Abstract

Fundo

Um tumor é considerado um complexo heterogêneo em um ambiente tridimensional que esteja alinhada com sinais fisiopatológicos e biomecânicos. interações célula-estroma orientar o desenvolvimento ea geração de tumores. Aqui, podemos avaliar as contribuições dos fibroblastos normais para câncer gástrico.

Metodologia /Principais Achados

Por coculturing fibroblastos normais em monocamadas de BGC-823 células cancerosas gástricas, as células tumorais esporadicamente desenvolvido curta, eixo -como características morfológicas e demonstrou proliferação melhorada e potencial invasivo. Além disso, as células tumorais transformadas demonstraram uma diminuição na formação de tumores e aumento do potencial metastático lymphomatic e intestinal. Células BGC-823 não transformadas, em contraste, demonstra a formação de tumor primário e retardada invasão nó intestinal e da linfa. Observou-se também a perda de E-caderina e a regulação positiva da expressão de vimentina em células de tumor transformadas, o que sugere que o aumento na metástase foi induzida por epitelial-mesenquimal-a transição.

Conclusão

Colectivamente , os nossos dados indicam que os fibroblastos normais suficientemente induzir a transição epitelial-a-mesenquimal em células cancerosas, levando a metástase

Citation:. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et ai. (2014) fibroblastos normais induzir a perda de E-caderina e aumentar Linfonodo metástase em câncer gástrico. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10.1371 /journal.pone.0097306

editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Reino Unido

Recebido: 10 de dezembro de 2013; Aceito: 16 de abril de 2014; Publicado em: 20 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por doações do Fundo Nacional de Key Saúde especial (https://program.most.gov.cn; No.200802112), o Comité do Fundo Nacional de Ciência (https://www.nsfc.gov.cn; projeto geral n .81372302 No.81272120), o Fundo Departamento de Saúde (https://program.most.gov.cn; No.2007A093), o Projeto chave da Província de Zhejiang (https://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). O Fundo de Ciência Natural da província de Zhejiang (https://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121 e Z2080514), e do Fundo de Medicina Tradicional Chinesa Bureau (https://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As metástases são responsáveis ​​por até 90% da mortalidade associada ao câncer. Muitos pacientes que apresentam nenhuma evidência de metástases no momento do diagnóstico inicial, eventualmente desenvolvem metástases. Embora as metástases causar a maioria das mortes por câncer, este processo continua a ser um dos aspectos mais enigmáticos da doença.

células tumorais metastáticas entram no tecido através de extravasamento. O tecido, porém, passa por processos pouco claras, através da qual as células são embebidos na matriz de tecido e entram em contacto directo com as células do estroma, a maioria dos quais são fibroblastos normais. As células tumorais têm todas as chances de entrar em contacto com as células estromais, incluindo células neoplásicas e metastáticos [1]. Isto leva a conversa cruzada recíproca com fibroblastos normais no tecido.

fibroblastos são as células do estroma mais abundantes, e eles estimulam o microambiente e servir como uma fonte rica para a via parácrina durante a tumorigénese e progressão. Os efeitos de fibroblastos normais em células tumorais são contestados. Tem sido relatado que os fibroblastos normais suprimir a conversão maligna do epitélio da próstata imortalizadas [2], enquanto que nos tumores da mama, os fibroblastos transformar em carcinoma ductal invasivo, carcinoma de [3].

Este desacordo indica que a influência de fibroblastos em células tumorais é diferente do que para fibroblastos FAC (cancro) associados. Para este estudo, foram co-cultivadas células de tumor com fibroblastos normais em placas de Petri, a fim de imitar a forma como as células tumorais em contato com fibroblastos. Estamos focados na contribuição de fibroblastos normais para câncer gástrico. Foi realizada cultura de fibroblastos normais para formar monocamadas densas, as quais foram, em seguida, disseminadas com células tumorais, a fim de imitar células tumorais metastáticas. Colocámos a hipótese de que a alta proporção dos fibroblastos para células tumorais pode imitar os tecidos, onde as células tumorais metastizadas residem. Assim, fibroblastos dérmicos a partir de indivíduos saudáveis, foram utilizados para produzir o ambiente celular. A linha de células de câncer gástrico, BGC-823, foi usado aqui porque é morfologicamente distinta de fibroblastos.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

tecidos dérmicos humanos primários foram obtidos das crianças que se submeteram a circuncisão após a obtenção do consentimento informado por escrito de seus cuidadores, que foi incluído em seus registros médicos. Este experimento foi analisado e aprovado pelo conselho de revisão institucional do Second Hospital Filiado de Zhejiang University School of Medicine (código de ética: Research 2013-047). Os pacientes incluídos no estudo foram fornecidos com uma cópia do termo de consentimento informado e deu permissão para publicar.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho de Ciência e Tecnologia da China. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Zhejiang.

Reagentes e anticorpos

Penicilina G /estreptomicina, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), Triton X-100, bovina albumina do soro, colagenase de tipo I, e tripsina foram adquiridos a Jinuo (China). DMEM-elevado teor de glucose foi obtido a partir de Gibco (China), e soro fetal de bovino (FBS) foi adquirido a partir de Gibco (SA). A cisplatina, 5-fluorouracilo, puromicina, e colagénio do tipo I foram adquiridos a partir de Sigma (EUA). A cisplatina foi dissolvido em dimetilformamida (DMF), 5-fluorouracilo em DMSO, e puromicina em PBS, a fim de fazer soluções de reserva que foram então armazenadas a -20 ° C. colagénio do tipo I (5 mg /mL) foi diluído para 1 mg /mL. DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole-HCl) em PBS foi obtido a partir de Roche, e de cabra anti-ratinho e IgG de coelho, anticorpo secundário-TIRTC, e os anticorpos secundários foram obtidos a partir de Bio-ZSGB (China). de coelho anti-humano-E-caderina (ab40772), de coelho anti-humano-vimentina (ab92547), e anticorpos de coelho anti-humano-β-catenina (ab9274) foram obtidos a partir de Abcam (Reino Unido). anticorpo de rato anti-humano-pan-CK (C11) e anticorpo de coelho N-caderina (C4061) foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (China), e anti-humano-β-actina e anticorpos anti-coelho secundário de cabra foram obtidos de Boster (China) . Os anticorpos foram diluídos com 5% de FBS a concentrações de trabalho salvo indicação em contrário.

Cultura de Células

A linha de células estabelecida, câncer gástrico humano BGC-823 células utilizadas em nosso experimento foram adquiridos a partir do banco de células de Guangzhou Instituto de Biomedicina e Saúde. As células foram descongeladas e passadas para 4-5 vezes e, em seguida, foram usadas nas experiências de co-cultura. fibroblastos dérmicos primários foram obtidos a partir dos espécimes cirúrgicos de crianças que haviam sido submetidos a circuncisão e fornecidos consentimento informado. Os fibroblastos foram utilizadas após a terceira passagem (dentro de 50 passagens), cultivadas em DMEM-elevado teor de glucose contendo FBS a 10%, e mantido numa incubadora humidificada (5% de CO

2) a 37 ° C. O meio celular foi substituído em dias alternados.

Para a geração dos TBGCs, os fibroblastos (FBS) e células BGC-823 foram co-cultivadas numa proporção de 10:01 durante mais 10 dias após as células cultivadas atingiram a confluência. formação da abóbada foi observado no sistema de co-cultura. A mistura de células foi então passadas por tripsinização com fibroblastos fresca (1 × 10

6 células /ml). Durante o segundo e subsequentes passagens, formação desgraça aparente e as células de forma arredondada suspensas pareciam que apresentaram diversas características morfológicas e fixação prolongada após a passagem. Após a quinta passagem das células suspensas mistos e fibroblastos normais densa, uniforme, células curtas, fusiformes denominado “TBGCs” foram produzidos e não demonstrou reversão morfológica para as células BGC-823 até . 10-15 passagens

Ensaio de Proliferação

exponencialmente as células em crescimento foram semeadas em placas de 96 poços, durante um adicional de 6 dias de incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. A proliferação celular foi medida em quintuplicado todos os dias, pipetando 20 mL CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, EUA) a cada poço que continha DMEM 100 uL alta concentração de glicose, em seguida, as células foram incubadas durante mais 2 horas antes de determinar a absorvância relativa a 490 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação.

droga Ensaio de Inibição

cinco duplicações de células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se durante 24 horas. Após 24 horas, o meio foi substituído com diferentes concentrações de droga (0-80 uM) e cultivadas durante 24 horas adicionais. toxicidade do fármaco foi avaliada através da medição do número de células viáveis ​​usando o ensaio de proliferação descritos acima.

risca o Ensaio

As células foram semeadas em placas de 24 poços (5 x 10

4 células /poço) e cultivadas para confluência. As pontas das pipetas foram usadas para gerar arranhões. PBS foi usado para remover os detritos celulares, então substituído com meio com FBS a-livre. As imagens foram obtidas durante 3 dias consecutivos. A largura do zero foi medida utilizando o ImageJ Software 1.47 para Windows (https://rsb.info.nih.gov/ij/) e representados graficamente como a distância zero por dia.

migração e invasão Ensaio

motilidade celular ensaio foi realizado utilizando inserções Transwell (tamanho de poro de 8 um) (Corning, EUA). As células-GFP (Green Fluorescent Protein) (1 × 10

5/500 mL) foram suspensas em meio de FBS-livre e colocadas por cima das pastilhas em triplicado, com meio de cultura de 800 mL carregado por baixo. Após incubação durante a noite, as inserções foram lavadas 3 × com PBS e limpo com um cotonete humedecida acima, onde fixada com PFA a 4% e a seguir observadas utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão). O mesmo procedimento foi utilizado para realizar o ensaio de invasão, mas inserções que foram pré-revestidas com Matrigel (BD, EUA) foram utilizados. Ambos os ensaios foram quantificados como o número de células contadas em 5 campos aleatórios (200 x de ampliação).

Ensaio de Apoptose As células

apoptóticas foram medidos utilizando o V-FITC kit de detecção de apoptose Anexina (Keygen, China) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram ou não tratados ou tratados com as drogas durante 24 horas, e, em seguida, recolhidas, lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em tampão contendo 5 uL de FITC-anexina V e 5 uL de ligação de PE, e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. A análise foi efectuada utilizando citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, EUA).

quantitativa PCR em tempo real

Os extractos nucleares foram preparados utilizando o RNeasy mini-kit de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de RNA purificado (1 ug) em água com DEPC foram sujeitos a transcrição reversa utilizando o estojo PrimeScript II primeira cadeia de cDNA Synthesis (Takara, China). RT-PCR e amplificação foram realizadas utilizando o kit de SYBR Premix Ex Taq II (Takara)

Um sistema de reacção de 20 ul contendo 1 ul das amostras diluídas de cDNA, 10 ul de pré-mistura SYBR Ex Taq II (2 ×), 0,4. uL ROX corante de referência (50 ×), 7 mL estéril bidestilada H

2O, e 1 uL para a frente e reverso iniciadores (ver Materiais e Métodos S1) foram preparadas e avaliadas usando análise de curva de fusão e o ciclo limiar comparativa (Ct) Método. Foram utilizadas as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 58 ° C durante 1 minuto. GAPDH foi usada como o gene de controlo.

Análise Western Blot

As proteínas foram extraídas a partir de células em crescimento exponencial e tecidos primários. Os extractos foram fervidas em tampão de carregamento, resolvidas em 10% de Tris-HCl géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, EUA) utilizando métodos padrão. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite livre de gordura em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas com TBST e incubados durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra a E-caderina (1:5000), vimentina (1:5000), β-catenina (1:5000), N-caderina (1:1000), e β-actina (1:1000). Após lavagem 3 x com TBST, adicionou-se secundário de cabra anti-coelho (1:1000) e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Finalmente, os complexos imunitários foram visualizados por quimioluminescência utilizando ECL (luminescência química Electro) (Millipore). A concentração de proteína foi normalizada para p-actina.

histológica e imuno-histoquímica As análises

As amostras foram rapidamente congeladas em azoto líquido, armazenado a -80 ° C, fixas em PFA a 4%, e seccionados para uma espessura de 10 um (Leica, Alemanha).

para a coloração de hematoxilina e eosina (HE), as lâminas desparafinizadas foram coradas com hematoxilina durante 15 minutos, lavadas 3 × com PBS, álcool de ácido durante 5 segundos, seguida eosina para 5 minutos (BOSTER, China).

para coloração imuno-histoquímica, os slides foram re-hidratadas e recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada em tampão citrato utilizando uma panela de pressão (20 minutos a 80 pKA), bloqueadas com 3 % H

2O

2 durante 15 minutos, e, em seguida, soro de cabra normal foi aplicado (30 minutos à temperatura ambiente). As lâminas foram incubadas em anticorpos primários os seguintes: anti-E- caderina (1:250), anti-vimentina (1:250), anti-β-catenina (1:250), e anti-pan-CK (1:250 ). As amostras foram incubadas durante a noite a 4 ° C, lavadas duas vezes com PBS, e incubadas com o anticorpo secundário durante 2 horas a 37 ° C. kit de DAB mais cromogénio (Boster) foi utilizada para detectar todos os antigénios. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado com lamelas usando balata neutro. Ambas as análises foram realizadas separadamente por patologistas e clínicos que estavam cegos para os grupos de amostras. Os litígios foram resolvidas por consenso.

imunofluorescência e Microscopia Confocal

As células foram plaqueadas em lâminas com câmara, e as secções congeladas foram fixadas com PFA a 4% e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100. As lâminas foram bloqueadas com soro normal de cabra durante 1 hora a 37 ° C, lavadas e incubadas durante a noite com anticorpos primários, a 4 ° C, em seguida, transferidos e incubadas com anticorpos de cabra anti-ratinho e anti-coelho-TIRTC durante 1 hora a 37 ° C no escuro. As lâminas foram lavadas com a glicerina e montado com lamelas. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. A fluorescência foi detectada utilizando um microscópio de laser confocal de varredura (Olympus). Os criosecções desparafinados foram coradas com DAPI e analisados ​​utilizando um microscópio de imunofluorescência.

Modelo Animal

Oitenta fêmeas de quatro semanas de idade camundongos BALB /c foram adquiridos a partir do Centro de Pesquisa Animal de Xangai e mantida no centro animal experimental da Academia Zhejiang de Ciências Médicas. De acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho de Ciência e Tecnologia da China, todos os animais foram mantidos em condições estéreis assépticas e administrado alimentos autoclavada e água em conformidade com os princípios do Laboratório Animal Care, da Universidade de Zhejiang. Quarenta e quatro murganhos foram utilizados no modelo subcutâneo, e foram divididos igualmente em grupos de controlo e de experiência. Os BGC-GFP foram utilizados como controle onde os TBGC-GFP foram usos como o experimento. As células tumorais foram colhidas durante a fase de crescimento, e suspensas em meio livre de FBS-(1 × 10

6 células /ml). As células foram pipetadas para suspensões de célula única, e cada solução de 500 mL foi inoculado por via subcutânea em ambos os lados do peito. Os ratos foram sacrificados a cada 2 semanas até 10 semanas, e os exames patológicos foram realizadas. Todos os ratinhos foram pesados ​​a cada 3 dias. Todas as cirurgias foram realizadas em 1% pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Trinta e seis ratos foram usados ​​no grupo de injecção na veia para a avaliação da distribuição do câncer (18 ratos no grupo de controle BGC-GFP e 18 ratos no grupo experimental TBGC-GFP). 500 uL suspensão de células (5 × 10

5 células) foi injectada na veia da cauda de ratinhos nus. Os ratos foram sacrificados às 2

nd, 5

th, 8

th e 10

th semanas para exame patológico.

Análise Estatística

Foram coletados dados experimentais e entrou em planilhas. testes de normalidade foram realizados antes de comparar os dados. As comparações entre os grupos foram realizadas usando

t

teste de Student. one-way análise de variância foi utilizada para comparar 3 grupos eo método de Tukey foi utilizado para

pós

hoc comparações de grupos. Neste estudo,

P

0,05 é considerado estatisticamente significativo. SPSS 20.0 para Windows (IBM SPSS Statistics, https://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) foi usado para realizar todas as análises estatísticas. R (ggplot2) (https://www.r-project.org/; https://www.r-project.org/) foi utilizado para gerar todas as apresentações gráficas

Resultados

1. Alterações morfológicas em BGC-823 Células As células estromais Mimick

fibroblastos (FBS) e células BGC-823 foram co-cultivadas numa proporção de 10:01 durante mais 10 dias após as células atingiram a confluência em cultura. A mistura de células foi então passadas por tripsinização com fibroblastos fresca (1 × 10

6 células /ml) (Figura 1.1). formação da abóbada nas células BGC-823 foi observado após a primeira passagem. Durante o segundo e subsequentes passagens, as células suspensas de forma arredondada apareceu no sistema de cultura: alguns agregados em agregados ou aglomerados e foram fracamente ligado à superfície dos fibroblastos. As células paralelas-cultivadas BGC-823 demonstrou apenas algumas células de forma arredondada na base quando a cultura tornou-se superlotadas. As células misturadas suspensa exibiu diversas características morfológicas e prolongada anexo após a passagem. Estas células demonstrada quer uma aparência de paralelepípedos-like semelhantes às células BGC-823 ou recursos curtas fusiformes. Uniforme, células curtas, fusiformes foram produzidos pela passagem das células suspensas mistos e fibroblastos normais densas. Em contraste, a passagem do sobrenadante das células BGC-823 só demonstrou detritos após 24 horas de cultura, em que as pequenas quantidades de células sobreviveram para formar clones de paralelepípedo semelhante semelhantes a células BGC-823 parentais (Figura 1.3A-H).

Figura 1.1. Esquemática do protocolo experimental. Figura 1.2. Origem das células do sobrenadante. (A) As células BGC-823 marcado com GFP (verde). (B) Células BGC-823, que foram co-cultivadas com fibroblastos (vermelho). (C) BGC-823 células cresceram em aglomerados e formas redondas demonstradas em suspensão. (D) TBGCs foram induzidas por coculturing. Ampliação 100 ×. Figura 1.3. Transformação de células BGC-823 para TBGCs sob um microscópio de contraste de fase. (A-D) Células BGC-823 em um sistema de cultura densa podem formar aglomerados e lançar fora células na suspensão. (E-H) a passagem de células tumorais em suspensão. Figura 1.4. coloração de imunofluorescência de pan-CK (vermelho), a E-caderina (vermelho), vimentina (vermelho) e N-caderina (vermelho). Células BGC-823 (acima) e TBGCs (abaixo) foram marcadas com GFP (verde). O núcleo foi corado com DAPI (azul). Figura 1.5. Calor trama de perfis de expressão de genes analisados ​​utilizando fluorescência quantitativa de RT-PCR. A profundidade da cor indica a expressão do gene relativo. Figura 1.6. Western blot de proteínas. Figura 1.7. gráfico de barra da expressão da proteína determinada utilizando análise de Western blot. Barras denotam os níveis de expressão relativos medidos usando IOD. As linhas verticais indicam diferenças padrão. ** P . 0,01

experimentos subsequentes foram realizados para determinar a origem das células em suspensão no sistema de co-cultivadas. BGC-823 células de fibroblastos e foram transfectadas com cassete GFP-puro e cassete RFP-puro, respectivamente, e com o nome BGC-GFP e FB-RFP, respectivamente. Após coculturing, BGC-GFP cresceu em multicamadas e formou uma estrutura de cúpula. Enquanto isso, as células de forma redonda ou esferóides, que foram suspensas nos meios foram transferidos para placas de cultura e marcadas com fluorescência verde, demonstrando que coculturing longo prazo com fibroblastos induz a transformação BGC. células redondas e esferóides que foram suspensas no meio também foram observadas usando fluorescência verde e podia ser passado sem a adição de fibroblastos (Figura 1.2A-D). Após várias rodadas sucessivas de coculturing, as células BGC-823 transformadas (TBGCs) foram obtidos que apareceu mais uniforme, curto, e fusiforme. Estas células foram então passadas sem a adição de fibroblastos. Curiosamente, essas células eram mais propensas a formar estruturas esferóides que as células que cresceram até à confluência e não demonstram reversão morfológica para BGC-823 células até . 10-15 passagens

Um estudo anterior relatou que os fibroblastos inibir o crescimento de outras células quando co-cultivadas

in vitro

pelo mecanismo de inibição de contato [4]. Nas nossas experiências, no entanto, os fibroblastos normais não contacte-inibir a proliferação de células BGC-823. Em vez disso, FB-RFPs gradualmente pereceram com a proliferação BGC-GFP quando a cultura foi alargado para 10 dias. Portanto, a suplementação FB consecutivo foi obrigado a passagem e manter a produção estável de TBGCs. Observou-se também que, quando uma pequena quantidade de TBGCs foi adicionada à folha de fibroblastos confluentes, as células tumorais que cresceram foram fora afastada pelos fibroblastos. No centro da colónia tumor, as células foram round-moldada, com anexos apenas soltas à base (Figura 1.3A-H).

2. Transição epitelial-mesenquimal de BGC-823 celular para TBGC

-PCR em tempo real foi usada para analisar a expressão de ARNm. Os resultados mostram que a expressão de E-caderina foi notavelmente downregulated juntamente com a regulação positiva de vimentina no TBGCs. Enquanto isso, as expressões de torção, caracol, lesma, e N-caderina foram todos regulada (Figura 1.5). imunofluorescência e blot confirmação da perda de E-caderina Ocidental e o aumento da expressão de vimentina, N-caderina e β-catenina (Figura 1.4), confirmando assim que a longo prazo a transição epitelial-mesenquimal (EMT) ocorre em TBGCs. E-caderina é uma característica comprovada de EMT e mantém ligação célula-célula no epitélio. perda de E-caderina pode conduzir ao derramamento do tumor mais células fora a partir da massa do tumor.

3. Proliferação, invasão e Mobilidade dos TBGCs

proliferação TBGC foi analisada utilizando o ensaio MTS. TBGCs demonstrou uma taxa de proliferação acelerada (

P

0,01) (Figura 2.1). A citometria de fluxo (ver Materiais e Métodos S1) mostra que 13% de TBGCs foram retidos na fase S, em contraste com apenas 7% de BGC-823 células (Figura S1.3). O ensaio indica que coçar TBGC motilidade aumentada em comparação com as células paternas BGC-823 (Figura 2.2-2.3A-H). TBGC anastomose necessários 3 dias após o início dos arranhões, enquanto que eram necessários 4 dias para as células BGC-823 (

p Art 0,05). (Figura 2.2)

Figura 2.1. linha de trama no ensaio de proliferação. As linhas verticais indicam diferenças padrão. ** P 0,01. Figura 2.2. gráfico de linha do ensaio coçar. As linhas verticais indicam diferenças padrão. ** P 0,01. Figura 2.3. Coçar ensaio de células BGC-823 (acima) e TBGCs (abaixo) sob um microscópio de contraste de fase. (A-D, E-H) Tempo de inicial para 72 horas. Figura 2.4. gráfico de caixa dos ensaios invasivos e migração. As diferenças entre as células BGC-823 e TGBCs são significativos (p 0,01). Figura 2.5. Os melhores fotos 2 mostram os resultados do ensaio Transwell com Matrigel modificado invasiva. Imagens representativas dos ensaios de invasão para Transwell (A) BGC e (B) TBGC. As células que invadem o lado de baixo do inserto Transwell são mostrados. Os últimos 2 fotos são imagens representativas dos ensaios de migração transpoço para (C) BGC e (D) TBGC. As células que migram para a parte inferior do inserto Transwell são mostrados.

Os resultados dos ensaios de invasão de Matrigel TBGCs mostram que são mais agressivos do que as células BGC-823. No total, 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltraram no Matrigel em comparação com 188.33 ± 58,62 células BGC-823 no grupo de controle (

p Art 0,01) (Figura 2.4, Figura 2.5A, B). No entanto, TBGCs demonstrou uma redução significativa em células que migraram: 2-vezes menos do que as células BGC-823 de acordo com o ensaio de migração Transwell (

P

0,01) (Figura 2.4, Figura 2.5C, D). A natureza suspensa das TBGCs pode explicar esta redução, a taxa de adesão foi de apenas 68,33 ± 10,41% no TBGCs sobre Matrigel, enquanto 99,77% ± 6,25% em BGC-823 células, demonstrou apego lento para a superfície de Matrigel em TBGCs (Tabela S1) .

para melhor imitador

in vivo

comportamento do tumor, gel de colágeno tipo I foi usada para determinar a relação entre fibroblastos e as capacidades invasivos de células BGC-823 e TBGCs. gel de colágeno tipo I foi preparado nas inserções Transwell com fibroblastos (ver Materiais e Métodos S1). géis carregados de fibroblastos foram cultivados durante 7 dias, e, em seguida, as células cancerosas marcado com GFP foram semeadas sobre o gel e cultivadas durante os 7 dias seguintes. A inspecção dos geles colhidas revelou que as células de tumor tinha penetrado nos géis de colagénio. Quando os geles foram carregados com fibroblastos, TBGCs exibiram capacidade invasiva mais reforçada do que as células BGC-823, como indicado pelo número de células que se infiltrou nos géis (Figura S1.2).

4. TBGCs exibiram resistência Cisplatina

Em seguida, avaliou-se a sensibilidade do TBGCs para quimioterápicos câncer gástrico padrão. As células viáveis ​​e TBGCs BGC-823 foram determinados após 24 horas de exposição a cisplatina (0, 20, 40, 60, 80 uM), medindo a incorporação de MTS. Os resultados demonstram que TBGCs exibiu notável resistência à cisplatina, ao passo que algumas células BGC-823 sobreviveram quando a concentração de cisplatina foi elevada para 40 uM (

P

0,001) (Figura 3.1). TBGCs viáveis ​​poderia até ser detectado quando a concentração de cisplatina foi elevada até 200 uM (dados não apresentados). Foi realizada análise de células-apoptose por citometria de fluxo para validar a resistência a cisplatina. Os resultados mostram que a taxa de sobrevivência de TBGCs foi de cerca de 42,40% em comparação com 13,80% de células BGC-823, após o tratamento com 40 uM de cisplatina durante 24 horas (Figura 3,3-3,4). No entanto, quando tratados com 5-FU, não houve diferenças significativas na inibição de tumor entre TBGCs e células BGC-823 de acordo com o ensaio MTS (Figura 3.2). Tanto as células tumorais demonstrada quimiorresistência de 5-FU (figura 3.2).

Figura 3.1. gráfico de linha de vinte e quatro horas do teste de cisplatina-inibição. ** P 0,01. Figura 3.2. gráfico de linha de vinte e quatro horas do teste de inibição de 5-FU. Figura 3.3. A citometria de fluxo foi usada para avaliar a apoptose em células BGC e TBGC após a exposição a diferentes concentrações de cisplatina (20, 40 uM) durante 24 horas. As células foram coradas com anexina V-FITC (marcador de apoptose) e iodeto de propídio (PI) (marcador de células mortas). Figura 3.4. gráfico de barra de apoptose induzida pela cisplatina em células BGC-823 e TBGCs. Gráfico de barras mostrando a percentagem de células apoptóticas, de acordo com citometria de fluxo. ** P . 0,01 vs células nos poços de controlo dimetilsulfóxido (DMSO)

5. TBGCs Exhibit

In vivo

Linfonodo Propensão

Para determinar o

in vivo

distribuição de TBGCs, 5 × 10

5 BGC-823 células ou TBGCs foram injetados na veia da cauda de ratinhos BALB /c. Duas semanas após a injecção, a variância em auxiliar e nódulos linfáticos cervical metástase foi observada em ambos os grupos, como indicado por avaliação de um marcador fluorescente (Figura 4.3A-F). Células positivas para GFP foram encontrados no nódulo linfático auxiliar e inguinal em ambos os grupos (Figura 4.3A, B, D, E). No entanto, as células positivas para GFP só apareceu nos pulmões dos ratos do grupo de BCG (Figura 4.3C, F).

Figura 4.1. risco cumulativo de metástases em linfonodos em diferentes grupos que receberam injeções na veia da cauda. Figura 4.2. Coloração HE (em 10 semanas) dos órgãos no grupo que recebeu injecções na veia. A positividade foi observada nos intestinos de ambos os grupos e nos pulmões dos grupos BGC. Não há metástases hepáticas ou renais evidentes foram encontrados. Figura 4.3. rastreio fluorescente de células de tumor na semana 2 nos grupos que receberam injecções na veia da cauda. As células tumorais foram marcadas com fluorescência verde, como indicado pelas pontas de seta amarelo. O núcleo foi corado com DAPI (azul). Ampliação 100 ×. Figura 4.4. coloração imuno-histoquímica para a E-caderina e β-catenina nos nodos linfáticos dos grupos que receberam injecções na veia da cauda em cada ponto de tempo. Ampliação 200 ×. Figura 4.5. trama de barras dos níveis de expressão relativa de E-caderina e β-catenina nos nodos linfáticos dos grupos que receberam injecções na veia da cauda em cada ponto de tempo. ** P 0,01; * P . 0,05

Na semana 5, além de vasta invasão para os gânglios linfáticos, foi também observada a infiltração de órgãos. Mais linfonodo invasão foi observada no grupo TBGC do que o grupo de controlo BGC em cada ponto de tempo (Figura 4.1, de vídeo S1). Estes gânglios linfáticos foram determinados como sendo pan-CK positivo (Figura S2.1). Observou-se também diferente TBGC e distribuição BGC nos órgãos. TBGCs foram limitados aos tecidos gastrointestinais, ao passo que BGCs resolvido para os pulmões e intestinos (Figura 4.2A-H). Na semana 5, a metástase intestinal foi observada pela primeira vez em 3/4 ratinhos que foram injectados com TBGCs, ao passo que apenas 25% murganhos demonstraram metástases visíveis intestinal a seguir à injecção BGC (Figura S2.3).

Como os tumores desenvolvidos, o número médio de metástases TBGC intestinais aumentou (5,6 ± 3,911

vs

3,5 ± 1.914 BGCs na semana 8; 6,33 ± 1,52

vs

5,6 ± 1.342 na semana 10) (Figura S4.2) . Curiosamente, 3 de 5 ratos no grupo TBGC demonstrado neoplasias megascópicos na Gastrum depois de 10 semanas, o que não foi observado no grupo de BCG. metástases pulmonares megascopic foram encontrados em três de quatro ratinhos BGC na semana 8. No entanto, não há metástases pulmonares visíveis TBGC foram observadas na semana 10 (Figura 4.2A-H). inspeção microscópica revelou a infiltração de TBGCs no linfáticos cervicais e axilares tão cedo quanto uma semana após a injecção na veia da cauda, ​​enquanto BGCs necessários mais tempo (3 semanas) para introduzir esses linfonodos (Figura 4.1). Cinco semanas após a injecção das células, infiltração pulmonar foi observada no grupo de BCG. No entanto, não há TBGCs foram detectados em órgãos até 10 semanas após a injeção (Figura 4.2b, F, Figura S2.3).

coloração imuno-histoquímica indicou o aumento gradual da E-caderina nos gânglios linfáticos do grupo TBGC , enquanto que a expressão de e-caderina diminuiu ligeiramente no grupo BGC (

P

0,01) (Figura 4.4A-P). As diferenças foram significativas em 8 e 10 semanas, quando a expressão de E-caderina foi muito maior no grupo TBGC em comparação com o grupo BGC (Figura 4.5).