Sumário

cancros da bexiga geralmente mostram aberrações genéticas na via de sinalização fosfatidilinositol 3-quinase. Aqui temos rastreadas quanto a mutações em

PIK3R1, que codifica p85α, uma das subunidades reguladoras de PI3K. Duzentos e sessenta e quatro tumores da bexiga e 41 linhas celulares de tumor da bexiga foram rastreados e 18 mutações foram detectados. Treze eram mutações em domínios C-terminais e são previstos para interferir com a interacção entre p85α e p110α. Cinco mutações eram de domínio BH de PIK3R1. Esta região tem sido implicada em papéis independente de p110α de p85α, tais como ligar e alterar as actividades de PTEN, Rab4 e Rab5. A expressão destas formas BH-p85α mutantes em fibroblastos de rato embrionários com nocaute p85α indicaram que todas as formas, excepto os mutantes de truncagem, pode ligar-se e estabilizar p110α mas não aumentou a fosforilação de AKT, sugerindo que as mutações BH funcionar independentemente de p110α. Num painel de linhas de células tumorais de bexiga 44, 80% tinha reduzido a expressão de ARNm PIK3R1 em relação a células normais uroteliais. Isto, junto com mutação do

PIK3R1

, podem alterar o funcionamento de domínio BH. Nossos resultados sugerem que as formas mutantes de p85α pode desempenhar um papel oncogênico no cancro da bexiga, não só através de perda de capacidade de regular p110α mas também via função alterada do domínio BH.

Citation: Ross RL, queimaduras JE, Taylor CF, Mellor P, Anderson DH, Knowles MA (2013) Identificação de mutações em regiões distintas do p85 Alpha em câncer urotelial. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10.1371 /journal.pone.0084411

editor: Karl X Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2013; Aceito: 18 de novembro de 2013; Publicação: 18 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ross et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro fornecida por Yorkshire Cancer Research (https://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) e da Universidade de Leeds MRC studentship (MK, RR), Canadian Institutes of Health Research (http: //www.cihr-irsc.gc. ca /e /193.html) (MOP84277) (DA), e Saskatchewan Health Research Foundation Fellowship (https://shrf.ca/)(PM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) via de sinalização desempenha um papel crítico na regulação do crescimento celular, proliferação e sobrevivência [1] e mutações que conduzem à activação aberrante da via são encontrados em praticamente todos os tipos de Câncer. No carcinoma urotelial (UC) da bexiga urinária, várias alterações genómicas que levam a desregulação da via foram identificados. Estes incluem mutações inativadoras em

PTEN

e

TSC1 Comprar e mutações ativadoras em

PIK3CA

e

AKT1

[2,3,4,5,6, 7,8]. Anteriormente, demonstrou que vários destes eventos são não-redundante, o que sugere que a mutação de mais do que um membro do percurso pode ter efeitos aditivos ou sinérgicos [4]. Estas alterações são encontrados tanto em baixo grau UC, não-invasiva e músculo-invasivo, indicando que esta via desempenha um papel crítico no desenvolvimento da UC e sugerindo que ele representa um alvo terapêutico importante nestes cancros.

PI3 quinases fosforilam a posição 3` no anel inositol de phosphinositol-4,5-bifosfato (PIP2) para gerar o segundo mensageiro lipídico phosphinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), que activa a sinalização a jusante AKT. A classe IA PI3Kαis um heterodímero obrigatório que consistam na subunidade p110αcatalytic (p110α), codificadas pelo

PIK3CA

gene, e uma subunidade reguladora, codificada por um dos 3 genes,

PIK3R1, PIK3R2 Comprar e

PIK3R3

. As subunidades reguladoras são essenciais para a estabilidade de p110α e no estado de repouso suprimir a sua actividade catalítica [9]. Cada um tem dois domínios SH2 que se pode ligar ativados receptores do fator de crescimento ligados à membrana ou moléculas de adaptador, alterando a sua conformação, aliviando a inibição da p110α e permitindo p110α para fosforilar PIP2 [10].

As mutações do

, p85α codificação, têm sido relatados em alguns tipos de câncer. Em um linfoma do rato induzida por irradiação-X, uma forma truncada (p65) que contém apenas aminoácidos 1-571 foi identificado e mostrados para conferir um aumento de

in vitro

atividade quinase em p110α [11]. Esta forma truncada de p85α foi demonstrado mais tarde que falta a região crítica inter-SH2 (iSH2) necessária para uma inibição de actividade p110α [12]. Uma forma truncada semelhante foi relatado na linha de um Hodgkin de células de linfoma humano [13] e 4 deleções menores, dentro de exons 14 ou 15 que codificam a região de iSH2, em cancros do ovário e cólon [14]. Duas mutações de splicing também foram identificados, os quais levaram a saltar do exão 15. A expressão de uma destas formas mutantes com uma deleção do exão 13 resultou em activação constitutiva da via PI3K em células, fornecendo evidências de que p85 mutante pode actuar como um oncogene no cancro humano. Uma deleção 9 pb abrangendo a junção exão-intrão do exão 12 [15] e 9 outras mutações, dos quais oito eram na região de iSH2 foram identificados em glioblastomas [16] e 15 mutações foram encontradas no cancro do cólon, a maior parte das quais eram mostrado para reduzir a sua actividade inibidora de p110α embora mantendo a capacidade de estabilizar o complexo [17]. Um único

PIK3R1

mutação foi relatado recentemente em um estudo da UC que rastreados exons 12, 14 e 15, ( 1% de frequência) [18]. Em contraste com essas baixas frequências de mutação, que recentemente foi relatado que 20 – 40% dos cânceres de endométrio endometrióides conter

PIK3R1

mutações, a maioria nos domínios nSH2 e iSH2 [19,20].

A nossa descoberta anterior de mutações em vários componentes da via PI3K na UC, eo achado de

PIK3R1

mutações em outros tipos de câncer, nos levou a procurar mutações em

. Como evidência surgiu de que se os domínios N-terminais de p85α têm funções oncogênicos, que escolheu para a tela toda a sequência codificadora de

PIK3R1

, em vez de se concentrar em exons 12, 14 e 15. Aqui nós relatamos uma série de mutações em linhas UC derivadas de células e tumores de UC primárias, incluindo deleções na região de iSH2 e uma série de mutações de sentido trocado, vários na homologia de regiões de grupos de ponto de interrupção (BH) de domínio, que tem actividade de GTPase direcção Rab5 [21] e podem ligar-se PTEN [22,23]. Nossos resultados sugerem que as formas mutantes de p85α pode desempenhar um papel oncogênico no cancro da bexiga, não só através de perda de capacidade de regular p110α mas também via função alterada do domínio BH.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Leeds Ética em Pesquisa (99/156) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

amostras de pacientes e isolamento de ADN

biópsias copo frio de 264 carcinomas uroteliais (UC) foram recolhidos, congelado e armazenado em nitrogênio líquido. O restante do tecido foi embebido em parafina para avaliação de diagnóstico. O painel de tumor consistia de 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 pT2G3, 5 G1, 8 G2 e 4 tumores G3 sem estroma subjacente (PTX) e 11 tumores com nenhuma informação [24,25]. Todos eram carcinoma de células transicionais. O DNA foi extraído a partir de secções congeladas e amostras de sangue venoso, como descrito anteriormente [4].

linhas de células uroteliais

Quarenta e quatro linhas de células UC (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97-24, 97-7, BC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, JO’N, KU -19-19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, SCaBER, SD, SW780, SW1710, T24, TCCSUP, U-BLC1, UM-UC3, VM -CUB-1, VM-CUB-2 e VM-CUB-3) foram investigados (Tabela S1). linhas LUCC1-LUCC8 foram estabelecidas em laboratório dos autores a partir de tecidos de tumor de bexiga obtidas com consentimento informado por escrito. identidade da linha celular foi verificada por meio de curto conjunto tipagem de DNA de repetição usando PowerPlex 16 kit (Promega). Perfis foram comparados com os dados disponíveis publicamente (ATCC, DSMZ) ou na ausência de perfil de referência estava disponível, foram confirmados como único. O DNA foi extraído como descrito anteriormente [4].

Mutation análise

A sequência de codificação inteira de

PIK3R1

foi examinada em 18 fragmentos de alta resolução fusão análise como descrito [26 , 27]. ADN a partir de amostras de sangue combinados foi analisado para confirmar o estado de mutação somática. As sequências dos iniciadores são dadas na Tabela S2. As mutações foram registados com referência à NM_181523.

alelo de PCR específica (AS-PCR) foi realizada para estabelecer a fase de um dos pares de mutações na linha celular LUCC3 e na amostra de tumor 2 (Tabela 1). Um iniciador directo foi desenhado para amplificar especificamente o alelo mutante no 5` local da mutação e foi combinado com um iniciador inverso posicionado para incluir a segunda mutação no produto de PCR (Tabela S3). Os produtos foram corridos num gel de agarose para identificar uma amplificação bem sucedida de ADN da linha de tumor /células única e sem amplificação a partir de sangue e de ADN WT. Os produtos de PCR foram verificados-sequência

Amostra

Grade /estágio

Exon

Nucleotide mudar

mudança de aminoácidos prevista

1TaG32

1c..409G . AE137K2TxG35c.652GT E218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310

2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W

3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 de emenda acceptorc.1986-1 G Tabela CUnknown 1. Mutações no PIK3R1 identificadas em tumores da bexiga e linhas celulares

1cDNA sequência de referência:. NM_181523;

2 mutação em apenas uma população menor de sequências;

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Os vectores de expressão e transdução de linhas celulares

A clonagem de inserções que codificam a full-length do tipo selvagem (WT) p85α humana e bovina p85α R274A mutante em pGEX-6P (GE Healthcare Life Sciences) tem sido descrita [21]. Mutantes E137K, R162 *, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q foram criados através de mutagénese dirigida ao local, utilizando o método QuikChange (Stratagene, CA, EUA) e clonado em pFB Hyg [28] em enquadramento com um marcador de HA N-terminal utilizando o método de infusão (Clontech, CA, EUA).

Controlo ADNc, N564D e p85Δ, foram gentilmente cedidas por Genentech [17] e subclonado pFB Hyg pelo mesmo método. Todos os plasmídeos foram verificados-sequência. As construções foram transfectadas em células Phoenix Um usando o transporte 293 (Mirus, Madison, EUA). Fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) com nocaute de p85α, β, δ (um presente amável de Lewis Cantley, Harvard Medical School), fibroblastos de rato NIH3T3 e fibroblastos de rato Rat1, foram incubadas com sobrenadante retroviral contendo 8 ug /ml de polibreno e selecionados com 500 , 200 e 250 ug /ml de higromicina, respectivamente.

caracterização funcional de mutantes de domínio BH

As células foram lisadas e a proteína extraída usando CelLytic Mammalian Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido) de acordo com as instruções dos fabricantes e quantificada como descrito anteriormente [29]. Anti-HA imunoprecipitação Kit (Sigma-Aldrich) foi usado de acordo com as instruções dos fabricantes para experiências de co-immunoprecipation. proteínas imunotransferidas foram incubadas com anticorpos primários; anti-p85α (Abcam, Cambridge, UK), anti-p110α, anti-pAKT (Ser473), anti-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, Reino Unido) e alfa anti-tubulina (ABD Serotec, Kidlington, Oxford, Reino Unido). os anticorpos primários ligados foram detectados usando anticorpos secundários conjugados com HRP e Luminata Forte Ocidental HRP Substrate (Millipore, Watford, Reino Unido). Anchorage-independente crescimento foi realizada como previamente descrito [29] e as colónias com um diâmetro ≥50 uM foram contadas num período de 2,5 mm

2.

Análise do ARNm PIK3R1 e a expressão da proteína em UC

p> dados de expressão de mRNA PIK3R1 para 105 amostras de tumores de bexiga e 52 amostras da bexiga normais relatados por Sanchez-Carbayo et al [30] foram acessados. a expressão da proteína PIK3R1 foi avaliada em 44 linhas de células UC e agrupados urothelial células humanas normais (NHU-pool) por western blot e normalizada a tubulina.

Resultados

Identificação de somáticas

PIK3R1

mutações

Nós rastreados toda a sequência codificadora de

PIK3R1 Compra de mutações em 264 tecidos tumorais UC e 41 linhas de células UC. As três isoformas conhecidas de PIK3R1, p55α p85α e p50α conter diferentes exões. Exons 1-6 são exclusivas para p85α, exão 7 está presente apenas em p50α e exon 8 apenas em p55α. Os exões 9-17 estão presentes em todas as isoformas, mas o uso de um local de junção crípticos dentro do exão 16 resulta na geração de ADNc que diferem no comprimento por 8 codões [31], sendo que ambos foram cobertos por esta tela. Dezoito mutações foram identificadas em 13 tumores. Um tumor (tumor 2) continha três e uma (5 tumoral) continha duas mutações (Tabela 1). Todos foram confirmados como mutações somáticas com a sua presença no ADN derivado de tumores, mas não o sangue do paciente. Uma linha celular derivada de tumor (LUCC3) continha duas mutações e estes também foram confirmados como somáticas na origem. Todas as mutações foram confirmadas por amplificações por PCR da repetição para descartar artefatos de PCR. A natureza e a distribuição das mutações são mostradas em relação à estrutura da proteína p85α na Figura 1. Cinco foram localizados no domínio BH (Figura S1). Nenhum estavam em exons que são exclusivas para p50α ou p55α, embora vários foram localizados nos exons 2, 5 e 6, que são únicas para p85α. Não foram identificadas mutações na região do exão 16, que é de splicing alternativo.

alelo de PCR específica (AS-PCR) foi utilizado para determinar se as 2 mutações na linha celular LUCC3 (c.1519GC e c.1670GC; E507Q e R557P) e as 2 mutações em ex�icas tumor 2 (c.652GT e c.862AC; E218 * e K288Q) estavam presentes em

cis

ou em

trans. Em LUCC3, um iniciador específico da mutação para c.1519C amplificado com sucesso a partir de um produto de PCR do exão 13 e 14 (Figura S2A). A sequenciação do produto confirmou a presença de c.1670C mutação, indicando que ambas as mutações no domínio iSH2 estão no mesmo alelo. AS-PCR A análise de tumor 2 também confirmou que as mutações ex�icas 2 (E218 domínio BH * e mutações K288Q) estavam presentes no mesmo alelo (Figura S2B).

Em 5 de tumor, perfis de sequência indicou que uma das mutações (R358 *) estava presente como uma única população de moléculas de menor, enquanto que a outra (Q579_Y580del) apareceu heterozigótica. A distância genómico entre os exões 10 e 14 de desenvolvimento impedidas de um ensaio de PCR específica do alelo para determinar se estas mutações estavam no mesmo alelo. O pequeno sinal a partir da mutação R358 * pode indicar que estava presente apenas como um evento de sub-clonal menor. Este parecia ser o caso, como a análise de tecido a partir de uma recorrência da doença subsequente neste paciente mostrou apenas Q579_Y580del.

Previsto efeito de mutações na função da proteína

As posições dos resíduos missense mutação que estão representados na estrutura de cristal disponíveis são apresentados na Figura 2. as duas mutações, R358 * e N377K, foram identificadas no domínio nSH2. Os resultados recentes sugerem que esta região de atos p85α como um andaime para a p110α – complexo p85α, com interações com C2, domínios helicoidais e quinase de p110α e com iSH2 p85α [32]. R358 * trunca a proteína no local de nSH2 fosfopeptídeo ligação (FLVRDAS). Esta mesma mutação foi recentemente relatada em 5 amostras de cancro do endométrio, onde representou 5% de todas as mutações identificadas [20]. Arginina 358 foi identificada como a formação de uma ponte salina com E542 p110α em [32] e a mutação engenharia R358A foi demonstrado que suprime a ligação fosfopéptido [9]. Assim, a perda de R358 e truncamento neste ponto é provável resultar em ruptura de ligação e interacção do fosfopéptido p85α com o domínio helicoidal de p110α e pode imitar o efeito de mutações no domínio p110α helicoidais. Nós temos mostrado previamente que as mutações no domínio helicoidais E542K e E545K são de longe as mutações mais comuns encontrados em

PIK3CA

no cancro da bexiga [4] e são mais potentes que H1047R na indução de sinalização a jusante da AKT e proliferação na confluência e sob condições de depleção de nutrientes quando expresso em células uroteliais normais [29]. À medida que a truncagem remove mutante R358X ambas as regiões iSH2 e cSH2 da proteína, a interacção com o domínio C2 de p110α é perdida e efeitos podem imitar as descritas para mutações e truncagens que afectam estes domínios [33]. A partir dos dados de sequenciação, e o conhecimento de que não havia tecido normal mínima contaminante na amostra, esta mutação parece ser heterozigótica. Assim, previu-se que, além da proteína truncada, a proteína mutante não estava disponível para ligação e estabilização p110α neste tumor.

A. diagrama de fita da estrutura do complexo de p110α com a região de niSH2 p85α (código PDB 2RD0) mostrando os resíduos mutados em UC. B. Relação de p85α nSH2 para p110α C2 domínio mostrando proximidade do N377 em nSH2 de resíduo de domínio C2 E365. C. Relação do domínio iSH2 de p85α com o domínio C2 de p110α mostrando proximidade do R557 para N345 em C2. modelo mostrando resíduos R481 e R557 em iSH2 de p85α em contato com C2 do p110α D. Espaço de enchimento. E. Estrutura do dímero p85 (código PDB 1PBW) mostrando a posição de resíduos mutação de ponto PIK3R1 E137, R262 e K288 e região suprimida (W237-Y242) em UC em relação aos resíduos envolvidos na p85 dimerização (M176, verde escuro /luz ciano; L161, I177 e V181, luz verde /ciano). A posição do resíduo R274 (magenta), que está implicada na actividade Rab-GAP também é mostrada. Além disso, três resíduos de ácido glutâmico (E266, E284 e E291) que interagem com R262 são indicados, com E291 também interagir com K288.

N377, que foi mutado para lisina, é adjacente ao G376, que foi encontrado anteriormente para ser mutado para arginina em 3 casos de glioblastoma [16,34]. Ambos os resíduos estão dentro de uma região (374-377) que é previsto para interagir com os resíduos 364-371 do domínio C2 de p110α [32]. Na estrutura de cristal de p110α em complexo com p85niSH2, tanto G376 e N377 estão dentro da distância de ligação de hidrogénio de E365 em p110α C Figura 2B.

seis mutações missense e duas eliminações em-quadro foram identificadas no domínio iSH2. Esta é a região onde a maioria das mutações foram encontradas em outros cancros, embora nenhuma das alterações encontradas aqui são idênticos aos descritos anteriormente [14,16,17,19,20]. Esta região da proteína está envolvida na interacção com a região de ligação do adaptador de p110α e na estabilização e inibição da sua actividade catalítica no estado basal através da interacção com o domínio C2. O efeito previsto de algumas mutações em iSH2 é perturbar a interface com p110α C2 [16,33]. Por exemplo, p85α resíduo, N564, está dentro da distância de ligações de hidrogénio de N345 em C2 p110α (Figura 2C), um resíduo que foi encontrado mutado em p110α [35]. D560Y relatado no glioblastoma [16], também está dentro da distância de ligação de hidrogénio de N345 e ambos são previstos, por conseguinte, para imitar a mutação oncogénica N345. Aqui encontramos uma nova mutação, R557P que também está perto de N345 de p110α (Figura 2C). R481, que foi encontrado mutado para triptofano, também está em estreita proximidade com o domínio C2 de p110α Figura 2D).

As duas deleções em-quadro identificados em iSH2 (I566_D578del Q579_Y580del e) remover os resíduos de aminoácidos que têm foi encontrado para ser excluído em cancros do ovário e colo-rectal [14,17] e glioblastoma [16] e estão previstas para perturbar a estrutura secundária helicoidal nesta região e perturbar a interação com C2 p110α. O Q579_Y580del mutação tem sido relatado para se ligar e estabilizar p110α mas reduziram a capacidade de regular a actividade de quinase lipídica da p85α p110α holoenzima [17]. Recentemente, nove das mutações nSH2 e iSH2 encontrados em outros tipos de cancro foram expressos em fibroblastos de embrião de galinha e toda a transformação induzida, medida pela actividade de formação de foco, o aumento da proliferação e sinalização aumentada através da PI3K [36]. Os inibidores específicos de p110α, mas não os inibidores de p110γ p110β, ou p110δ aboliu os efeitos fenotípicos de duas destas formas mutantes derivadas de tumores (KS459delN, DKRMNS560del), indicando que a actividade oncogénica destes mutantes é mediada exclusivamente por p110α.

a mutação mais N-terminal identificou iSH2, N441I, é numa região ligante entre nSH2 e iSH2, e encontra-se perto da extremidade da segunda hélice alfa de iSH2. Esta região não for resolvido nas estruturas cristalinas publicadas e seu potencial efeito não é clara. T654I no domínio cSH2 está perto de vários resíduos que são mutados no câncer colorretal [17] e é imediatamente adjacente ao motivo FLVRES (resíduos 646-651) necessários para o envolvimento fosfotirosina. Um resíduo de serina ou treonina nesta posição encontra-se nos domínios SH2 de uma ampla gama de proteínas. Várias mutações dentro deste domínio têm sido relatados em cancros colo [17], mas não no glioblastoma [16,34], levantando a possibilidade de que pode haver diferenças específicas de tecido.

Curiosamente, encontramos cinco mutações dentro do BH domínio de PIK3R1 (28% das mutações encontradas) (Figura 1; Figura S1). telas de mutação anteriores identificaram apenas sete mutações nesta região (K142fs, E160 *, R162 *, I177N, E217K, N285H, E297K) em mais de 1550 amostras de outros tumores notificados até à data [14,16,17,18,19, 20,34] ( 0,5%). Todas as mutações missense nesta região (E137K, R262T e K288Q) estão em resíduos altamente conservados (Figura S3). A estrutura desta região da proteína (aminoácidos 105-319), como um homodímero tem sido relatada [37]. A interface entre os domínios BH foi mostrado para envolver a interacção de M176 de um monómero com L161, V181 I177 e no outro. As três mutações pontuais e eliminação identificados aqui são remotas desta região de interação (Figura 2E).

mutantes do domínio P85α BH interagir com e estabilizar p110α

Para determinar se as proteínas mutantes de domínio BH tem p110α efeitos dependentes, testou sua capacidade de interagir com e estabilizar p110α. p85α, β δ knockout (null pan-p85) MEFs foram transduzidas com vectores de expressão retrovirais que codificam N-terminal marcada com HA p85α cDNA que codifica as formas mutantes de domínio BH identificados na UC (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), outra formas mutantes como controles (R162 *, p85Δ, R274A bovina, N564D), do tipo selvagem (WT) ou vector vazio. R162 * mutante p85α é uma mutação domínio BH previamente identificado no cancro [17] e como p85Δ carece da região p110α de ligação (N-iSH2) [38]. Ambos têm sido anteriormente demonstrado que não interagem com p110α [17]. N564D iSH2 p85α mutante foi utilizado como um controlo positivo, uma vez que tenha sido previamente demonstrado que se ligam p110α, aumentar PI3K e actividade de AKT, e induzir a sobrevivência da célula, crescimento independente de ancoragem e os fenótipos relacionados com a transformação, que foi p110-dependentes [17]. Também foi usado aqui para avaliar potenciais diferenças entre as formas mutantes de domínio BH e iSH2 de p85. R274A é uma forma mutante de domínio BH engenharia de p85α bovino que foi mostrado anteriormente para inibir a actividade de p85-GAP e foi oncogénica [21,39].

Expressão de p85α foi confirmada por Western blotting (Figura 3A). A proteína truncada foi p85α visível na R162 * -MEF (18 kDa), mas no E218 * -MEF, a proteína truncada (24 kDa) foi expresso a um nível muito baixo. Três transduções independentes com E218 * vírus induziu consistentemente a expressão da proteína de baixa o que sugere que esta proteína pode ser instável. Curiosamente, R162 * -MEF também expressou uma pequena quantidade de proteína p85α de corpo inteiro.

A. Immunoblot que mostra os níveis de expressão de proteína em células transduzidas p85α. B. Co-imunoprecipitação de proteínas HA-tag seguido por immunoblot com p85α e p110α para determinar p85-p110 vinculativo. C. Análise de imunotransferência da sinalização de PI3K (níveis de pAKT (Ser473)) em meio contendo soro e gráfico de barras que mostra a quantificação de pAKT normalizada para AKT total relativo de controlar. D. Análise de imunotransferência da pAKT (Ser473) em meio contendo soro e gráfico de barras mostra a quantificação da pAKT normalizado para AKT total relativo de controlar.

Pan-p85 MEFs nulos têm baixos níveis de p110α, que pode ser restaurado pela expressão de tipo selvagem p85α [40]. Confirmámos isto e mostrou que todas as formas mutantes excepto E218 *, * e R162 p85Δ teve o mesmo efeito (dados não mostrados). Co-immunopreciptation de proteínas p85 marcadas com HA foi utilizado para avaliar p110α ligação (Figura 3B). Os resultados indicaram que todas as proteínas p85, excepto E218 *, * e R162 p85Δ, poderia ligar-se p110α.

BH e iSH2 mutantes do domínio de p85α mostram efeitos diferentes sobre a activação AKT e crescimento

independente de ancoragem

p85α formas mutantes de domínio C-terminais que afetam a atividade p110α normalmente resultam em ativação de AKT. Isto tem sido demonstrado por vários mutantes p85α que se podem ligar p110α [17,19,20]. Em pan-p85 MEFs nulos reconstituído com o tipo selvagem e às formas mutantes de p85α, descobrimos que apenas o mutante N564D induziu níveis aumentados de fosfo-AKT (Ser473), tanto em meio contendo soro (Figura 3C), e em condições de soro -deprivation (dados não mostrados). Isto também foi observado em células NIH3T3 expressando de tipo selvagem e mutantes de formas p85α quando mantido em condições suplementado com soro (Figura 3D). Isto é consistente com o achado anterior em células NIH3T3 que bovina R274A não afecta a fosforilação de AKT após a estimulação com FCDP [21]. Este padrão foi reflectida nas taxas de proliferação de células NIH3T3 e MEF quando mantidas em meio contendo soro e na avaliação do crescimento independente de ancoragem de células NIH3T3 (dados não mostrados). A análise do crescimento independente de ancoragem de células que expressam Rat1 de tipo selvagem e mutantes de formas p85α mostrou que, embora mutantes do domínio BH induzida alguma formação de colónias relativamente ao tipo selvagem p85α, N564D teve o maior efeito (Figura S4).

Relações com outras mutações em genes da via PI3K

Anteriormente, rastreadas as amostras analisadas aqui para

PIK3CA

mutação [[4] e dados não publicados]. Apenas duas amostras continham tanto

PIK3R1

e

PIK3CA

mutações (E545K) e um deles foi o tumor que tinha uma mutação domínio BH (E137K) em

PIK3R1

. No geral, 61 dos tumores rastreados conter

PIK3CA

mutações (23%). Assim,

PIK3CA

mutação foi sub-representadas no subconjunto que tinha

PIK3R1

mutação (1 observado; 5 esperado). Assim

PIK3R1

não mutações no domínio BH parecem ser mutuamente exclusivos com

PIK3CA

mutação em UC. Não houve relação significativa de

PIK3CA

ou

PIK3R1

mutação com o grau do tumor ou estágio. Quatro das amostras contêm

AKT1

mutações (E17K), nenhum dos quais co-existia com

PIK3R1

mutação.

TSC1

estado de mutação é conhecida por 148 tumores da série, dos quais 14 contêm uma mutação [4]. Um destes tumores tinham uma mutação no domínio BH de

PIK3R1

(W237_Y242del). No entanto o tamanho da amostra e mutação frequências são pequenos demais para qualquer coincidência significativa ou exclusividade mútua a ser identificado.

expressão PIK3R1 é reduzida na UC e linhas celulares

Como mutações p85α pode alterar a proteína: proteína do p85α, alguns dos quais, particularmente aqueles no domínio BH, pode indicar um papel supressor de tumor , considerou-se a possibilidade de que a regulação negativa da proteína pode contribuir para o desenvolvimento do tumor.

PIK3R1

está localizado no cromossomo 5 (5q13.1). Perda de heterozigosidade (LOH) e número de cópias perda de sequências de 5q foram relatados no cancro da bexiga [41,42]. Por disposição CGH descobrimos que 29% do músculo UC invasiva tem cópia perda número na região de

PIK3R1

[43]. O exame dos dados de expressão publicamente disponíveis indicaram que a UC tem uma redução significativa na expressão PIK3R1 ao nível de ARN (Figura 4A).

A. Análise dos níveis de expressão de mRNA p85α em 105 amostras de tumores de bexiga e 52 amostras da bexiga normais. Os dados de Sanchez-Carbayo et al [30]. B. A análise quantitativa de p85α imunologicamente amostras de proteína a partir de linhas celulares de cancro da bexiga normalizados à tubulina e mostrados em relação a células agrupadas normais humanos uroteliais (NHU-piscina).

Nós avaliamos a expressão da proteína p85α em 44 células UC linhas utilizando transferência de western. Isto revelou grande variação nos níveis de expressão com a maioria das linhas celulares (80%), mostrando reduzida p85α expressão da proteína em comparação com células uroteliais normais (Figura 4B).

Discussão

Neste estudo foram encontrados

PIK3R1

mutações em 4,9% do UC. O maior frequência encontrada aqui do que no estudo anterior da UC [18] reflete a nossa avaliação de todo o gene e não apenas os exons 12, 14 e 15. Nossos dados para os três exons revelou 5 mutações (1,8% de tumores), compatíveis com este estudo anterior. A maioria das mutações foram localizados na região C-terminal de p85α semelhantes aos encontrados em outros cancros humanos [14,16,17,19,20]. As mutações identificadas nos domínios nSH2 iSH2 e pode imitar o efeito de mutações p110α aliviando a regulação inibitória de p110α por p85α e a actividade oncogénica destes mutantes parece ser dependente p110α [36].

Curiosamente, encontramos uma maior freqüência de mutações no domínio BH comparação com telas de mutação anteriores. Se este é específico para a UC ainda não é clara devido ao foco de muitos estudos apenas na região p110α -interacting do gene. Dados recentes sugerem que o domínio BH formas mutantes de p85α pode alterar a estabilidade de PTEN [20]. p85α se liga a PTEN não fosforilada dentro do complexo de elevado peso molecular PTEN peso associado (PAC) [22]. Esta interacção envolve a região N-terminal de p85 (SH3-BH) e tem sido demonstrado que regulam positivamente a actividade de quinase lipídica de PTEN de uma forma dependente do factor de crescimento [23]. Expressão de p85α com deleção do domínio BH sozinho interação significativamente reduzido com PTEN e exclusão de ambos os domínios abolido, levando ao aumento da amplitude e duração da ativação do AKT após a estimulação do fator de crescimento [23]. Assim, PTEN: p85α interacção parece potenciar a capacidade de reduzir os níveis de PTEN de PIP3 e terminar a sinalização de AKT. Na verdade, o E160 * mutação identificada no carcinoma do endométrio tem sido demonstrado que desestabilizam PTEN e resultar num aumento da fosforilação de AKT [20].

A região BH também apresenta homologia de sequência com proteínas RhoGAP e possui actividade de GAP para Rab5, Rab4, Cdc42 e Rac1 [21].