar os seus substratos em múltiplos locais [23]. No entanto, nenhum local de clivagem que tem sido relatado ou proposto produzir um fragmento ligado a membrana com um domínio extracelular mais curto do que quarenta e cinco ácidos (45) amino. Portanto, levantou um anticorpo contra a quarenta e cinco (45) peptídeo de amino ácido (N-1110-1154-C) que é imediatamente N-terminal ao domínio transmembranar (Fig. 1B). Nós fundamentado que este anticorpo que reconhece os produtos ligados à membrana de todos os locais de clivagem relatados ou propostos. Devido à incerteza da posição precisa de clivagem MUC1, aqui, que genericamente se referir a todos os produtos de clivagem de MUC1 ancorada à membrana como MUC1 *. Da mesma forma, nos referimos a anticorpos criados contra o péptido de quarenta e cinco ácido amino (N-1110-1154-C) como anti-MUC1 *. Tanto anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram gerados e que essencialmente realizada de forma equivalente.

. proteína MUC1 de comprimento total é constituído por uma cauda citoplasmática (CT), um domínio transmembranar (TM), um domínio de auto-agregação (SAD), e centenas de repetições em tandem (TRs). A clivagem do produto B., MUC-1 *, consiste na cauda citoplasmática, domínio transmembranar, e, pelo menos, 45 aminoácidos do domínio extracelular (ECD). Embora o local exato (s) de clivagem permanecem um pouco incerto, a nosso conhecimento, não há locais de clivagem ter sido relatado que deixar menos de um ECD ácido amino 45. locais para anticorpos VUH5, Ab-5 e Anti-MUC1 * obrigatório estão marcados. C. Análise de Western de lisados ​​de células inteiras de células cancerosas em cultura de MUC1-positiva, as pistas 1-6, são comparados com células de MUC1-negativa, pistas 7-9. Um gel de 6% (superior) foi transferida com VU4H5 e um gel de 12% (inferior) foi transferida com anti-MUC1 *. D. T47D, as células de cancro da mama cultivadas MUC1-positivo, foram imunoprecipitados com Ab-5 ou anti-MUC1 *. As amostras de todo o lisado celular (WCL), pista 1, ou os imunoprecipitados, pistas 2 e 3, foram analisados ​​por Western blot. Os géis foram sondadas com qualquer VU4H5 (superior) ou anti-MUC1 * (inferior). E. Análise de Western de três linhas de células de cancro da mama positivo de MUC1-desglicosilação pré e pós e colocados a hibridar com anti-MUC1 * mostra que o peso molecular real da proteína MUC1 clivada é de aproximadamente 16-18 kDa. F. A tabela resume as reactividades dos anticorpos, quer de comprimento completo de MUC1 (Oi MW) ou clivados MUC1 (Lo MW).

Anti-MUC-1 * Os anticorpos foram caracterizados por Western Blot, FACS, e imunocitoquímica. A Figura 1C mostra uma transferência de Western na qual os lisados ​​celulares a partir de um painel de células cancerígenas cultivadas MUC1-positivas foram sondadas com qualquer VU4H5 (gel superior) ou anti-MUC1 * (gel inferior). Como esperado, o VU4H5 coradas de alto peso molecular a partir de MUC1 espécies de todas as células positivas de MUC1-testados: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, BT474, DU145, e Capan 2. Anti-MUC-1 * coradas um peso molecular baixo 20-35 banda de proteína kDa que parecia ser específica para MUC1. células de MUC1-negativa, HCT116, 3Y1, e HEK293, não reagiu com qualquer dos anticorpos. Para confirmar que as espécies de baixo peso molecular que reagiram com anti-MUC1 * foi de facto MUC1, os lisados ​​de células de tumor MUC-1-positivos foram imunoprecipitados com Ab-5 (anticorpo cauda citoplasmática) ou anti-MUC-1 *, em seguida, analisado por Western blot ( A Fig. 1D). Anti-MUC1 * liga-se às mesmas espécies de baixo peso molecular que Ab-5 reconhece, confirmando assim que o anti-MUC1 * liga-se ao peso molecular do produto de clivagem de baixo MUC1.

Como relatado anteriormente, por análise de Western Blot, as espécies de peso molecular elevado MUC1 reagiu apenas com anticorpos dirigidos contra as repetições em tandem, e não reagem com anti-MUC1 * ou Ab-5 (dados não apresentados). No entanto, ambos os anticorpos são capazes de imunoprecipitar fracamente as espécies de elevado peso molecular (Fig. 1D, gel superior). Nestas experiências, a imunoprecipitação pode simplesmente derrubar um hetero-dímero não covalentemente associada dos dois fragmentos de clivagem. Estes resultados, também pode ser explicada pelo facto de VU4H5 liga-se a uma unidade de repetição em tandem que é repetido centenas de vezes por receptor, enquanto anti-MUC-1 e Ab-* 5 ligam-se a sequências de não-repetição que ocorrem apenas uma vez por receptor. Em alternativa, estes resultados podem simplesmente ser explicados pelo facto de que a principal espécie em células cancerosas, é a forma clivado, MUC1 *. A tabela da Figura 1 resume os dados de ligação de anticorpos.

Para explorar ainda mais o tamanho real das espécies de baixo peso molecular MUC1, lisados ​​celulares foram desglicosilada antes da análise western blot. A Figura 1E mostra que após desglicosilação, a anteriormente ampla banda de proteína de 20-35 kDa converge para uma banda discreta que corre com um peso molecular aparente de cerca de 15-17 kDa. Nota-se que o peso molecular calculado de um produto de clivagem de MUC1, trunacted após cerca de quarenta e cinco aminoácidos do domínio extracelular é de aproximadamente 16 kDa.

padrões de expressão de MUC-1 e a sua clivagem de produto, MUC-1 *, em Cultured células e tecidos no cancerosas

células cancerosas cultivadas foram analisados ​​por imuno-citoquímica para determinar o padrão de expressão de MUC1 e sua MUC1 produto de clivagem *. células de cancro da mama de MUC1-positivos foram duplamente coradas com VU4H5 que se liga a unidades de repetições em tandem no fragmento de peso molecular elevado e anti-MUC1 * que se liga ao baixo peso molecular, o produto de clivagem ligada à membrana, MUC1 *. imagiologia fluorescente revelou que a MUC1 * é a forma predominante da proteína em células cancerosas em cultura e é uniformemente distribuído sobre a superfície da célula inteira. Em contraste, as proteínas que foram coradas por VU4H5 não estavam presentes em todos ou eram as espécies menores (Fig 2A). VU4H5 coloração pode indicar que a proteína sobre a superfície é de comprimento completo ou MUC1 que é um hetero-dímero não covalentemente ligado que consiste de ambos os produtos de clivagem. Notavelmente, o padrão de expressão de MUC-1 de comprimento completo é agrupado em um ou dois pontos na superfície da célula, o que é uma reminiscência da tendência de MUC1 no epitélio saudável para aglomerar na fronteira apical.

. imagiologia fluorescente de células de cancro da mama em cultura mostra que o produto de clivagem de MUC1 * (vermelho) é a espécie predominante e é uniformemente distribuído sobre a superfície da célula inteira. Full-length MUC1 (verde) é a espécie menor e está agrupado. As células foram duplamente coradas com anti-MUC1 * (vermelho) que se liga a um epitopo dentro da membrana primeiros 45 aminoácidos proximais do domínio extracelular e VU4H5 (verde) que se liga a um epitopo no domínio de repetição em tandem da proteína de comprimento completo . ESTAR. Os pares de secções contíguas de amostras de tecidos humanos de doentes não tratados foram coradas com anticorpos anti-MUC-1 * (esquerda) ou VU4H5 (à direita). As imagens foram fotografadas em 10 × ou 100 vezes. B. Uma secção transversal de um tubo falópico não-canceroso mostra a coloração da superfície MUC1 * na borda luminal (inferior esquerdo). Full-length MUC1 é citoplasmática (inferior direito). C. mama amostras de tecido de câncer. D. pulmão espécimes de cancro. E. espécimes câncer de cólon. Setas apontam para as partes mais envolvidas do tecido canceroso, onde toda a arquitetura celular foi perdido e tecido não está manchada pelo VU4H5.

A seguir, olhou para o padrão de full-length MUC1 contra MUC1 expressão * espécimes de tecidos cancerosos humanos saudáveis ​​e de pacientes não tratados. Cortes seriados de uma trompa de Falópio não-cancerosas foram coradas com anti-MUC1 * ou VU4H5. Ambos os anticorpos MUC1 manchado a superfície luminal da trompa de Falópio, mas não o tecido circundante (Fig. 2B, painéis superiores). 100 vezes de ampliação revelou que a forma clivado, MUC-1 *, é expresso exclusivamente no

superfície das células epiteliais que revestem o tubo, enquanto que a proteína MUC1 de comprimento completo aparece para ser limitada para o citoplasma (Fig. 2B, pains inferiores). secções de costas com costas de mama canceroso, pulmão, cólon e tecidos foram igualmente testadas com dois anticorpos (Fig. 2C-E, respectivamente). Em nítido contraste com o padrão de expressão de MUC-1 em tecidos normais, o que só atinge a borda luminal, MUC-1 é expressa em toda a superfície dos tecidos cancerosos. A coloração com anti-MUC1 * mostra que, tal como em células cancerosas em cultura, a principal forma de MUC1 em tecidos cancerosos é MUC1 *. imagens ampliadas mostram que a MUC1 * é expresso na célula

superfície de comprimento completo, enquanto MUC1 parece ser citoplasmática (Fig. C, D, painéis inferiores). Notavelmente, anti-MUC1 * produzidos coloração mais pesado do que VU4H5 apesar do facto de o anticorpo repetição em tandem pode ligar-se a centenas de epitopos por receptor em comparação com o único epitopo ao qual anti-MUC1 * se liga. Alguns dos tecidos cancerosos que testadas não coraram positivo com anticorpo MUC1. De nove (9) espécimes de cancro da mama testados, apenas um era um câncer MUC1-negativo, o que corresponde aproximadamente a relatórios publicados que aproximadamente 90% de todos os cancros da mama são cânceres MUC1-positivo. Notamos que as amostras de tecido que foram considerados cancros MUC1-negativas mostraram coloração apical normal com ambos os anticorpos MUC1 em regiões fora da margem de malignidade (dados não mostrados), confirmando que o ensaio foi correctamente executada, mas que estes cancros não foram caracterizados pela expressão aberrante de MUC1.

É importante ressaltar, notamos que algumas amostras de tecido manchado positivo para a presença de MUC1 *, mas negativo para full-length MUC1. Por exemplo, uma amostra de cancro de cólon foi corado por Anti-MUC-1 * com a coloração mais intensa que ocorre nas partes mais doentes do espécime. Em contraste, VU4H5 levemente áreas perto da margem de malignidade coradas mas não produziram coloração nas regiões mais doentes, caracterizada pela perda da arquitectura celular (Fig. 2E). Estes resultados são consistentes com a ideia de que os espécimes mais cancerosas pode parecer negativo MUC1-se sondadas com anticorpos contra a proteína de comprimento completo sozinho. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que as espécies predominantes de MUC1 no tecido canceroso, tal como em células cancerosas em cultura, as espécies clivadas é, MUC-1 *.

MUC1 * medeia o crescimento celular

Depois de determinar que a espécies principais sobre a superfície de células e tecidos de cancro é * MUC1 e não a proteína de comprimento completo, decidimos estudar as características de crescimento da forma clivada em comparação com não clivada. células de MUC1-negativa, 3Y1 e HCT116 foram transfectadas com qualquer um de comprimento completo ou uma construção de MUC1, MUC1 *

1110, cujo domínio extracelular foi terminada depois de quarenta e cinco (45) aminoácidos (N-1110-1255-C ) (Fig. 1B). Os transfectantes estáveis ​​acabou por ser inadequado para o estudo porque os transfectantes de comprimento completo rapidamente evoluiu para uma população dominada pela forma clivado, MUC-1 *, tendo pouca ou nenhuma proteína de comprimento completo disponível na superfície celular (dados não mostrados). Por esta razão, os clones de células individuais foram gerados e utilizados nas experiências descritas no presente estudo. FACS, imunocitoquímica e análise de Western blot mostrou que os nossos clones de células únicas de comprimento completo de MUC1 produzida a proteína de comprimento completo mas também gerou o produto de clivagem de MUC1 * (Fig. S1).

Um ensaio clonogénico foi realizada para avaliar a taxa de crescimento da proteína MUC1 *

1110 contra MUC1 de comprimento completo que tinha sido transfectado para fibroblastos de rato células 3Y1. As células plaqueadas a baixa densidade foram deixadas a crescer durante nove (9) dias. colónias resultantes foram visualizadas por coloração com violeta de cristal. MUC1 *

1110 clones, 3Y1 MUC1 * 3 e 3Y1 MUC1 * 44, produziu mais colônias, maiores e mais densas do que os clones de comprimento total, 3Y1 MUC1 8 e 3Y1 MUC1 17 (Fig. 3A). No final de nove dias, a MUC1 *

1110 clones produzidos de cinco a dez vezes mais células do que os clones de comprimento completo. A diferença no crescimento foi quantificado através da medição da quantidade de violeta de cristal, que foi libertado a partir das células em cada placa (Figura 3A:. Gráfico de barras). No entanto, o aumento do número de células poderia ter sido devido a um aumento na taxa de sobrevivência ou um aumento na taxa de crescimento. factores de sobrevivência celular podem ser identificados pela sua capacidade para tornar as células resistentes à morte induzida por quimioterapia. os clones de células individuais de MUC1 ou MUC1 *

1110 que tinha sido transfectado em células de MUC1-negativa (3Y1 ou HCT116) foram tratadas com AraC, cisplatina ou etoposido, seguida ensaiados para medir a quantidade de morte celular. As células transfectadas com um ou outro de comprimento completo de MUC1 ou MUC1 *

1110 tornaram-se resistentes à apoptose induzida por estes agentes de quimioterapia. Uma experiência representativa é mostrada na Figura 3B. Estes resultados argumentam que MUC1 ou MUC1 * sobrevivência aumento celular. Para determinar se eles também aumentar o crescimento celular, foi realizada uma experiência de análise do ciclo celular. FACS foi utilizada para medir o número de células na fase G2 /M (um indicador de divisão celular) em comparação com o número em fase G1. A proporção de células em G2: G1 foi medida para as células HCT-116 transfectadas com MUC1 de comprimento completo ou MUC1 *

1110 (Fig 3C.). A introdução de qualquer MUC1 *

1110 ou full-length MUC1 levou mais células na /fase G2 M do que a transfecção do vector vazio de controlo. No entanto, a transfecção de MUC1 *

1110 aumentou a proporção de G2:G1 mais do que a transfecção do proetin de comprimento completo. Lembre-se que embora as células são transfectadas com a proteína de comprimento total, uma quantidade considerável é proteólise à MUC1 * formulário.

A. Um ensaio clonogénico foi realizada nos clones de células únicas de células 3Y1 de MUC1-negativa que tinham sido transfectadas com um vector vazio, de comprimento completo ou MUC1 MUC1 *

1110. Uma fotografia das placas de Petri que contêm as células plaqueadas a 1000 células por 100 mm cultivadas durante 9 dias, e depois coradas com violeta de cristal. gráfico de barras quantifica o crescimento de cada clone. O violeta de cristal absorvida pelas células em cada placa foi libertado e a absorvância a 590 nm foi medida num espectrofotómetro. Medidas de absorção foram normalizados para a quantidade de violeta de cristal libertado a partir do clone de vector vazio. Nomenclatura para os nossos clones única célula é “célula-mãe name /construção /clone #”. B. Resistência à morte celular induzida pela droga de quimioterapia de AraC é testado em clones de células únicas de qualquer vector vazio, de comprimento completo ou MUC1 MUC1 * transfectados em células 3Y1. C. análise do ciclo celular foi realizada em cada vector vazio, full-length MUC1 ou MUC1 * transfectado em linha celular MUC1-negativos HCT116. A relação entre a percentagem de células em G2 para a fase G1 é representada graficamente em função da concentração de soro. A proporção de% G2:% G1 para os transfectantes de vector vazio foram normalizados para 1. D. O crescimento de células de cancro da mama de MUC1-positiva, ZR-75-30, é estimulada pela adição de bivalente (BV) anti-MUC1 * e inibida pela adição de a monovalente (MV) de Fab. A adição de anticorpo bivalente produz a curva de crescimento em forma de sino, que é característica de dimerização do receptor. O crescimento de células HEK 293 MUC1-negativo não foi impactada tanto pela bivalente ou monovalente anti-MUC1 *. E. A estimulação do crescimento por meio da adição de anti-MUC1 bivalente * é testado utilizando siRNA transfectadas de forma estável para suprimir a expressão de MUC-1 na linha celular de cancro da mama T47D. Bivalente Anti-MUC-1 estimulou o crescimento de células transfectadas com ARNsi de controlo, mas não afectou significativamente o crescimento nas células reprimidas MUC1. A análise por Western blot (inserção) mostra que a MUC1 siARN suprimida a expressão MUC-1 em cerca de 90%. células de cancro da mama F. MUC1-positivos, T47Ds, são tratados quer com anti-MUC1 bivalente * ou o monvalent Fab, em seguida, analisado por Western para detectar a presença de ERK1 /2. Borrões mostram a indução de fosforilação ERK2 por bivalente Anti-MUC1 * e inibição da ERK1 basal /2 fosforilação após o tratamento com a monovalente dois dias (2 D) Fab.

Assim, tendo estabelecido uma ligação entre * MUC1 e crescimento, especulamos que ele pode funcionar como um receptor do factor de crescimento. Sem um ligando conhecido para o MUC1 ou MUC1 *, seria difícil para testar a hipótese. No entanto, os receptores de factores de crescimento da classe I desencadeiam o crescimento celular através da dimerização de domínio extracelular do receptor. Tivemos um anticorpo bivalente contra a MUC1 *

1110-ECD (domínio extracelular) porção, que pode ser usado para simular o seu ligando. Outros haviam previamente relatado que a estimulação desta classe de receptores do factor de crescimento com dimerização anticorpos curvas de crescimento em forma de sino gerados [24] – [26]. Isto é por causa de crescimento celular aumenta com o aumento da concentração de anticorpo até que o crescimento máxima é alcançada quando um anticorpo dimeriza cada dois receptores. No entanto, como a concentração de anticorpo vai para o excesso, cada anticorpo se liga a um receptor, de modo que não ocorre dimerização, e o crescimento celular cai. Realizamos experimentos semelhantes por tratamento de células cancerosas MUC1-positivas, bem como MUC1 e MUC1 *

1110 células transfectadas com anti-MUC1 *. Como controlo negativo, as células tratadas com o monovalente Fab de anti-MUC1 *, o que não seria capaz de dimerizar os receptores. Para cada MUC1-positivo ou MUC1 *

1110-positivos linha celular que nós testamos, o anticorpo bivalente estimulou o crescimento celular e a curva de crescimento produzidos em forma de sino esperado. Em contraste, a monovalente Fab não só não estimular o crescimento celular, mas induziu a morte celular. Os resultados de uma tal experiência é apresentado na Figura 3D, onde o crescimento de células cancerosas de mama de MUC1-positiva, ZR-75-30s, é estimulada por anti-MUC1 * e inibida pela monovalente Fab. células HEK293 MUC1-negativos não são afetados por qualquer dos anticorpos. anticorpos de controlo, quer bivalente ou monovalente, não teve efeito sobre o crescimento de células de crescimento do tumor de MUC1-positiva (Fig. S2). Para confirmar que o anticorpo-estimulação do crescimento celular foi especificamente mediada por MUC1, as experiências foram repetidas usando células de cancro da mama de MUC1-positiva, T47Ds, que tinham sido transfectadas de forma estável com siRNA para knockdown expressão MUC-1. o crescimento de células T47D é estimulada pela adição de anti-MUC1 bivalente * e a curva de crescimento em forma de sino característica é produzido. No entanto, em células nas quais a expressão MUC-1 foi suprimida por, pelo menos, 90%, o anticorpo não tem qualquer efeito estimulador (Fig. 3E). Por fim, as experiências mostraram que a estimulação de células-MUC1 positivo com bivalente anti-MUC1 * induziu a fosforilação de ERK1 /2. Em contraste, a monovalente fragmento Fab de anti-MUC1 * suprimida níveis basais de ERK1 /2 (Fig. 3F). A fosforilação de ERK1 /2 é um passo chave na activação da cascata de sinalização da MAP cinase. Tomados em conjunto, estes resultados são consistentes com a ideia de que a MUC1 * é um receptor do factor de crescimento ou co-receptor que medeia o crescimento celular por meio de dimerização do domínio extracelular, após o que a MAP-cinase é activada via de sinalização.

* MUC1 ligandos de activação

Se MUC1 ou MUC1 * funciona como um receptor do factor de crescimento que é activado por dimerização do domínio extracelular, então segue-se que as células de cancro de MUC1-positivas podem secretar um ligando (s) dimeriza�o. Concebemos um ensaio de nanopartículas para rastrear os lisados ​​de células de cancro e os sobrenadantes para a presença deste ligando. MUC1 * peptídeos

1110-ECD (N-1110-1054-C: ver Fig. 1B) foram ligados a nanopartículas de ouro através de um tag histidina C-terminal e lisado /amostras de sobrenadante foram adicionados [27]. Se um ligando dimeriza�o estavam presentes, seria ligar simultaneamente a um primeiro peptídeo numa primeira nanopartículas e um segundo péptido de uma segunda nanopartícula, causando, assim, grandes quantidades de nanopartículas de reticulação e péptidos. Devido a uma propriedade inerente de nanopartículas de ouro, reticulação provoca uma mudança de cor de rosa característica a um roxo /azul [28]. A adição do ligado /misturas sobrenadante para MUC1 * nanopartículas de rolamento peptídicas

1110-ECD causou a solução para ficar roxo /azul. A taxa de mudança de cor corresponde aproximadamente à quantidade de MUC1 que cada linha celular produzida. Sem alteração de cor quando o lisado resultou /misturas de sobrenadante foram adicionados a nanopartículas contendo um péptido de controlo (Fig. 4A).

. misturas ligado de sobrenadante a partir de um painel de células de cancro da mama de MUC1-positivos foram testados para a presença de um ligando capaz de dimerização de uma proteína MUC1 *

1110-ECD péptido (membrana proximal 45 aminoácidos do domínio extracelular: 1110-1155) . misturas ligado de sobrenadante foram incubadas com nanopartículas tendo um péptido de controlo ou um péptido MUC1 *

1110-ECD,-marcado com histidina na extremidade C-terminal. A mudança de cor solução de nanopartículas de rosa para um roxo /azul indica que uma espécie em que a mistura tenha ligado simultaneamente a dois ou mais MUC1 * peptídeos

1110-ECD. B. bivalente (BV) Anti-MUC-1 * (0,77 ^ g) é adicionado para nanopartículas que ostentem um péptido de controlo (linha A) ou MUC1 *

1110-ECD, peptídeos (linha B). ligação a dois peptídeos em nanopartículas separados anticorpo causa agregação de nanopartículas e a mudança de cor solução do rosa ao roxo /azul. Na linha A, poços 3-5, esta agregação é inibida pela adição monovalente anti-MUC1 * Fab (Fab MV). C. NM23 a 0,05, 0,1 ou 0,2 uM, (linhas A, B e C, respectivamente) é adicionado para nanopartículas que ostentam MUC1 * péptidos

1110-ECD (Colunas 2-5). Adicionado NM23 induz uma alteração de cor, presumivelmente como dímeros NM23 se ligam a MUC1 imobilizada-nanopartícula * péptidos

1110-ECD. A adição de anti-MUC1 monovalente * (MV Fab), nas colunas 3-5, inibe a mudança de cor. D. O meio condicionado a partir de células de MUC1-positivas de cancro da mama, T47Ds, e fibroblastos de rato MUC1-negativas, 3Y1s, foi misturado com os grânulos tendo a MUC1 *

1110 péptido-ECD. espécies imunoprecipitados foram então analisados ​​por western, em que o gel foi transferido com um anticorpo anti-NM23. O western blot mostra que T47Ds secretam NM23 enquanto 3Y1s não. E. ressonância de plasma de superfície (SPR) foi utilizado para detectar a ligação directa entre a NM23 (15 nM) e peptídeos MUC1 *

1110-ECD. O Sensograma mostra que 1044 UR de NM23, injectado a 15 nM, ligado a uma superfície de apoio péptidos de MUC1 *

1110-ECD (linha a cheio), mas não NM23 ligado a uma superfície de controlo do rolamento um péptido irrelevante (linha tracejada). F. A estimulação do crescimento de células do cancro da mama T47D por NM23 é dependente da expressão de MUC-1. Exógena NM23 adicionado a T47D células de câncer de mama estimula o crescimento e produz em forma de sino curva indicativa de dimerização do receptor. O crescimento é muito reduzida em células que expressam de forma estável ARNsi específicos de MUC-1, em comparação com células que expressam um ARNsi de controlo. Western blot quantifica a supressão siRNA de MUC1.

Para identificar o que parecia ser um MUC1 * ligando (s), esferas de rolamento MUC1 *

1110-ECD peptídeos foram usadas para imunoprecipitar as proteínas desconhecidas a partir do lisado /misturas de sobrenadante de células de cancro de MUC1-positivos. Os eluatos foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas utilizando métodos de coloração de prata. Havia basicamente apenas duas bandas que foram precipitadas pela MUC1 *

peptídeo 1110-ECD e não precipitadas por um peptídeo de controle: a 23 kDa banda proeminente e um mais fraco 17 kDa banda (Fig S3.). As bandas de proteína foram excisadas do gel e analisados ​​utilizando N-terminal de microssequenciação, o que lhes identificado como NM23, isoformas de H1 e H2, respectivamente. NM23 é normalmente encontrada no citoplasma de todas as células, mas é muitas vezes secretada por células cancerosas [29] que indicam que pode ser um ligando para a porção extracelular da proteína MUC1 *. Os sobrenadantes das células foram imunoprecipitados com MUC1 *

1110 sub-ECD péptidos ligados a esferas, em seguida, analisadas por western blot. Os sobrenadantes de células de cancro de MUC1-positivos, mas não as células de controlo, gerado por uma banda de proteína forte em cerca de 23 kDa que reagiu com anti-NM23H1 (Fig. 4B). Isto confirmou que as proteínas nos sobrenadantes de células cancerosas que foram imunoprecipitadas com MUC1 *

1110-ECD peptídeos eram de fato NM23.

Para detectar a ligação directa entre NM23 e MUC1 *

1110-ECD peptídeos e para confirmar a especificidade, foi realizada uma outra experiência de nanopartículas. NM23 humana recombinante foi adicionada a MUC1 * nanopartículas

1110-ECD-peptídeo-rolamento ou nanopartículas contendo um peptídeo de controle. A adição de NM23 a nanopartículas que carregam MUC1 *

1110-ECD, causou uma mudança de cor solução do rosa ao roxo /azul e o grau de mudança de cor era uma função de concentração NM23. O monovalente Fab de anti-MUC1 * inibida competitivamente a ligação entre MUC1 * peptídeos imobilizados em partículas e NM23 (Fig. 4C). Para demonstrar ainda mais a especificidade do ensaio em si nanopartículas, bivalente anti-MUC1 foi adicionado ao MUC-1 *

1110-ECD-péptido de suporte de nanopartículas, que resultou como esperado na rosa a mudança de cor azul. Que a ligação foi também inibida de forma competitiva pelo monovalente Fab (Fig. 4D).