Abstract

Fundo

O esgotamento dos fatores de replicação muitas vezes provoca a morte celular em células cancerosas. Esgotamento de Cdc7, uma quinase essencial para a iniciação da replicação de DNA, induz a morte da célula cancerosa independentemente do seu estatuto p53, mas os caminhos precisos de indução de morte celular não foram caracterizadas.

Metodologia /Principais Achados

Nós temos utilizado o indicador de ciclo celular recentemente desenvolvido, Fucci, caracterizar com precisão o processo de morte celular induzida pela depleção Cdc7. Nós também têm gerado e indicadores fluorescentes semelhantes utilizados ciclo celular usando a fusão com outros reguladores do ciclo celular para analisar modos de morte celular em células vivas em ambos os fundos p53 positivos e negativos. Mostramos que as respostas do ciclo celular são distintos induzida em células p53 positivos e negativos por depleção Cdc7. células p53-negativos predominantemente prender temporariamente no G2-fase, acumulando CyclinB1 e outros reguladores mitóticas. paragem prolongada na fase G2-e entrada abrupta na M-fase aberrante na presença de CyclinB1 acumulado são seguidos por morte celular no estado pós-mitótico. Revogação de acumulação CyclinB1 citoplasmática diminui parcialmente a morte celular. A via ATR-MK2 é responsável pelo seqüestro de CyclinB1 com proteína 14-3-3σ. Em contraste, células de cancro de p53-positivos não se acumulam CyclinB1, mas parecem morrer principalmente através de entrada em fase S aberrante após a depleção Cdc7. A combinação da inibição Cdc7 com agentes anti-cancro conhecidos estimula significativamente os efeitos de morte celular em células cancerosas de uma maneira dependente do genótipo, fornecendo uma base estratégica para futuras terapias de combinação.

Conclusões

Os nossos resultados mostram que o uso de Fucci, e indicadores do ciclo celular fluorescentes semelhantes, oferece um sistema de ensaio conveniente, com o qual se identificar eventos do ciclo celular associada a morte de células de cancro. Eles também indicam modos de morte celular específicas de genótipo induzidas pela iniciação deficiente de replicação do DNA em células cancerosas e sua exploração potencial para o desenvolvimento de terapias contra o câncer eficientes

Citation:. Ito S, Ishii A, Kakusho N, Taniyama C, Yamazaki S, R Fukatsu et al. (2012) Mecanismo de Câncer morte celular induzida pela depleção de um regulador de replicação Essencial. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10.1371 /journal.pone.0036372

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Janeiro, 2012; Aceito: 30 de março de 2012; Publicado em: 04 de maio de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a pesquisa básica científica (a) e um Grant-in-Aid para a Investigação científica na área de prioridade “Ciclo Chromosome” do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (a HM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cdc7 é uma conservada serina-treonina quinase que desempenha um papel crítico no disparo das origens de replicação [1] – [3]. Um substrato chave é MCM, um componente do complexo prereplicative (pré-RC), e a fosforilação da MCM2, 4 e 6 subunidades do complexo de MCM por Cdc7 desencadeia a associação de Cdc45 com pré-RC, um passo crucial para a geração de uma forquilha de replicação ativa [4] – [6]. Cdc7 forma um complexo com Dbf4, uma sub-unidade de activação, para gerar um complexo de quinase activa [2]. Nos seres humanos, duas subunidades de ativação, ASK e Drf1 /ASKL1, são conhecidos como existentes [2], [7] – [9].

Knockout de Cdc7 em ratos provoca letalidade embrionária precoce. Inativação de genes Cdc7 em células-tronco embrionárias de rato também é letal [10]; células cessar a síntese de ADN, acumulam danos de ADN, e eventualmente sofrem morte celular de um modo dependente da p53. experimentos knockdown em células de mamíferos indicam que ASK é essencial enquanto Drf1 /ASKL1 pode ser dispensável para a viabilidade [9], [11]. Com efeito, a inactivação dos genes ASK em células ES de murganho também leva a letalidade [12]. Estes resultados indicam que Cdc7-ASK é essencial para a proliferação de células de mamíferos. Por outro lado, Drf1 /ASKL1 pode desempenhar um papel predominante como um activador de Cdc7 no desenvolvimento inicial de anfíbios [13], [14]. Um ortólogo de Drf1 /ASKL1 não foi identificada em ratos.

A um nível celular, foi mostrado knockdown de Cdc7 para causar a morte celular em células cancerosas, mas não em células normais, em que as vias dependentes de p53 prisão o ciclo celular na fase G1, presumivelmente, [15], [16]. Também foi relatado que a morte induzida Cdc7 knockdown celular dependente de p38 em células HeLa [17]. No entanto, a depleção Cdc7 provoca a morte celular também em células p53-positivos, o que sugere que a p53 sozinha não pode evitar a morte celular induzida por depleção de Cdc7 em células cancerosas. Actualmente, os mecanismos precisos de morte celular independente de p53 em células cancerosas Cdc7-empobrecido não são conhecidos. No presente estudo, analisamos o efeito de depleção de Cdc7 em células de cancro usando o indicador do ciclo celular recentemente desenvolvido Fucci [18], bem como indicadores do ciclo celular fluorescentes semelhantes. O nosso ponto de resultados para efeitos diferenciais de p53 sobre o modo de morte celular em células cancerosas Cdc7-empobrecido.

Resultados

O esgotamento dos Cdc7 quinase em células cancerosas humanas provoca a morte celular

Depleção de Cdc7 em HeLa, U2OS ou outras células cancerosas com siRNA resultou na inibição da síntese de ADN, a acumulação de danos do cromossoma [representados por focos γ-H2AX) e eventual perda de viabilidade viabilidade [15], [19], [20] . A morte celular foi induzida em ambas as células cancerosas p53-p53-positiva ou negativa, consistente com relatos anteriores [15], [19]. FACS análises de teor de ADN indicaram que a depleção de Cdc7 conduz inicialmente a uma diminuição da população G1, seguido de aumento da população sub-G1, indicativas de morte celular (Fig. S1A e a Fig. S2B).

De modo a investigar o modo de morte celular induzida pela depleção Cdc7, usamos células HeLa que expressam o indicador do ciclo celular, Fucci (indicador baseado em ubiquitina fluorescente ciclo celular; [18]), que permite a visualização do estado do ciclo celular (vermelho para G1 e verde para S /G2 /M). HeLa-Fucci foi transfectada com Cdc7 siRNA e as células foram monitorizadas para determinar a fase do ciclo celular em que eles sofrem morte celular. A morte celular ocorre em ambos G1 pós-mitótico e durante S /G2 /M em fase de HeLa-Fucci (Fig. 1A e C, filmes S1 e S2). Nós também gerado U2OS-Fucci e examinou o modo de morte celular em U2OS após a depleção Cdc7. Em U2OS, mais de 70% das células morreram durante S /G2 /M, fase (verde; A Fig. 1B e C). Em contraste, a depleção de Cdc7 não induziu a morte celular em NHDF (fibroblasto dérmico humano normal) e células levou principalmente para a paragem em G1 como descrito anteriormente (Fig. S1 e dados não mostrados; [15]).

(A células e B) HeLa (A) ou U2OS (B) que expressam Fucci foram tratados com o controle ou Cdc7-D siRNA, ea imagem lapso de tempo foi gravado com Olympus LCV100 (filmes S1 e S2). As imagens captadas a partir dos dados do lapso de tempo para os tempos indicados são apresentados. Os painéis superior (ARNsi de controlo) indicam células que sofrem divisão celular normal. Os números em cada vez que o painel show (horas) após siRNA transfecção. Inferiores dois painéis (a e b) as células tratadas mostram Cdc7 siRNA. Algumas células morreram na cor vermelha (fase G1, um), e outras células morreram em verde (S /G2 /M de fase, b). Comprimentos de fases do ciclo celular estão indicados nos painéis (G1, com setas linhas tracejadas; S /G2 /M, com setas de linhas a cheio). Bar, 20 uM. (C) As células mortas em tratados siRNA Cdc7 HeLa-Fucci (esquerda, 324 células) ou U2OS-Fucci (direita, 180 células) foram contadas a partir dos dados de lapso de tempo para determinar as fracções das células mortas em vermelho e em verde. A morte celular ocorre em ambos G1 e S /G2 /M fases em células cancerosas tratadas Cdc7 siRNA. células (D, E e F) HeLa foram transfectadas com o controlo ou ARNsi Cdc7-D e foram colhidas às 48 horas (D) ou nos tempos indicados (E e F). Os extractos de células inteiras (D) ou CSK-solúveis extractos (E) foram analisados ​​por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. atividade (F) Cdc2-CyclinB1 quinase foi medida usando os extratos CSK-solúveis. Os imunoprecipitados (IP) utilizado para os ensaios e os extractos de entrada foram analisadas por western blotting. A extensão da depleção Cdc7 foi semelhante entre HeLa e U2OS. Cdc7 não foi detectável por Western após tratamento com ARNsi em ambas as células. células (L) HeLa foram tratadas com controlo ou ARNsi Cdc7-D para os tempos indicados, recolhido, lavado com PBS, inchado em KCl a 75 mM durante 20 min a 37 ° C, e fixadas com ácido acético glacial /metanol (01:03) solução três vezes. cromossomos fixos foram lançadas sobre uma lâmina de vidro, secas ao ar e coradas com solução a 5% de Giemsa em 1/15 M PBS. cromossomos propagação foram observadas em All-in-One microscopia (Keyence). As células mitóticas com cromossomas condensados ​​aberrante foram contadas e as fracções são apresentados. As inserções mostram imagens representativas de cromossomas condensados ​​aberrante observada num Cdc7 siARN tratada de células HeLa (esquerda) e cromossomas condensados ​​adequadamente observados em uma célula de controlo (direita). Bar, a 50 uM. células (H) HeLa foram tratadas com controlo ou ARNsi Cdc7-D durante 48 horas, lavadas com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 10 min à temperatura ambiente e em seguida corados com Hoechst 33342. As células foram examinadas sob microscopia confocal LSM510 (1427 células [Cdc7] e 1023 células [controle]), e as células em fases fase M foram marcados. As fracções de células em cada fase mitótica são apresentados. (I) se espalhar e cromossomos fixos preparadas de U2OS como descrito acima foram observados por microscopia FSX100 Olympus. Não foi observada diferença significativa em células mitóticas após o esgotamento Cdc7. No entanto, os números de células apoptóticas aumentada em células U2OS Cdc7-empobrecido. Bar, 32 uM. Em C, G e H, “n” representa o número de experiências independentes realizadas.

acumulação citoplasmática de proteína CyclinB1 em Cdc7-empobrecido células HeLa

A análise FACS de Cdc7- células HeLa empobrecido não mostrou acumulação de população G2 /M (Fig. S1A e a Fig. S2B). No entanto, análises de Western de várias proteínas após a depleção Cdc7 em células HeLa indicaram que os níveis de CyclinB1, proteínas e AuroraA PLK1 aumentou (Fig. 1D, E e F). Os níveis de ambos Cdc25C, Cdc25CS216 (Fig. 1E) e a tirosina 15 fosforilação de Cdc2 também aumentou (Fig. 1F), sugerindo que G2M ponto de verificação /pode ser induzida em células HeLa Cdc7-empobrecido. Embora o nível de proteína CyclinB1 aumentada, a actividade de quinase dependente de Cdc2-CyclinB1 foi quase a mesma que a do controlo (Fig. 1F). Isto pode ser devido à associação com proteínas 14-3-3, o qual pode inibir a actividade da cinase (ver abaixo), bem como para o 15 fosforilação induzida por checkpoint inibidora de tirosina. Por outro lado, em U2OS p53-positiva, a depleção de Cdc7 não causar acumulação CyclinB1, e não afectou a actividade de cinase Cdc2 CyclinB1-dependente ou tirosina 15 fosforilação de Cdc2 (Fig. 1F).

A coloração e observação de cromossomas fase M indicaram um aumento de cromossomas condensados ​​de forma aberrante em células tratadas com siRNA Cdc7 (Fig. 1G). Cerca de 50% das células mitóticas exibiram os cromossomas condensados ​​de forma aberrante em células HeLa Cdc7-empobrecido. Além disso, a metafase telophase populações de células diminuiu em células HeLa tratadas com siRNA Cdc7 (Fig. 1H). Estes resultados indicam que uma grande população de células de prender ou abrandar em G2 após a depleção de Cdc7-quinase em células HeLa com cromossomas condensados ​​de forma aberrante, e uma porção das células morrem durante a fase G2 /M, possivelmente por metafase. No entanto, não foi determinado momento preciso da morte celular durante a fase M. Em U2OS, não há diferença significativa para M cromossomas de fase entre as células de controlo Cdc7-empobrecido e. No entanto, os números de núcleos apoptóticos aumentou após a depleção de Cdc7 em U2OS (Fig. 1I). Assim, estes resultados também mostram que o momento da morte celular induzida por depleção de Cdc7 pode ser diferente em células HeLa e U2OS.

Em seguida, analisamos a localização celular da proteína CyclinB1 por imunocoloração. Notamos o aumento das células CyclinB1-positiva em células tratadas com siRNA Cdc7, como seria de esperar de um aumento do nível global de proteína CyclinB1. Observamos, também, que uma população substancial das células HeLa Cdc7-empobrecido contêm proteína CyclinB1 no citoplasma (Fig. 2A e B). Para confirmar este resultado, examinámos o efeito de depleção de Cdc7 utilizando células HeLa que expressam de forma estável a proteína CyclinB1 mKO2-fundido. Nesta linha celular, os sinais de fluorescência vermelha apareceu primeiro no citoplasma em cerca de 10-14 horas após a divisão celular. Os sinais foram detectáveis ​​durante cerca de 5-6 horas. Uma vez que as experiências de sincronização sugerem que G2 /M fases em células HeLa durar cerca de 3-5 horas, CyclinB1 é susceptível de ser expresso a partir de fase tardia S através da metafase. Estes sinais de translocar em núcleos e desaparecem depois da metafase (figura 2C, painel superior; S3 filme.), Consistente com o comportamento esperado da proteína endógena CyclinB1, como mostrado anteriormente [21] – [23]. Quando as células foram tratadas com siRNA Cdc7, a população de células com os sinais vermelho citoplasmáticos fortes aumentada, e estes sinais hospedado no citoplasma por um período mais longo (Fig. 2C, painel inferior e filme S4). O tempo necessário para a translocação dos sinais vermelhos para os núcleos após o seu aparecimento no citoplasma foi algumas horas nas células de controlo, ao passo que o aumento em Cdc7-empobrecido células (Fig. 2C e D, filmes S3 e S4). Isto também foi observado com diferentes ARNsi Cdc7 (Fig. S2 e dados não mostrados). Estes resultados são consistentes com a ideia de que CyclinB1 acumula-se no citoplasma de células HeLa tratadas com siRNA Cdc7. Nós também gerado células HeLa que expressam mKO2-AuroraA. Expressão e actividade de AuroraA, uma das cinases mitóticas, é conhecida a pico na fase G2 /M [24]. Consistentemente, os sinais AuroraA apareceu na fase G2, e desapareceu no fim da fase M nas células de controlo, ao passo que a duração dos sinais AuroraA tornou-se muito mais tempo após a depleção Cdc7 (Fig. S3, S5 e S6 filmes). Este efeito foi novamente obtido com outras Cdc7 siRNAs (Fig. S3C e dados não mostrados). Estes resultados indicam que a depleção de Cdc7 faz com que o atraso do ciclo celular G2 em células HeLa concomitantes com o aumento da CyclinB1 e os níveis de proteína AuroraA.

células HeLa (A) foram cultivadas sobre vidros de cobertura, transfectadas com o controlo ou Cdc7-D para ARNsi 48 horas, fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas por anticorpo anti-CyclinB1 seguido de rato anti-IgG conjugado com FITC e Hoechst33342. Esquerda, siRNA Cdc7; direita, controlar siRNA. Verde, CyclinB1; azul, ADN. Fotos foram tiradas por microscopia FSX100 Olympus. Bar, 16 uM. (B) mais de 3.000 células foram examinadas e células com sinais CyclinB1 nucleares foram marcados e as fracções são apresentados. “N” representa o número de experiências independentes realizadas. células (C) HeLa que expressam mKO2-CyclinB1 foram tratados com Cdc7-D ou ARNsi de controlo. imagens de lapso de tempo foram registados pela Olympus LCV100 (filmes S3 e S4). As imagens captadas a partir dos dados do lapso de tempo para os tempos indicados são apresentados. Superior, controlar siRNA; inferior, Cdc7 siARN. sinais vermelhos mostram mKO2-CyclinB1. As células tratadas com ARNsi de controlo indicam aqueles submetidos a aparência periódica citoplasmática, transferência nuclear e degradação (painel superior), enquanto que as células tratadas com siRNA Cdc7 mostram fortes sinais cytoplamic persistentes por um longo período (painel inferior). Os números em cada vez que o painel show (horas) após o tratamento siRNA. Barra: 20 uM. (D) O tempo (hr) entre a primeira aparição do sinal mKO2-CyclinB1 citosólica e sua translocação para o núcleo foi medido nas imagens de lapso de tempo de controlo ou Cdc7-D siRNA trataram células HeLa. O P-valor do teste t não emparelhado de duas caudas foi calculado pelo software Prism.

Muitos Cdc7-empobrecido células com alta CyclinB1 citoplasmática de repente entram mitose após a prisão G2 longa, e muitas vezes se submetem a aparente morte celular nas horas seguintes. Isto é semelhante à catástrofe mitótica relatados anteriormente [25], mas as células são impedido de prosseguir para a fase M por inibição da translocação nuclear de CyclinB1, não na fase de ponto de controlo do fuso, como relatado anteriormente em um sistema diferente [26]. Com efeito, a revogação do checkpoint do fuso por siRNA alvo para Mad2 não afectou a retenção CyclinB1 no citoplasma que ocorre em resposta a depleção Cdc7 em células HeLa (dados não mostrados).

14-3-3σ sequestra em CyclinB1 citoplasma após Cdc7 esgotamento

a próxima pergunta é como CyclinB1 acumula no citoplasma. 14-3-3σ é conservada, factores bem caracterizados, conhecidos por se ligarem a vários reguladores do ciclo celular e retê-los no citoplasma em algumas circunstâncias [25]. Cada um dos sete isoformas 14-3-3 foi expressa, e a sua interacção com Cdc2-CyclinB1 foi examinada. 14-3-3σ estava entre os ligantes mais fortes (dados não mostrados). Nós examinamos se o CyclinB1 acumulada é obrigado a 14-3-3σ em células HeLa Cdc7-empobrecido e descobriu que CyclinB1-bound 14-3-3σ aumentou significativamente em células Cdc7-empobrecido (Fig. 3A, pista 2). Além disso, a imunoprecipitação de expresso transitoriamente 14-3-3σ Cdc7 após a depleção mostraram que CyclinB1 Cdc2 e estão associados com 14-3-3σ (Fig. 3B). No entanto, não conseguimos detectar a associação de 14-3-3σ e Cdc25C, conforme descrito anteriormente [25], [27]. Estes resultados sugerem que 14-3-3σ sequestra o complexo Cdc2-CyclinB1 no citoplasma após a depleção Cdc7 em células HeLa.

células HeLa (A) foram tratados com o controlo ou ARNsi Cdc7-D durante 24 horas. Os extractos foram preparados e imunoprecipitados com anticorpo anti-CyclinB1 (pistas 1 e 2) e os extractos de entrada (pistas 3 e 4; 20% do extracto utilizado para imunoprecipitação) foram analisadas por western blotting. células (B) HeLa foram tratadas com controlo ou ARNsi Cdc7-D, seguido por transfecção de um plasmídeo que expressa 14-3-3σ marcado com FLAG. Os extractos foram preparados a 48 horas após o siARN da transfecção e os imunoprecipitados com anticorpo anti-Flag (pistas 1 e 2) ou normal (controlo) IgG (pistas 3 e 4) e extractos de entrada (pistas 5 e 6; 17% do extracto usadas para imunoprecipitação) foram analisadas por western blotting. A ligação de Cdc2 /CyclinB1 com 14-3-3σ aumenta após tratamento Cdc7 siRNA, sugerindo que retém 14-3-3σ CyclinB1 no citoplasma após a depleção Cdc7 em células HeLa. células (C e D) HeLa foram tratadas com siRNA Cdc7-D, e 14-3-3σ Cdc7-D siRNAs, 14-3-3σ siRNA e ARNsi de controlo durante 48 horas. (C) Análise de transferência de Western de extractos celulares integrais os. conteúdo (D) de ADN das células em C foram analisadas por FACS (10.000 células por cada um) e a fracção de células em cada fase do ciclo celular é apresentada. células (E) HeLa que expressam mKO2-CyclinB1 foram tratados com Cdc7-D e /ou ARNsi 14-3-3σ como indicado. O tempo (hr) entre a primeira aparição de sinais mKO2-CyclinB1 citosólica e sua translocação para o núcleo foi medida usando as imagens de lapso de tempo, que começou às 24 horas após a transfecção siRNA. A P-valor do teste t não emparelhado de duas caudas foi calculada pelo software Prism. Co-depleção de 14-3-3σ levou a uma diminuição do nível de proteína total CyclinB1 (C), reduziu a morte celular (D), e reduziu a duração da sua retenção citoplasmático (E).

redução de acumulação citoplasmática de CyclinB1 reduz parcialmente morte celular

Uma vez que as células que se acumulam CyclinB1 no citoplasma são propensas a morte celular, examinamos se a redução de CyclinB1 citoplasmática antagoniza o efeito de morte celular do esgotamento Cdc7. Co-depleção de ambos Cdc7 14-3-3σ e em células HeLa reduzida a CyclinB1, AuroraA, Plk1 e os níveis de proteína Cdc25C (Fig. 3C). O tempo necessário para a translocação nuclear de CyclinB1 encurtado e a população de células sub-G1 diminuíram (Fig. 3D e E). Estes resultados sugerem que a ausência de 14-3-3σ facilita a transição G2-M e a progressão para a fase seguinte do ciclo celular, parcialmente resgatar as células de morte celular.

próxima expressa mKO2-NLS-CyclinB1, que constitutivamente localiza em núcleos em células HeLa na tarde da S através de metáfase. Nestas células, o tempo necessário para a transição de S tardia de G2 /M foi encurtado em comparação com mKO2-CyclinB1 expressando células e a morte celular foi parcialmente contornada às 48 horas após a depleção Cdc7 (Fig. 4A e B). Isto é consistente com um relatório anterior que a expressão ectópica de NLS-CyclinB1 em células HeLa reduzida a G2-atraso que ocorre em resposta à irradiação com raios-X [28]. No entanto, as células que expressam mKO2-NLS-CyclinB1 ainda sofreram apoptose em pontos de tempo mais tardios após a depleção Cdc7. Isto pode ser esperado uma vez que a expressão de CyclinB1 nuclear é conhecido por induzir a apoptose em células cancerosas [29]. Co-depleção de CyclinB1 reduzida G2-alongamento e parcialmente resgatados da morte celular induzida por depleção de Cdc7 (Fig. 4C, D). Estes resultados suportam a noção de que a acumulação citoplásmica de CyclinB1 e sua translocação abrupta em núcleos são pelo menos parcialmente responsáveis ​​pela morte celular observada em células HeLa induzidas pela depleção Cdc7 e que a morte celular pode ser pelo menos parcialmente prevenida por facilitar a mitose.

células (A) HeLa expressando mKO2-NLS-CyclinB1 (esquerda) ou mKO2-CyclinB1 (à direita) foram tratados com controlo ou Cdc7-D siRNA e foram monitorados pela Olympus LCV100. As células mortas foram contadas no tempo imagens lapso nos tempos indicados. A morte celular foi suprimida em mKO2-NLS-CyclinB1 expressando células HeLa até 72 horas (em que metade das células HeLa Cdc7-empobrecido são normalmente mortos). mKO2-NLS-CyclinB1 plasmídeo foi construído através da inserção da sequência de NLS (PPKKKRKVEDP) a partir do antigénio T grande de SV40 no plasmídeo mKO2-CyclinB1 entre mKO2 e CyclinB1. Cerca de 200 ou 60 culas que expressam mKO2-NLS-CyclinB1 ou mKO2-CyclinB1, respectivamente, foram contadas. “N” representa o número de experiências independentes realizadas. células (B) HeLa que expressam mKO2-CyclinB1 (WT) ou mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) foram tratadas com controlo ou ARNsi Cdc7-D e a duração da expressão CyclinB1 antes da entrada na fase M foi medido nas imagens de lapso de tempo. Após a depleção de Cdc7, células NLS não se acumulam a CyclinB1 marcado em citoplasma, e continuou através do ciclo celular mais ou menos normal. células (C) HeLa foram tratadas com ARNsi indicados durante 48 horas. conteúdo de ADN foram analisadas por FACS (10.000 células para cada) e as fracções de sub-população G1 foram calculados e apresentados. Co-depleção de CyclinB1 reduziu a morte celular induzida por siARN Cdc7-D em células HeLa. (D), as células HeLa que expressam mKO2-CyclinB1 (WT) foram tratados com Cdc7-D ou Cdc7-D + CyclinB1 siRNA e o tempo (horas) entre o primeiro aparecimento de sinal mKO2-CyclinB1 citosólica e a sua translocação para o núcleo foi medida em as imagens de lapso de tempo de cada população de células. Down-regulação da expressão CyclinB1 encurtou a paragem G2 induzida pela depleção Cdc7. Em (B) e (D), o P-valores do teste t não pareado bicaudal foram calculados pelo software Prism.

G2 alongamento é causada pelo esgotamento de Cdc7 em células p53-negativos através MK2 activação

foi anteriormente relatado que a via de p38-MK2 é activada em células HeLa pela depleção de Cdc7 [17]. Por isso, nós examinamos se a esta via está envolvida na acumulação citoplásmica de CyclinB1 em células HeLa Cdc7-empobrecido. Em primeiro lugar, constatou-se que é MK2 hiperfosforilada por depleção Cdc7 em células HeLa, mas não em células U2OS ou NHDF (Fig. 5a). Esta activação de MK2 em células HeLa Cdc7-empobrecido pode ser devido a activação directa de MK2 replicação pelo estresse induzido Cdc7. Alternativamente, o aumento de células em fase G2 por depleção Cdc7 pode contribuir para a activação de MK2, desde MK2 é conhecido por ser mais activa em fases G2 e M. Co-depleção de Cdc7 MK2 e reduziu os níveis de proteína B1 e AuroraA ciclina e fosforilação de Cdc25C Ser216, indicando que a mitose é parcialmente restaurada (Fig. 5B). Também reduziu a ligação de 14-3-3σ e CyclinB1 /Cdc2 (Fig. 5C). No entanto, a co-depleção de Cdc7 e MK2 não previnem a morte de células HeLa, presumivelmente por causa depleção MK2 sozinho induziu morte celular significativa (dados não mostrados).

(A), HeLa (pistas 1, 2, 7 e 8 ), U2OS (pistas 3 e 4) e NHDF (pistas 5 e 6) as células foram tratadas com controlo ou ARNsi Cdc7 e os extractos celulares inteiros foram corridos num phosgel e analisados ​​por transferência de western. Pistas 7 e 8, extrai a partir de células HeLa tratadas com siRNA Cdc7 foram não tratadas (-) ou tratadas com λ-fosfatase (+). As setas indicam a banda MK2 fosforilada. células (B) HeLa foram tratadas com ARNsi de controlo (pistas 1 e 5), Cdc7 siRNA (pistas 2 e 6), Cdc7 e MK2 siRNAs (pistas 3 e 7) e MK2 siRNA (pistas 4 e 8), durante 48 horas, e CSK-solúveis (pistas 1-4; SUP) e -insoluble (pistas 5-8; PPT) as proteínas foram analisadas por western blotting. Tubulina e LaminB são mostradas como controlos de carga. grânulos (C) a glutationa Sepharose 4B que transportam a proteína GST-14-3-3σ foi incubada durante 1 hr a 4 ° C com extractos de CSK-solúveis de células HeLa tratadas com siRNA, como mostrado. As proteínas ligadas foram analisadas por transferência de Western. “Input” representa apenas os extratos sem a proteína GST-14-3-3σ acrescentou. Cdc7 e co-esgotamento MK2 reduzida a ligação entre 14-3-3σ e Cdc2 /CyclinB1. células (D) HeLa que expressam mKO2-CyclinB1 foram tratadas com ARNsi indicados. O tempo (hr) entre a primeira aparição do sinal mKO2-CyclinB1 citosólica e sua translocação para o núcleo foi medido nas imagens de lapso de tempo. foi observada co-esgotamento dos MK2, p38 (quinase a montante da MK2) ou ATR reduzida retenção citoplasmática de CyclinB1 (alongamento G2) em células HeLa Cdc7-empobrecido. Os valores de p do teste-t não emparelhado de duas caudas foram calculadas por software Prism. Cdc7-D siARN foi utilizado em todas as experiências.

O tempo necessário para a translocação nuclear após co-depleção de Cdc7 e MK2 foi reduzido perto do nível de controlo. Além disso, o alongamento G2 observada após depleção de Cdc7 foi cancelada também por co-depleção da ATR ou p38 com Cdc7 (Fig. 5D). Estes resultados indicam que este checkpoint G2 depende da ativação MK2 ATR-regulado.

acumulação citoplasmática de CyclinB1 não ocorre no U2OS p53-positivas ou HCT116 após Cdc7 esgotamento

Embora o esgotamento Cdc7 em células U2OS (osteossarcoma humano), a morte celular induzida vigorosa, os níveis das cinases mitóticas não aumentaram (Fig. 1). Por conseguinte, estabelecida U2OS que expressam estavelmente mKO2-CyclinB1, e examinaram o efeito de ARNsi Cdc7 sobre a dinâmica CyclinB1. Nesta linha celular, não observamos qualquer acumulação de CyclinB1 no citoplasma após a depleção Cdc7. O tempo necessário para a translocação nuclear de células U2OS Cdc7-empobrecido foi semelhante à das células de controlo (Fig. 6A). No entanto, tornou-se mais longo quando p53 foi co-empobrecido (Fig. 6A). O nível de proteína CyclinB1 ligeiramente aumentada após a co-depleção de Cdc7 e p53 em U2OS (Fig. 6B). A seguir, examinou uma linha de células de cancro do cólon, HCT116. Em células cancerosas HCT116 p53-positivas, os níveis de proteínas mitóticas tais como CyclinB1 e Plk1 diminuiu após a depleção Cdc7 presumivelmente devido a paragem em G1 (Fig. 7A). Concomitantemente, a actividade /Cdc2 CyclinB1 também foi reduzida em células HCT116 de p53-positivos Cdc7-empobrecido (Fig. 7B). O tempo necessário para a translocação nuclear em células HCT116 de p53-positivos Cdc7-empobrecido foi semelhante à das células de controlo (Fig. 7C, painel esquerdo). Em contraste, a actividade /CyclinB1 Cdc2 p53 em HCT116-negativo após a depleção Cdc7 foi quase a mesma que a do controlo (Fig. 7B). Além disso, como pode ser visto em células HeLa, o tempo necessário para a translocação nuclear em células HCT116 p53-negativo Cdc7-empobrecido foi maior do que a do controlo (Fig. 7C, painel da direita). Este alongamento G2 foi cancelada por co-esgotamento de Cdc7 e MK2 em células HCT116 p53-negativos (Fig. 7C, painel da direita). Estes resultados indicam que o alongamento fase G2 após a depleção Cdc7 depende da ausência da proteína p53 [15], [30] – [32]

células U2OS (A) que expressam mKO2-CycinB1 foram tratadas com ARNsi e tempo. imagens lapso foram gravadas por LCV100. O tempo (hr) entre a primeira aparição do sinal mKO2-CyclinB1 citosólica e sua translocação para o núcleo foi medido nas imagens de lapso de tempo de cada população de células. Em U2OS Cdc7-empobrecido, CyclinB1 não se acumula no citoplasma. No entanto, a co-depleção de Cdc7 e p53 provocou a acumulação no citoplasma CyclinB1 por um período mais longo. Os valores de p do teste-t não emparelhado de duas caudas foram calculadas por software Prism. (B) análise de Western de extractos integrais das células de células U2OS tratadas com ARNsi indicados durante 48 horas. Um phosgel foi usada para a detecção de MK2. Outras proteínas foram detectados num gel de gradiente 4-12%.

células p53-positivos ou HCT116 -negativa (A) foram tratados com o controlo ou ARNsi Cdc7-D durante 48 horas, e extractos de células inteiras foram analisadas por western blotting. (B) Os extractos CSK-solúveis foram preparados a partir das mesmas células que em (A) e imunoprecipitação foi realizada com anticorpo anti-CylinB1. actividade de cdc2-quinase foi medida CyclinB1 com histona H1 como um substrato (painel superior), conforme descrito em “Materiais e Métodos”. O gráfico abaixo mostra a quantificação do nível de fosforilação. painel inferior, análises de Western blotting de proteínas CyclinB1 nos imunoprecipitados utilizadas para ensaios de cinase. (C) (direita), as células HCT116 -negativas p53-positivos (esquerda) ou expressando mKO2-CyclinB1 foram tratadas com siRNA imagens lapso de tempo indicados e foram registados. O tempo (hr) entre a primeira aparição do sinal mKO2-CyclinB1 citosólica e sua translocação para o núcleo foi medido nas imagens de lapso de tempo. Os valores de p do teste-t não emparelhado de duas caudas foi calculada pelo software Prism.

Recentemente, relatou-se que o factor de transcrição FOXO3 está envolvida na paragem em G1, causada pela depleção de Cdc7 em as células normais [16]. FoxM1, outro membro da família Fox, é conhecido por regular a expressão de reguladores mitóticas tais como Plk, CyclinB1 e CyclinA após danos no ADN [33] – [36]. Expressão de FoxM1 é regulada negativamente pela p53 [37], [38]. Em células HeLa, que mostram que os níveis de mRNA de FoxM1 aumentou após depleção Cdc7 (Fig. 8A), que também pode ser parcialmente responsável por um aumento dos níveis de proteína FOXM1 sob a mesma condição. Estes resultados sugerem que estes factores de transcrição da família Fox podem estar envolvidos na paragem do ciclo celular e a indução de morte celular por depleção Cdc7 em células p53-negativo. knockdown dupla de Cdc7 e FoxM1 em células HeLa reduziu drasticamente o nível de mRNA CyclinB1 comparação com Cdc7 esgotamento sozinho. O nível de proteína CyclinB1 também diminuída por co-depleção de Cdc7 e FoxM1, mas não ao ponto de o nível de ARNm (Fig. 8B).