Abstract

A radioterapia é uma importante opção de tratamento para o câncer de pulmão humano avançados irressecáveis, e um tratamento adjuvante crítica para a cirurgia. No entanto, a radiação como um tratamento do cancro do pulmão está longe de ser satisfatórios, devido a problemas associados com a resistência à radiação em células de cancro e citotoxicidade grave para as células não cancerosas, as quais surgem em doses geralmente administradas a pacientes. Nós identificámos recentemente um novo inibidor promissor de β-catenina /interacção TCF4, denominado BC-23 (C

21H

14ClN

3O

4S) que actua como um potenciador de morte potente celular quando usada em combinação com radiação. exposição sequencial de cancro do pulmão de células sem p53 não pequenas humano (NSCLC) H1299 células a doses baixas de radiação de raios-X, seguido uma hora mais tarde por administração de concentrações citotóxicas minimamente de BC-23, resultou numa indução altamente sinérgica de clonogénico morte celular (índice de combinação 1,0). Co-tratamento com BC-23, em concentrações baixas inibe eficazmente /β sinalização Wnt-catenina e regula negativamente a c-Myc e expressão da ciclina D1. prisão fase S e geração de ROS também estão envolvidos no aumento da eficácia da radiação mediada pelo BC-23. BC-23, portanto, representa uma nova classe promissora de intensificador de radiação

Citation:. Zhang Q, Gao M, Luo G, Han X, Bao W, Cheng Y, et al. (2016) Enhancement of Radiation Sensibilidade em células de câncer de pulmão em um romance pequena molécula inibidor que tem como alvo o Interaction β-catenina /TCF4. PLoS ONE 11 (3): e0152407. doi: 10.1371 /journal.pone.0152407

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, United States |

Recebido: 16 Outubro, 2015; Aceito: 14 de março de 2016; Publicação: 25 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por doações do /Fundo Hendricks Connolly Endowment e da Fundação LUNGevity. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar dos avanços recentes na entrega de radioterapia e quimioterapia para câncer de pulmão localmente avançado, a maioria dos pacientes recaída e sucumbir à sua doença [1-3]. Isto pode ser devido, em grande parte, à presença de células estaminais de cancro do pulmão: uma população de células que é capaz de auto-renovação, a proliferação, e metástase, e que mostra radiorresistência apreciável [4-6]. A cisplatina e paclitaxol são as duas drogas mais amplamente utilizadas em doentes para sensibilizar células de cancro do pulmão para a terapia de radiação [7]. No entanto, os efeitos colaterais e resistência a essas drogas ainda representam barreiras para melhorar seus índices terapêuticos.

cancros do pulmão de não pequenas células (CPNPC) são responsáveis ​​por 85% dos casos de câncer de pulmão humanos [8]. Investigações estão em curso em várias novas classes de pequenas radiosensitizers molécula e seus efeitos de aumento de radiação no CPNPC e outros cânceres humanos [9-12]. Actualmente, uma necessidade crítica continua para a descoberta e desenvolvimento de novos potenciadores de radiação que mostram alta eficiência e baixa toxicidade.

activações aberrante da sinalização /β-catenina Wnt, que resultam no aumento da regulação da auto- renovação e proliferação de células de cancro do pulmão, são fundamentais para a tumorigênese câncer de pulmão, progressão e quimioterapia e radiorresistência [13-15]. A via /beta-catenina Wnt é activado em 75% de todos os casos clínicos testados NSCLC e desempenha um papel crítico na proliferação celular e sobrevivência [16, 17]. Esta via é sobre-activada em NSCLC e muitos outros cancros, devido à sobre-expressão de TCF4, Wnt1 e WNT2 e leva a uma acumulação elevada do β-catenina nos núcleos [18-20]. β-catenina se liga a membros da família Tcf /LEF regulação da expressão de genes alvo, tais como c-myc e ciclina D1 [21-23]. A inibição da sobre-expressão de Wnt 1, Wnt 2 e β-catenina leva a

in vitro apoptose celular

NSCLC e diminuiu

in vivo

tumor em massa [20].

Novas evidências implica a via /β-catenina Wnt na radiorresistência de células de câncer [22, 24]. Nuclear β-catenina e acumulações TCF4 ou Wnt /β-catenina via hiper-ativação são importantes causas de radiorresistência [25]. O silenciamento de TCF4 provoca uma sensibilização significativa de células cancerosas a baixas doses de radiação [26]. Um inibidor da via de sinalização /β-catenina Wnt, GDK-100017, tem sido relatado para aumentar a radiossensibilidade das células NSCLC, bloqueando a interacção β-catenina-Tcf /Lef [24]. As células

estaminais do cancro ou iniciar que têm níveis elevados de β-catenina nuclear pode fugir da morte celular normalmente induzida por radiação. Isto é parcialmente atribuída à acção de β-catenina, em conjunto com os seus genes a jusante, c-Myc e ciclina D1, que medeiam a regulação positiva de auto-renovação e manutenção da haste de cancro /células progenitoras contra subletal ou estímulos letais [22, 27 ]. A inibição da sinalização de Wnt /β-catenina reduz os níveis de c-Myc e ciclina D1, aumentando assim a radiossensibilidade das células cancerosas [24, 28, 29], mas as relações de regulação exacta entre β-catenina, c-Myc, ciclina D1, reactivo espécies de oxigénio (ROS), e ciclo celular prisão /progressão exigem mais esclarecimentos. No entanto, a perturbação específica da interacção entre β-catenina nuclear e TCF4 seguinte tratamento de radiação selectiva representa uma estratégia particularmente promissora para a prevenção da proliferação e sobrevivência de células cancerosas. Esta estratégia também preserva a função benéfica de interações β-catenina com outros ligantes fisiológicos [30].

No presente estudo, relatamos uma nova e potente potenciador de radiação, BC-23 (C

21H

14ClN

3O

4S), que tem como alvo β-catenina interação /TCF4 e sinalização. Em 3 uM, o que é uma dose que provoca pouco citotoxicidade, tratamento BC-23 provoca forte aumento sinergético da morte de células de cancro induzido por doses baixas de radiação (isto é, um aumento de 2 log da morte de células de cancro após combinação com radiação). Down-regulação da expressão de c-Myc, up-regulação da produção de ROS e revogação da G2 /M detenção são os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos de aumento de radiação do BC-23. Este relatório é o primeiro a descrever a superação da radiorresistência em células NSCLC humanas usando uma pequena molécula inibidora de β-catenina /TCF4. Estes dados sugerem uma potencial utilidade e aplicação deste composto para o tratamento de câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Reagentes e cultura de células

BC-23 (NSC45382) foi obtido a partir do banco de dados do NCI. ICRT14, N-acetil-cisteína (NAC), e H

2DCFDA, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich, e Cayman Chemical, respectivamente. células H1299 e H1975 foram adquiridas a partir da ATCC. As células foram cultivadas e mantidas numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2 atmosfera a 37 ° C em RPMI 1640 (Hyclone, Scientific térmica) suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina.

ensaio de ligação competitiva baseada em polarização de fluorescência

polarização de fluorescência (FP) foi realizada de acordo com os nossos relatórios anteriores, com pequenas alterações [31]. Resumidamente, 20 nM traçador [marcado com FITC TCF4

(8-30), sonda] e 500 nM β-catenina foram misturadas e incubadas com /sem BC-23 em 100 ul de PBS (contendo 0,01% de Triton X-100). Após 3 h de incubação à temperatura ambiente, os valores de FP foram registados utilizando um leitor de microplacas Synergy 2 (BioTek) a uma excitação /emissão de 485 /528nm.

TOP-flash repórter luciferase ensaio de gene

células H1299 em 1 × 10

4 células /poço foram transfectadas com o NT /β-catenina gene repórter TOP-flash, abriga TCF4 locais para β-catenina e o vector repórter de controlo de pRL-CMV Renilla luciferase de ligação (Promega, E2261). Quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com várias concentrações de AC-23 ou ICRT14. A actividade de luciferase foi determinada 24 h após o tratamento utilizando o Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, E1910). atividade luciferase TOP foi normalizada pelo controle da atividade PRL-CMV Renilla luciferase.

In silico

Virtual

Preparamos a estrutura do receptor a partir de uma estrutura de cristal de β-catenina /TCF4 complexo (PDB código 1JPW) e realizado um

in silico

triagem virtual usando Autodock4 conforme relatado anteriormente [30].

real-Time PCR

H1299 células foram tratadas com diferentes concentrações de aC-23 durante 16 h. O ARN total foi isolado utilizando um kit RNeasy (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando um kit de transcrição reversa de ADNc de alta capacidade (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizada num LightCycler

® 480 Sistema usando LightCycler

® 480 SYBR Green I Mestre (Roche). Os valores de ciclo limiar (C

T) foram normalizados para a p-actina de referência interno. Os iniciadores utilizados em PCR em tempo real foram como se segue: β-actina, directo 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ‘; reverso 5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3 ‘; c-myc, frente 5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 ‘; reverso 5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 ‘; ciclina D1, frente 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ‘; reverso 5’-GGGGATGGTCTCCTTCATCT-3 ‘.

Ensaio de Citotoxicidade

H1299 células, plaqueadas em placas de 96 poços a 1×10

3 células /poço foram tratados com as concentrações desejadas de BC- 23 em 100 uL meio, e incubou-se durante 1 dia a 3 dias. A viabilidade celular foi determinada pela adição de 20 uL CellTiter-Blue (Promega, G8081) a cada poço. Após uma incubação de 4 h a 37 ° C, a fluorescência foi determinada usando um leitor de microplacas Synergy 2 (BioTek) a uma excitação /emissão de 550 nm /600 nm.

ensaio clonogénico

H1299 células foram irradiadas com 0-10 Gy de radiação (RS-2000 Biological Research irradiador, Rad Fonte). Uma hora mais tarde, as células foram tratadas com DMSO ou 3 fiM AC-23 e incubadas durante mais 24 h. As células foram então semeadas em placas de 6 poços a 500-2000 células por poço, e incubou-se durante 12 dias para permitir a formação de colónias. As colónias consistindo em 50 ou mais células foram contadas sob um microscópio. A eficiência de plaqueamento (PE) foi calculado dividindo-se o número de colónias por o número de células semeadas. A fracção sobrevivente foi calculado dividindo-se os valores de PE por grupos de radiação que um dos grupos não-irradiados correspondentes. O efeito antioxidante do NAC na citotoxicidade induzida por BC-23, e a inibição do crescimento em células H1299 foi determinado após a adição de NAC 1 mM, juntamente com várias concentrações de AC-23, às células. Após incubação durante 24 h, a citotoxicidade e a formação de colónias foram determinadas como descrito acima.

transfecção transiente com CTNNB1 siARN

H1299 células foram plaqueadas em placas de seis poços. Ao atingir 50% a 60% de confluência, as células foram transfectadas com validado humano b-catenina (CTNNB1) siRNA ou siRNA controlo negativo 1 (Ambion, Inc.) a uma concentração final de 100 nM com reagente JetPRIME (Polyplus transfecção, NY EUA ), de acordo com as instruções do fabricante. Após uma transfecção de 24 h, as células foram divididas em 2 grupos, um para transferências de Western e a outra para a análise de sensibilidade à radiação. Para as transferências Western, o meio de cultura foi substituído com meio recém-preparado e as células foram incubadas durante mais 24 h antes da preparação de proteína. Para a análise de sensibilidade à radiação, as células foram tratadas com ou sem radiação 6 Gy. Após a radiação, as células foram tratadas com 3 um BC-23 ou o veículo DMSO e colhidas 48 h após a transfecção por ensaios clonogénicos.

extracção de proteína e análise por Western blot

As células foram recolhidas e lisadas em tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 1% de ácido desoxicólico, ortovanadato de 2 mM, NaF 100 mM, 1% de Triton X-100, 0,5 fluoreto de fenilmetilsulfonilo mM) contendo um inibidor de protease e cocktail de inibidores de fosfatase (Sigma-Aldrich). O teor de proteína foi quantificado pelo método de BCA. As amostras de proteína (20 ug) foram sujeitas a electroforese em géis de 10% poliacrilamida-SDS e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas e incubadas durante a noite a 4 ℃ com um coelho monoclonal anti-β-catenina (1: 1000, Cell Signaling Technology, MA, EUA) anticorpo primário, ou com um monoclonal de ratinho anti-β-actina (1: 2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) como anticorpo primário um controlo de carga. Após a lavagem, as manchas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com peroxidase de rábano (HRP) correspondente -conjugated anticorpos secundários (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), visualizado com solução de ECL (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL, EUA), e expostos usando o ChemiDoc ™ Sistema MP (Bio-Rad).

ciclo celular análise

H1299 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e irradiada com 4 Gy de radiação. Uma hora mais tarde, as células foram tratadas com 5 uM de BC-23 e incubada durante 24 h. Depois de lavadas com PBS, as células foram fixadas em etanol frio a 70% durante 15 min a -20 ° C, e, em seguida, re-hidratadas em PBS, durante mais 15 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos e coradas com iodeto de 3 uM de propídio (PI, Life Technologies, P3566) em 0,5 ml de tampão (100 mM Tris, pH = 7,4, NaCl 150 mM, CaCl 1 mM de

2, MgCl 0,5 mM

2, 0,1% de Nonidet P-40 a) com 1 ug /ml de ARNase A. As células foram incubadas durante 40 min à temperatura ambiente. A análise de citometria de fluxo foi realizada com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 576 nm. ciclo celular foi analisada utilizando FlowJo (versão 9.7.5) software de análise.

Determinação da ROS produção

A geração de ROS foi determinada utilizando o H

ensaio baseado em 2DCFDA, de acordo com os métodos publicados anteriormente [32, 33]. Resumidamente, as células H1299 foram plaqueadas em placas de 96 poços a 2,5 x 10

4 células /poço e cultivadas durante 24 h. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram incubadas com 20? M H

2DCFDA (Cayman Chemical) a 37 ° C durante 45 min e depois tratou-se com BC-23, a radiação, ou uma combinação de BC-23 mais radiação. A intensidade de fluorescência (excitação /emissão = 485/535 nm) foi gravado durante 2 h utilizando um leitor de microplacas Synergy H1 (BioTek).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando o One de direcções ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey (Prism 5.0, GraphPad Software).

valores P Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os valores médios foram expressos em média ± S.D. Os efeitos anticancerígenos combinados de BC-23 e de raios-X de radiação foram determinadas usando Chou e método Talalay: CI (índice de combinação) = [(D)

1 /(Dx)

1] + [(D)

2 /(Dx)

2] + (D)

1 (D)

2 /(Dx)

1 (Dx)

2, em que (D)

1 e (D)

2 representam as doses de tratamento 1 (BC-23) e 2 (radiação) que produzem o efeito X quando utilizado em combinação, (Dx)

1 e (Dx)

2 são as doses de tratamentos 1 e 2 que produzem o mesmo x efeito quando usado sozinho.

resultados

BC-23 inibe a ligação entre β-catenina e TCF4 e /β-catenina Wnt sinalização

Nós determinamos os efeitos inibitórios diretos de compostos selecionados na interação entre β-catenina e TCF4 usando o nosso ensaio de ligação competitiva livre de células recém-desenvolvido com base na polarização de fluorescência (FP). Entre os compostos testados, BC-23 exibiram actividade forte (IC

50 valor de 1,7 uM) contra a ligação entre β-catenina e um marcado com FITC TCF4

(8-30) sonda (Figura 1). BC-21, o que foi relatado pelo nosso grupo como um inibidor da via /β-catenina Wnt, foi utilizado como controlo positivo em ensaios de FP. BC-21 tratamento inibiu as β-catenina /Tcf-4 interações com um IC

valor 50 de 5mM [31]. O TOP-base de luciferase (albergando o TCF /ABL local de ligação) ensaio de repórter (utilizadas para testar o efeito inibidor de BC-23 sobre a actividade de transcrição de Wnt via /β-catenina em células de cancro que sobre-expressam β-catenina) revelou que BC- 23 dependente da dose, inibiu a actividade de TOP-luciferase em células H1299, com uma IC

50 valor de 2,3 uM (Fig 2). Isto sugere ainda que BC-23 como alvo a interacção entre β-catenina e TCF4 e inibiu a actividade de transcrição mediada. Utilizou-se o repórter de luciferase de Renilla-pRL como um controlo interno para o ensaio e ICRT14 (um inibidor de transcrição-β-catenina responsivo) como um controlo positivo. ICRT14 em 1 uM inibido 38% da actividade TOP-luciferase.

Uma mistura de 500 nM β-catenina e 20 nM com FITC TCF4

(8-30) foi incubado na ausência ou na presença do As concentrações indicadas de BC-23. polarização valores de fluorescência (FP) foram registrados após 3 h. A ligação relativa foi calculada como (PM

T-MP

f) /(PM

C-MP

f) × 100. Os pontos representam a média ± S.D. de 3 experiências independentes.

H1299 células foram co-transfectadas com o repórter TOP-flash e os plasmídeos Renilla controle. Quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com várias concentrações de AC-23 durante 24 h. As actividades de luciferase TOP foram determinadas e normalizadas para as actividades da luciferase Renilla. BC-23 exibiram uma actividade inibidora dependente da dose da luciferase em células H1299 em cima, com um IC

50 valor de 2,3 uM. As colunas representam a média ± S.D. de 3 experiências independentes.

BC-23 blocos a interação estrutural da β-catenina com TCF4

Foi analisada a conformação ligação do BC-23 e β-catenina usando acoplagem molecular ( Figura 3A). A interacção de TCF4 Asp16 com β-catenina Lys435 é crítico para a sua ligação. A nossa análise da estrutura cristalina indicou que Asp16 da TCF4 formada uma ligação de hidrogênio com β-catenina Lys435, enquanto Glu17 de TCF4, que foi ao lado Asp16, formou uma ponte de sal com Lys508. Como mostrado na Fig 3B, BC-23 ocupada uma posição em Asp16 e Glu17, formando uma ligação de hidrogénio com a cadeia lateral Asn430 com a distância de 3,08 Â. Isto presumivelmente bloqueia a interação entre TCF4 e β-catenina via Asp16 da TCF4. Além disso, β-catenina Lys508 formada outra ligação de hidrogénio com o átomo de oxigénio do grupo naftoquinona de BC-23 com uma distância de 2,90 Â. O grupo naftoquinona de BC-23 também foram submetidos a interacções hidrófobas com as partes alifáticas de β-catenina Pro505. Isto iria bloquear a interacção de β-catenina com TCF4 Glu17.

Os modelos de ligação foram gerados por AutoDock e PyMOL.

BC-23 melhora significativamente a morte de células clonogénicas, induzida por radiação nas células H1299 NSCLC

H1299 células foram tratadas com várias concentrações de BC-23 para 24-72 h. No final de cada tratamento, a viabilidade celular foi determinada com o ensaio CellTiter azul. BC-23 sozinho exibiu citotoxicidade moderada em direção H1299 células, com IC

50 valores de 7,6 e 4,5 mM para 1 dia e 3 dias de tratamentos, respectivamente (Fig 4A). No entanto, o tratamento sequencial de células H1299 com 2-10 Gy de radiação e 3 um BC-23 resultou num aumento de 2 log na morte clonogénica de células H1299, quando comparado com 10 Gy de radiação sozinha (Figura 4B). O índice de combinação para a morte de células clonogénicas foi inferior a 1. Esta potenciação significativa da morte de células clonogénicas, em células H1299 com a combinação de BC-23 e radioterapia indica um efeito de aumento da radiação de BC-23.

UMA. células H1299 foram tratadas com as concentrações indicadas de BC-23 sozinho para 1 (○) e (3) ● dias. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio CellTiter azul. B. exposição sequencial de células H1299 a 2-10 Gy de radiação, seguido de 1 h mais tarde por tratamento com 3 ^ M BC-23 (■), aumentou drasticamente a indução da morte de células clonogénicas, em comparação com o tratamento de radiação sozinha (●). Cada ponto representa os valores médios de três experiências separadas.

Combinando BC-23 com a radiação aumenta a geração de ROS em células H1299

O grau de estresse oxidativo global foi determinada através da monitorização ROS usando H

2DCFDA. Foram examinados os níveis intracelulares de ROS gerado ao longo do tempo. Os níveis de ROS em 2 h após o tratamento foram duas vezes mais elevada em células tratadas com a administração combinada de 10 Gy de radiação e 3 uM BC-23 do que em células de dados, quer de tratamento sozinho (Figura 5A). O papel potencial de ROS em morte celular BC-23-mediada e a inibição da formação de colónias foi ainda testado usando NAC (um antioxidante) para eliminar o ROS nas células. NAC suprimidos de forma significativa o efeito citotóxico e inibidores do crescimento de BC-23 em células H1299 (Figura 5B-5D).

. Combinando 3 fiM AC-23 com 10 Gy de radiação (x) aumentou dramaticamente a produção de ROS, quando comparado com os tratamentos individuais isolados: controlo de veículo (●), 3 um BC-23 (■), e 10 Gy de radiação (▲). Cada valor é a média ± DP de três experiências separadas. B-D, efeitos citotóxicos ROS-dependentes de BC-23. NAC atenua a morte celular mediada por exposição de células H1299 para as concentrações indicadas de BC-23 em citotoxicidade (B) e ensaios colongenic (C, pratos representativos de ensaios clonogénicos e D, análises de percentagem de células sobreviventes). *, P . 0,05 versus controlo

BC-23 induz a paragem da fase S em células H1299

paragem do ciclo celular na S e G2 /M fases é um importante mecanismo que faz com que a morte celular observada em resposta ao tratamento com uma combinação de radiação e drogas anti-cancro, incluindo inibidores da via Wnt /p-catenina. Um tratamento de 24 h com 5 uM sozinho BC-23 aumentou significativamente a percentagem de células (45%) na fase S, quando em comparação com células de controlo (25%). O tratamento com uma combinação de radiação 4 e 5 uM Gy BC-23 resultou em uma percentagem semelhante de células H1299 em fase S, mas também as células foram bloqueadas na fase G2 /M pelo tratamento de radiação (Figura 6).

H1299 células foram tratadas com o controlo de veículo (A), 5 ^ M BC-23 (B), 4 Gy de radiação (C), e 4 Gy de radiação mais 5 fiM aC-23 (D). A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada por iodeto de propídio (PI) e coloração com análise de FACS. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

BC-23 regula negativamente a expressão de c-Myc e ciclina D1 e β-catenina knockdown por siRNA CTNNB1 bloqueou significativamente o efeito sensibilizador de BC-23

Foi realizado mais testes sobre os efeitos de aC-23 na via Wnt /β-catenina /via de sinalização TCF4 por determinação dos seus efeitos sobre a expressão de c-Myc e ciclina D1, que são dois importantes genes alvo específicos de p-catenina /TCF4 sinalização. Após um tratamento de 16 h com 20 e 40 fiM AC-23, os níveis de c-Myc e ciclina D1 expressão de ARNm foram significativamente reduzidos em células H1229 (Figura 7). Foi examinada a expressão de outros genes (por exemplo, β-actina) que não foram relacionados com a regulação por beta-catenina /interação TCF4 e sua expressão não foi afetada pelo BC-23. Os valores do ciclo limiar da Figura 7 foram normalizados para a referência interna β-actina. Estes dados fornecem provas adicionais de que BC-23 regula negativamente tanto a ciclina D1 e c-myc, que são sobre-expressos em muitas células cancerosas, incluindo células H1229. Nós também utilizado CTNNB1 siRNA para reduzir a expressão β-catenina em células H1299, a fim de determinar se o efeito sensibilizador de BC-23 depende da via β-catenina. Figura 8A mostra que CTNNB1 siRNA reduziu significativamente a expressão β-catenina em comparação com ARNsi de controlo. O silenciamento dos componentes da via /β-catenina Wnt é conhecido para aumentar a radiossensibilidade das células cancerosas. Como esperado, o knockdown de β-catenina por CTNNB1 siARN aumentou significativamente a radiossensibilidade das células H1299, ao passo que a transfecção com ARNsi de controlo não alterou a radiossensibilidade quando comparado com 6 Gy de radiação por si só, como mostrado na Fig 8B. BC-23, o aumento da radiossensibilidade de células H1299 tratadas com ARNsi de controlo. No entanto, a regulação por diminuição da expressão β-catenina com CTNNB1 ARNip bloqueado o efeito sensibilizador de BC-23, quando comparado com o grupo de controlo de siRNA, sugerindo que o efeito sensibilizador de BC-23 depende, pelo menos em parte, na via Wnt /β- catenin caminho.

as células H1299 foram tratadas com as concentrações indicadas de BC-23. O ARN total e ADNc foram preparados após um tratamento de 16 h. O ADNc foi wuantified por PCR em tempo real e normalizado contra um controlo de veículo. tratamento BC-23 inibiu significativamente a expressão de ambos Wnt-alvo /β-catenina genes c-myc e ciclina D1 ao nível do ARNm. Os resultados são representativos de três experiências independentes. *, P 0,05 e ** p . 0,01 versus controlo

As células H1299 foram tratadas com CTNNB1 ou com controle de siRNA. A proteína foi preparada a partir de uma porção das células de Western blotting e as restantes células foram usadas para ensaios de radiossensibilidade com radiação 6 Gy com /sem BC-23. Um, CTNNB1 siRNA reduziu significativamente a expressão β-catenina. B, CTNNB1 siRNA bloqueou significativamente o efeito sensibilizador de BC-23. Os resultados são representativos de três experiências independentes. ****, P 0,001 versus controle; ###, P 0,001 versus 6 Gy + siRNA controle; , p 0,01 versus controlo 6 Gy + siRNA + BC-23

Discussão

Nós determinamos os efeitos inibitórios diretos de compostos selecionados do NCI sobre a interação entre os dois. β-catenina e TCF4 com o nosso ensaio de ligação competitiva isento de células recentemente desenvolvidos com base em FP [31]. Entre os compostos testados, BC-23 exibiram actividade forte (um IC

50 valor de 1,7 uM) contra a interacção entre β-catenina e um marcado com FITC TCF4

(8-30) sonda (Figura 1). Nós também utilizado um TOP-base de células (albergando o sítio de ligação de Tef /ABL) de ensaio de luciferase para testar o efeito de BC-23 na actividade transcricional da via /β-catenina Wnt. BC-23 dependente da dose, inibiu a activação para cima em células H1299, com uma IC

50 valor de 2,3 uM (Fig 2). Estes dados sugerem que a BC-23 alvos a β-catenina interacção /TCF4. A análise da conformação de ligação de BC-23 por acoplamento molecular revelou que BC-23 ocupada uma posição em Asp16 e Glu17 de TCF4, formando duas ligações de hidrogénio com Asn430 e Lys508 e interacções hidrófobas com Pro505 de β-catenina (Fig 3B). Isto indicou que a BC-23 bloqueia a interacção entre TCF4 e β-catenina em Asp16 e Glu17 de TCF4. (Fig 3A 3B)

Testou-se o potencial de BC-23 para actuar como um potenciador para a radiação células NSCLC H1299. Altos níveis de β-catenina nuclear têm sido encontrados em muitas células de cancro do pulmão humano [16]. A presença de células estaminais do cancro do pulmão (LCSCs) que são capazes de auto-renovação, a proliferação e a metástase podem conferir resistência do tumor à radiação [4-6]. Colocámos a hipótese de que a administração de AC-23, pode melhorar a acção de radioterapia em células cancerosas de pulmão através da inibição da interacção β-catenina /TCF4 e sinalização. Em primeiro lugar, determinou-se a citotoxicidade de AC-23 sozinho em células H1299 pelo ensaio CellTiter-Azul. BC-23 sozinho exibiu citotoxicidade moderada para células H1299, com IC

50 valores de 7,6 e 4,5 | iM durante 1 dia e 3 dias de tratamento, respectivamente, conforme ilustrado na figura 4A. Tratamento de H1975 células (um tipo p53 selvagem NSCLC) com BC-23 para 1 e 3 dias resultou em IC

50 valores para BC-23 de 7,9 e 5,2 mM, respectivamente, que eram valores comparáveis ​​aos obtidos para células H1299 . Isto sugere que o efeito citotóxico do CB-23 é independente de p53. O tratamento sequencial das células com 2 a 10 Gy de radiação, seguido de 1 hora mais tarde por administração de 3 um BC-23, o efeito significativamente aumentada de células clonogénicas, mediada por radiação em matar células H1299 (Figura 4B). BC-23, em combinação com radiação de 10 Gy, causou um aumento de 2 log da morte clonogénica de células H1299, quando comparado com 10 Gy de radiação sozinha.

Os mecanismos potenciais pelos quais BC-23 aumenta a morte de células NSCLC foram expostas à radiação mais explorado por meio da análise do ciclo celular e a produção de ROS em células H1299 tratadas com BC-23, e a radiação, por si só ou em combinação. estudo prévio sugere que a via de sinalização /β-catenina desempenha um papel de Wnt na regulação do ciclo celular e localizada-núcleo β-catenina-Tcf aumentos complexos durante S-L

2 [34, 35]. A activação β-catenina está associada com a sobrevivência das células com o ADN danificado (causada por ROS) e com erros de reparação do ADN [36]. BC-23, sozinha ou em combinação com radiação, preso H1299 células em fase S (Figura 6), quando comparado com o controlo do veículo e a radiação por si só. O tratamento combinado de BC23 e parada fase S radiação produzida e G2 /bloco ciclo celular simultânea induzida por radiação M. Estes achados sugerem que ocorre um atraso na transição do ciclo celular e /ou no DNA processo de quebras de cadeia dupla nas células H1299 após co-tratamento com BC-23 e radiação. O atraso na síntese de ADN causada por BC-23 pode piorar a sobrevivência de células submetidas a G

2 /H prisão (Fig 6) causados ​​por exposição à radiação eo resultante ROS (Fig 5). BC-23 induziu significativamente a produção de ROS em células H1299 em uma maneira dependente da dose (Figura 5A). O papel potencial de ROS em morte celular BC-23-mediada e a morte de células clonogénicas foi ainda confirmada usando o NAC antioxidante para eliminar o ROS nas células. tratamento NAC abolido de forma significativa o efeito citotóxico do CB-23 em ambos os ensaios de citotoxicidade e de colónias (Fig 5B-5D). O aumento da ROS induzidos por BC-23 pode inibir ainda mais a β-catenina /TCF4 via porque ROS modular negativamente a via de sinalização Wnt /β-catenina através da regulação para baixo de β-catenina [37].

Nós obtidas confirmação do efeito específico de BC-23 em /β-catenina a sinalização de Wnt /TCF4 examinando a expressão de ARNm de c-myc e ciclina D1, dois genes a jusante da via de críticos /β-catenina Wnt. Observou-se uma inibição significativa da expressão de tanto de c-Myc e ciclina D1 em células H1299 na sequência de um tratamento de 16 h com 20 e 40 fiM AC-23 (Figura 7). Evidência adicional foi fornecido pela observação de que CTNNB1 siRNA reduziu a expressão β-catenina e significativamente bloqueado o efeito sensibilizador de BC-23 em células H1299 (Figura 8). Tomados em conjunto, os ensaios baseados em células sem células e ligando- e específico às vias, bem como

in silico

resultados de encaixe moleculares, demonstrou que BC-23 é um novo inibidor de β-catenina /TCF4 que visa especificamente a β-catenina /interação TCF4 e inibe a sua actividade de transcrição [38].

Conclusão

Temos identificado e caracterizado uma nova molécula pequena BC-23 que tem como alvo a interação de β- catenina /TCF4 e inibe a sua actividade de transcrição. BC-23 regula para baixo duas importantes genes da via Wnt /β-catenina: c-Myc e ciclina D1.