brasileira
Abstract
O carcinoma hepatocelular (HCC) é a segunda causa mais comum de mortalidade por cancro em todo o mundo. A maioria dos casos de HCC estão associados com cirrose relacionada com infecções por vírus da hepatite B ou hepatite C crónica. Hipermetilação de regiões promotoras é o principal mecanismo epigenético de silenciamento de genes e esteve envolvido no desenvolvimento de HCC. O objetivo deste estudo foi determinar se a metilação aberrante de
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promotores de genes está associada com a progressão da doença hepática em pacientes brasileiros. níveis de metilação foram medidos por pyrosequencing em 41 (20 HCC, 9 cirrose, e 12 não-cirróticos) amostras de tecido do fígado. taxas médias de metilação em
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foram 16,2% e 12,0% em não-cirrótico, 26,1% e 19,6% no cirrótico, e 59,1% e 56,0% em tecidos de carcinoma hepatocelular, respectivamente , mostrando um aumento gradual de acordo com a progressão da doença, com níveis significativamente mais elevados em tecidos de tumor. Além disso, a hipermetilação de
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foi encontrado na grande maioria (88%) dos casos de HCC. Curiosamente,
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níveis de metilação em amostras de carcinoma hepatocelular foram significativamente maiores no grupo de menor ( 40 anos) dos pacientes, e mais elevada em moderadamente diferenciado do que os tumores pouco diferenciados em (
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0,05). Nossos resultados reforçam a hipótese de que hipermetilação do
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contribui para hepatocarcinogênese e está associado às características clínico-patológicas.
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hipermetilação promotor pode ser um biomarcador valiosa para o diagnóstico precoce do HCC e um alvo molecular potencial para a terapia baseada em epigenética
Citation:. Araújo OC, Rosa AS, Fernandes A, Niel C, Villela-Nogueira CA, Pannain V, et al. (2016)
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Níveis de metilação do promotor em carcinoma hepatocelular, cirróticos e não cirróticos fígado, e correlação com cancro do fígado em pacientes brasileiros. PLoS ONE 11 (4): e0153796. doi: 10.1371 /journal.pone.0153796
editor: Isabelle A. Chemin, CRCL-INSERM, França |
Recebido: 11 de fevereiro de 2016; Aceito: 04 de abril de 2016; Publicação: 14 de abril de 2016
Direitos de autor: © 2016 Araújo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (https://cnpq.br/), conceda número 444071 /2014-8, a NMA e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (https://www.faperj.br/), conceda número E-26 /111,528 /2013, a NMA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de fígado é a segunda principal causa de mortalidade relacionada com o cancro, com uma estimativa de 700.000 mortes por ano em todo o mundo [1]. O carcinoma hepatocelular (HCC) é de longe o tipo mais comum de câncer de fígado primário e um dos poucos tipos de câncer com fatores de risco principais bem definidos. Aproximadamente 80% de todos os casos de carcinoma hepatocelular está relacionado com o vírus da hepatite B crónica (HBV) ou infecções por vírus da hepatite C (VHC) [2], embora alcoolismo crónico e esteato-hepatite não alcoólica (NASH) são também principais causas [3, 4]. Estes factores de risco induzir lesão hepática crónica, muitas vezes levando a cirrose, que está presente em 80-90% de doentes com HCC [4, 5]. Desde HCC prognóstico depende estágio do tumor ao diagnóstico, menores taxas de sobrevivência foram observados entre os pacientes em estágio avançado [6], destacando a importância da identificação de biomarcadores para a detecção de câncer de fígado precoce e intervenções terapêuticas.
A mecanismos moleculares subjacentes hepatocarcinogênese permanecem obscuros. Semelhante a outros tumores, no desenvolvimento e progressão de HCC são devido a um processo de passos múltiplos, incluindo a acumulação de alterações genéticas e epi em genes reguladores, que levam à activação de oncogenes diferentes e inactivação de genes supressores de tumores. A hipermetilação do promotor de ilhas CpG é um mecanismo epigenético de silenciamento do gene envolvido numa vasta gama de cancros humanos, incluindo o carcinoma hepatocelular [7, 8]. metilação do DNA aberrante também foi demonstrada em condições pré-malignas, como nódulos displásicos ou fígado cirrótico [9-11], sugerindo que é um evento precoce na hepatocarcinogênese e um marcador valioso para avaliação de risco. A 1A Ras família domínio associação (
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) ea jusante de tirosina-quinases 1 (
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) são genes supressores de tumores frequentemente silenciada através do mecanismo epigenético em uma variedade de tumores malignos humanos [12, 13] . metilação aberrante destes genes tem sido proposta a desempenhar um papel importante na transformação maligna do hepatócito [10, 14]. Notavelmente, hipermetilação destes genes em HCC tem sido relatada a mostrar variações geográficas, sugerindo que a etnia podem influenciar os níveis de metilação do DNA [10].
O povo brasileiro é o resultado de uma intensa miscigenação entre colonizadores ou imigrantes europeus, Africano escravos e índios nativos. No Brasil, quase 9.000 mortes foram atribuídas a HCC em 2013 [15], e infecção crônica de HCV é o principal fator de risco, sendo responsável por mais de 50% dos casos [16]. Para nosso conhecimento, nenhum relatório foi publicado até agora sobre os fatores epigenéticos associadas ao HCC no Brasil.
Neste estudo, foi realizada uma análise de metilação do DNA quantitativa por pyrosequencing em pacientes brasileiros no HCC, cirrótico, e não estágios -cirrhotic, e avaliou a relação entre os níveis de metilação e características clínico-patológicas, com o objectivo de analisar a importância da hipermetilação do
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como um marcador molecular de HCC.
h3> Declaração de Materiais e Métodos
o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (número de aprovação 139/10) e realizado de acordo com a declaração de Helsinque. Devido à natureza retrospectiva do estudo, a Comissão de Ética concluiu que nenhum consentimento informado por escrito foi exigido dos pacientes.
Pacientes e amostras de tecido
blocos de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina arquivados eram obtidas no Departamento de Patologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Rio de Janeiro, Brasil. amostras de fígado de 20 pacientes com HCC, quatro com cirrose sem HCC e 12 com hepatite crônica (não-cirrótico) foram analisados (Tabela 1). Além disso, o tecido circundante cirrótico foi analisada por cinco doentes com HCC (total = 41 amostras). A análise histológica revelou características compatíveis com hepatite crônica (inflamação com ou sem fibrose) em todos os tecidos do fígado não-cirróticos. HCC e amostras de tecido com cirrose foram obtidos a partir de explantes de fígado ou ressecção cirúrgica, enquanto que os tecidos de pacientes com hepatite crónica foram obtidas por biópsia hepática percutânea. Todos os pacientes com CHC incluídos neste estudo tinham fígados cirróticos.
Os dados demográficos e clínico-patológicos foram obtidas de registros médicos, a fim de avaliar a associação da idade, sexo, histologia e infecções VHB e VHC com a metilação do DNA . O status viral dos pacientes foi estabelecida da seguinte forma: a infecção por HBV, o HBsAg positivo; infecção por HCV, anti-VHC e ARN de VHC positivo; nenhum vírus, HBsAg, anti-HCV e HCV-RNA negativo.
A idade média dos pacientes foi de 57 (intervalo 19-78) anos, sendo 47% deles com idade ≥ 60 anos. Vinte e seis (72%) pacientes eram homens. infecção por VHC foi o principal factor etiológico da doença do fígado (56% dos casos), seguido por HBV (19%). Quatorze (70%) pacientes HCC tinha um tumor moderadamente diferenciado, e dez (50%) tinha um tamanho . 5 cm (Tabela 1)
isolamento de ADN e conversão de bissulfito de sódio
cinco secções de 10 um foram cortadas a partir de cada bloco, desparafinados em 1 mL de xileno absoluto, e re-hidratadas em 1 mL de etanol a 96%. a extracção do ADN genómico foi realizada utilizando o kit de tecido FFPE DNA QIAamp (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com o protocolo do fabricante. Aproximadamente 500 ng de ADN genómico foi submetido a um tratamento de modificação com bissulfito para converter todas as citosinas não metiladas em timinas. Isto foi realizado utilizando o Kit de DNA Metilação de EZ-relâmpago (Zymo Research, Irvine, CA). O DNA modificado foi armazenado a -20 ° C para análise posterior.
análise de metilação do DNA por pyrosequencing
níveis de metilação do DNA de
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regiões promotoras foram medidos pela tecnologia pyrosequencing altamente sensíveis (PyroMark ID Q96, Qiagen) em vários locais CpG. ADN tratado com bissulfito foi amplificado por PCR num volume de 50 reacção mL, que continha 1U de Platinum Taq DNA polimerase, High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 0,2 uM de cada iniciador oligonucleotídico [10], sob as seguintes condições: 94 ° C durante 30 seg; 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, e 68 ° C durante 1 min, seguido por um passo de alongamento final a 68 ° C durante 7 min. Dez microlitros de produto de PCR foi analisado num gel de agarose por electroforese. Os restantes 40 mL do produto de PCR biotinilado foi capturado em esferas revestidas com estreptavidina (GE Healthcare, Milwaukee, WI) e a reacção pyrosequencing foi criada utilizando o kit PyroMark ouro Q96 (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. O conjunto de primers de sequenciamento foi previamente concebido [10]. As percentagens de metilação foram medidos em seis e cinco locais de CpG no
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promotores, respectivamente, e expressa como o meio de todos os CpGs analisados em um determinado gene. Para avaliar as frequências DNA hipermetilação em HCC e amostras cirróticos, cut-off valores para
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foram obtidos a partir do quantil representando a parte superior de 95% dos níveis de metilação em amostras não cirróticos, tal como previamente definido [10]. Portanto, as frequências de hipermetilação DNA foram representados como a percentagem de HCC e amostras cirróticos com níveis de metilação acima do valor de corte para cada gene.
A análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 20.0 (IBM, Armonk, NY). O teste de Kruskal-Wallis (ou teste de Mann-Whitney, quando apropriado) foi utilizado para comparar os níveis de metilação no HCC, cirrótico, e amostras de fígado não cirróticos, bem como para testar associações entre os níveis de metilação e características clínico-patológicas. Erro Tipo 1 foi ajustado para comparações múltiplas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para
p
valores inferiores a 0,05.
Resultados
níveis de metilação do DNA em não-cirrótico, amostras de cirrose e carcinoma hepatocelular tecido
análise pyrosequencing foi realizada com sucesso em 41 (20 HCC, 9 cirrose e 12 não-cirrótico) e 31 (17 HCC, 7 cirrótico e 7 não cirróticos) amostras de tecido para
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, respectivamente. Os resultados da análise quantitativa de metilação do DNA, expressa como a percentagem média de todos os CpG analisadas num dado gene, são mostradas na Fig 1. Em geral, os níveis de metilação foram menores em não-cirrótico, moderada em cirrótico, e mais elevada nos tecidos HCC para ambos os genes. taxas médias de metilação em
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foram as seguintes: 16,2% e 12,0% em não-cirrótico, 26,1% e 19,6% no cirrótico, e 59,1% e 56,0% no HCC tecidos, respectivamente (Tabela 2). Não houve diferença estatística nos níveis de metilação entre os tecidos cirróticos e não cirróticos (
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,
p
= 0,165;
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,
p
= 1,000). No entanto, observou-se uma diferença altamente significativa dos níveis de metilação entre HCC e tecidos não-HCC para ambos os genes (Tabela 2). níveis de metilação em tecidos de pacientes cirróticos sem HCC e tecidos adjacentes cirróticos de pacientes com carcinoma hepatocelular foram também comparados. As diferenças entre estes dois grupos não foram estatisticamente significativas (
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,
p
= 0,652;
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,
p
= 0,231). A correlação da
foi observada DOK1
níveis de metilação entre HCC- e amostras cirróticos emparelhado, com HCC /cirróticos tecidos emparelhados exibem simultaneamente os mais altos ou mais baixos níveis de metilação. No entanto, não foi observada tal correlação em
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metilação (dados não mostrados).
níveis de metilação foram medidos por pyrosequencing em diferentes locais CPG e expressa como a percentagem média de todos CpG analisadas num dado gene. A significância estatística para o nível de metilação do DNA em tecidos não-cirróticos e cirróticos foi calculado por comparação com amostras de HCC.
estatuto de metilação do DNA e os parâmetros clínico
As associações entre as características clínico-patológicos (idade , sexo e histologia) e fatores de risco (níveis de infecções VHB e VHC) por um lado, e metilação em tecidos de carcinoma hepatocelular, por outro lado, são apresentados na Tabela 3. em geral,
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exibiram padrões de metilação semelhantes de acordo com os parâmetros analisados. Encontramos uma diferença estatisticamente significativa no
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níveis de metilação de uma faixa etária para outra (
p
= 0,036), com níveis de metilação mais elevados no grupo de jovens ( 40 anos) dos pacientes . Além disso, níveis significativamente mais elevados (
P
= 0,005) de
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metilação foram observadas em moderadamente differentiated- de HCC em pouco diferenciados. Embora
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níveis de metilação foram maiores nas mulheres e nos tumores HBV positivos, pode ser observada nenhuma diferença estatística. Além disso, não foi encontrada associação entre os níveis de tamanho do tumor e de metilação (Tabela 3).
frequências DNA hipermetilação em tecidos com cirrose e carcinoma hepatocelular
A análise das frequências de DNA hipermetilação revelou que
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genes foram hipermetilado na grande maioria (15/17, 88%) dos fragmentos de CCH (Tabela 4). Além disso, a hipermetilação simultânea de ambos os genes foi detectado em tecidos de 14/17 (82%) HCC. No entanto, foram observadas baixas frequências de hipermetilação entre os tecidos cirróticos (2/7, 29% no
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; 3/7, 43%
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; e 2/7, 29% ambos os genes ). Com relação ao status viral, todos os HCCs HBV positivos mostrou hipermetilação em
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. A hipermetilação concomitante destes genes foi mais frequentemente observada em HBV (3/4, 75%) e HCV (8/9, 89%) tumores positivos do HBV e HCV negativos (1/2, 50%). Da mesma forma, a hipermetilação concomitante foi detectado em 03/02 (67%) de HCV tecidos cirróticos positivos, mas em nenhum (0/4) dos negativa de HCV (Tabela 4). Frequências de hipermetilação foram semelhantes entre os tecidos cirróticos de pacientes sem HCC e tecidos adjacentes cirróticos de pacientes com HCC (dados não mostrados).
Discussão
No presente estudo, analisamos quantitativamente o perfil de metilação do
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genes promotores em fígados não cirróticos e cirróticos sem HCC, bem como em HCC e amostras cirróticos emparelhado. Ambos os genes têm propriedades supressoras de tumor e estão envolvidos em vários processos celulares chave.
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está implicada na via de sinalização de Ras, o que desempenha um papel crucial no controlo do ciclo celular, de estabilização de microtúbulos, adesão celular, motilidade celular, apoptose e [17].
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é expresso em células B e T bem como em células mielóides (macrófagos e neutrófilos), e está envolvida numa vasta gama de vias de sinalização imunor [18]. Nisto,
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níveis de metilação mostrou um aumento progressivo de acordo com a progressão da doença, com níveis significativamente mais elevados em tecidos de tumor. Além disso, observou-se taxas muito altas de
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(88%) e
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(88%) hipermetilação nas amostras de HCC, com uma hipermetilação concomitante de 82%. Estudos anteriores, usando diferentes metodologias, bem como diferentes conjuntos de CpGs, também encontraram altas (76-100%) freqüências de
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hipermetilação no HCC [10, 19-21]. Por outro lado, alguns dados disponíveis sobre o perfil de metilação do
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em câncer de fígado. Um estudo relatou a ocorrência de hipermetilação na maioria (62%) dos fragmentos de CCH [10]. Nossos resultados reforçam a hipótese de uma associação entre o silenciamento epigenético destes genes celulares chave e hepatocarcinogênese. De nota, encontramos concomitante
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hipermetilação em quase 30% dos tecidos cirróticos analisados. metilação aberrante verificou-se não apenas em amostras de pacientes com cirrose e carcinoma hepatocelular, mas também naqueles sem HCC, sugerindo que o aumento dos níveis de metilação num subconjunto de tecidos cirróticos devido à presença de algumas células tumorais é improvável. Esses achados estão de acordo com a noção de que a metilação aberrante em hepatócitos não transformadas pode preceder sua transformação oncogénica e promover o desenvolvimento de câncer de fígado.
A potencial influência da etnia na metilação do DNA não tem sido extensivamente estudada. diferenças No entanto, os relatórios anteriores foram descritos significativas na metilação do DNA genômico global de acordo com a etnia [22, 23]. Tem sido sugerido que alguns polimorfismos genéticos, tais como aqueles de enzimas metabolizadoras de folato, podem contribuir para as diferenças étnicas na metilação do ADN [24]. Lambert et al. [10] têm demonstrado uma associação entre os níveis de metilação em vários genes e área geográfica, com HCC exibindo
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níveis de metilação inferior na Tailândia do que em França. Nosso estudo baseou-se em um conjunto de CpGs analisados anteriormente, e mediu os níveis de metilação do DNA pela metodologia pyrosequencing quantitativa [10]. Curiosamente, observou-se maior
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níveis de metilação em amostras HCC brasileira em comparação com os da Tailândia (2,7 e 3,1 vezes) e França (1,9 e 1,8 vezes), respectivamente. Estes resultados corroboram a noção de que fatores genéticos e /ou ambientais podem contribuir para os /as diferenças geográficas étnicos de metilação do DNA entre os casos de carcinoma hepatocelular.
Vários estudos têm investigado as possíveis associações entre fatores de risco (infecções por HBV e HCV) ou clínica características (idade, sexo, e histologia) e metilação do DNA no HCC [9, 10, 19-21, 25]. associada a metilação do promotor ilha de CpG tem sido considerado um dos mais proeminentes alterações moleculares que podem ser observadas no envelhecimento, [26]. Notável, um estudo anterior mostrou que todos os pacientes acima de 40 anos teve o
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promotor metilado em células não neoplásicas do fígado [27]. No entanto, observou-se níveis mais elevados de
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metilação em tecidos de carcinoma hepatocelular do grupo mais jovem ( 40 anos), com uma diferença estatisticamente significativa entre
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metilação e idade (
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= 0,036). Aqui, todos os pacientes com CHC com menos de 40 anos de idade foram cronicamente infectados com HBV, e pode-se supor que estes pacientes foram infectados há muito tempo, provavelmente por transmissão vertical. Vários estudos têm mostrado que a proteína de HBV X (HBx) aumenta a actividade total de DNA metiltransferase (DNMT) por regulação positiva de DNMTs, promovendo a hipermetilação de genes supressores de tumores específicos [28]. Portanto, o status viral dos pacientes mais jovens podem ter contribuído para os níveis de metilação mais elevados observados em nosso estudo. No entanto, estudos anteriores também encontraram níveis mais elevados de
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metilação em amostras de HCC nos grupos mais jovens, embora as diferenças não foram estatisticamente significativas [9, 10]. Além disso, níveis significativamente mais elevados de
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metilação em tecidos cirróticos na faixa etária 40 anos têm sido relatado anteriormente [10]. Finalmente, descobrimos que os níveis de
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metilação foram maiores nos moderadamente differentiated- de HCC em pouco diferenciados, com uma diferença significativa no
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(
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= 0,005). Nenhum dos pacientes de CHC incluídos no estudo tinham tumores bem diferenciados, para que uma melhor comparação entre a metilação do DNA e do grau do tumor de diferenciação não poderia ser alcançado. Em um trabalho anterior,
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metilação foi quase igual, independentemente de diferenciação HCC [9], ao passo que não há relatos sobre
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metilação e HCC grau de diferenciação até à data.
em conclusão, este é o primeiro relatório sobre os fatores epigenéticos associadas ao HCC no Brasil. Nossos resultados confirmam que hipermetilação do
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contribui para hepatocarcinogênese e é um evento precoce no desenvolvimento do câncer, provavelmente associada a características clínicas bem como os principais fatores de risco. Portanto,
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metilação aberrante pode ser um biomarcador valiosa para o diagnóstico precoce do HCC e um alvo molecular atraente para terapia baseada em epigenética. abordagens não-invasivas, tais como aqueles que medem hipermetilação do DNA livre de células circulantes no soro /plasma, deve ser incentivada.