Abstract
resistência à quimioterapia é a principal razão para o fracasso do tratamento de câncer de ovário. Um mecanismo por trás quimio-resistência envolve a regulação positiva de genes resistência a múltiplas drogas (MDR) (transportadores ABC) que efetivamente Transportes (efluxo) drogas para fora das células tumorais. Como um sintoma comum em estágio III /pacientes com câncer de ovário IV, ascite está associada com a progressão do câncer. No entanto, se a resistência unidades ascite múltiplas drogas em células de cancro do ovário aguarda elucidação. Aqui, demonstramos que quando cultivadas com ascite derivadas de ratinhos com cancro do ovário, uma linha celular de cancro do ovário murino tornou-se menos sensível ao paclitaxel, um primeiro agente quimioterapêutico linha para doentes com cancro do ovário. Além disso, a incubação de células de câncer de ovário murino
in vitro
com ascite impulsiona a função de efluxo nestas células. Estudos funcionais mostram efluxo-driven ascite é suppressible por inibidores específicos de qualquer um dos dois transportadores ABC [proteína Multidrogaterapia relacionada (MRP1); Breast Cancer Proteína Relacionada (BCRP)]. Para demonstrar a importância das nossas descobertas para os pacientes de cancro do ovário, estudámos o efluxo relativo em células de cancro do ovário humanos obtidos a partir de qualquer de ascites de doentes ou a partir do tumor primário. As linhas celulares imortalizadas desenvolvidos a partir de ascites humanos mostram um aumento da susceptibilidade para efluxo de inibidores (MRP1, BCRP) em comparação com uma linha celular derivada de um cancro primário do ovário, o que sugere uma associação entre a função de ascite e efluxo no cancro do ovário humano. Efluxo em células de cancro do ovário humano derivadas de ascites está associada com a expressão aumentada dos transportadores de ABC em comparação com a de células cancerosas primárias derivadas de tumores do ovário humano. Colectivamente, as nossas descobertas identificam uma nova actividade para a promoção de ascite em resistência a múltiplos fármacos do cancro do ovário
citação:. L Mo, V Pospichalova, Huang Z, Murphy SK, Payne S, Wang M, et al. (2015) ascite aumenta a expressão /função da multirresistência proteínas em células do cancro do ovário. PLoS ONE 10 (7): e0131579. doi: 10.1371 /journal.pone.0131579
editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos
Recebido: 05 de dezembro de 2014; Aceito: 03 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Mo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Dados Disponibilidade: Todos os dados são contido no papel
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por CZ.1.07 /2.3.00 /30,0009, Fundo social Europeu (VP) (https://ec.europa.eu/esf/home.jsp ), W81XWH-11-1-0469, Departamento de Defesa Award Ovarian Cancer Research Programa (SKM) (https://cdmrp.army.mil/ocrp/), Gail Parkins Fundo de Investigação do cancro do ovário (SKM) (http: //www.ovarianawareness.org), o Fundo interno Reserva do Departamento de Patologia da Duke University Medical Center (SVP). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
debulking tumor operativo é efectuada essencialmente numa fase I /II pacientes com câncer ovariano. Este procedimento cirúrgico para a doença em fase avançada (III a IV) nem sempre é possível, especialmente em mulheres cuja doença é extensa [1]. Portanto, a quimioterapia é a principal ferramenta para bloquear a disseminação de células cancerosas quando os médicos tratam pacientes em estágios avançados de câncer. Em comparação com as células normais, que proliferam activamente células de cancro são mais sensíveis a uma variedade de fármacos citotóxicos dirigidos a diferentes processos celulares, incluindo agentes alquilantes de ADN, anti-metabolitos, agentes intercalantes e os inibidores da mitose [2].
A quimioterapia de primeira linha para o cancro do ovário permaneceu inalterada ao longo da última década, com a espinha dorsal terapêutico que consiste em um composto de platina (geralmente carboplatina) e um taxano (paclitaxel em geral) [3]. quimioterapias de segunda linha são considerados quando os pacientes não respondem aos medicamentos de primeira linha. Um número de agentes antineoplásicos têm demonstrado actividade biológica suficiente para ser considerada escolhas de segunda linha racionais, tais como doxorrubicina, etoposido, gemcitabina, ifosfamida, ciclofosfamida ou [4].
quimio-resistência, caracterizada por uma capacidade reduzida da quimioterapia para inibir o crescimento do tumor ao longo do tempo, é a razão mais comum único para a descontinuação do tratamento de quimioterapia. recorrência do câncer de ovário é um resultado direto de quimio-resistência, ocorrendo em mais de 80% dos pacientes de alto grau seroso do ovário cancerosas [3, 5]. Os mecanismos por trás quimio-resistência incluem: 1) regulação positiva de resistência a múltiplas drogas (MDR) genes que efetivamente transportar drogas para fora da célula; 2) alteração de enzimas metabolizadoras de drogas, tais como aqueles na família glutationa S-transferase (GST); 3) de escape da apoptose e aumento da reparação de ADN, devido a genes mutantes supressores de tumor [p53, cancro da mama 1/2 (telangiectasia mutada ATM) genes BRCA1 /2), e ataxia (] [2]; e 4) comprometimento do checkpoint fuso mitótico levando à resistência aos inibidores de microtúbulos [6].
A grande família de 50 proteínas diferentes cassete de ligação a ATP (ABC) (transportadores ABC) foram documentados para efluxo de moléculas citotóxicas, reduzir a concentração de droga intracelular [7, 8]. Entre os transportadores ABC associados com quimio-resistência de cancro do ovário, o
MDR1
gene, que codifica a P-glicoproteína (P-gp; MDR1, ABCB1), é o mecanismo mais estudada. Outros transportadores comuns ABC incluem: a MDR-associado da proteína 1 (MRP1, ABCC1) e da proteína de resistência do cancro da mama (BCRP, ABCG2) [2]. incubação curto prazo das células do cancro do ovário com regimes de quimioterapia (por exemplo doxorrubicina, cisplatina e paclitaxel) em suas concentrações clínicas [9] aumenta os níveis de expressão MDR1. Notavelmente, cancros do ovário recorrentes demonstram aumentou significativamente MDR1 em comparação com cancro do ovário primárias, com os pacientes recorrentes que recebem a terapia de platina-taxano como um padrão de cuidados após o diagnóstico de seu câncer primário [10]. Semelhante a MDR1, MRP1 é detectada em tumores ovarianos primários não tratados em diferentes níveis [11] e encontrou upregulated após uma indução gradual de resistência cisplatina em linhas celulares de cancro do ovário e
in vitro
[12]. BCRP é inducible em linhas celulares de cancro do ovário por incubação longo prazo com topotecano e confere resistência ao topotecano e mitoxanthrone [13, 14].
A ascite é um sintoma comum em fase III /IV pacientes com câncer de ovário e correlaciona-se com um mau prognóstico [15]. ascite maligna é conhecido por proteger as células de cancro do ovário humanos da apoptose induzida por TRAIL, levando a uma sobrevida livre de doença mais curto de pacientes [16, 17]. No entanto, pouco se sabe sobre a relação entre a presença de ascite e quimio-resistência no cancro do ovário. Neste estudo, investigamos como ascite afeta as células de câncer de ovário nas suas respostas ao paclitaxel e docetaxel, levando drogas taxanos empregadas pelos médicos no tratamento do câncer de ovário [3].
Materiais e Métodos
celular line e reagentes
ID8, uma linha de células de cancro do ovário do rato epitelial [18], foi um presente amável do Dr. Kathy Roby na Universidade de Kansas Medical Center. Mycoplasma rastreio contaminação utilizando Gen-Probe de hibridação de ácido nucleico foi realizado pelo Instituto do Cancro Duke Cell Culture Facility, em Abril de 2010. As células ID8 foram mantidas em DMEM (alto teor de glucose, Gibco-Life Technologies [Gibco]; Carlsbad, CA) contendo 4% fetal de soro de bovino, penicilina (100 unidades /ml) + estreptomicina (100 ug /mL) (Invitrogen-Life Technologies [Invitrogen]; Carlsbad, CA). HA1 e HA2 foram desenvolvidos por SV40 T antígeno-imortalização de células de cancro do ovário humanos obtidos a partir de ascite [linha HA1 derivada de ascite (6116) a partir de cirurgia primária carcinoma seroso, pouco diferenciado; HA2 linha derivada de ascite (OV 186) a partir de cirurgia primária seroso papilar cystadenocarinoma]. células TD foram desenvolvidos por SV40 imortalização de células de câncer de ovário humano de cirurgia primária de alto grau de tecido adenocarcinoma seroso (carcinoma peritoneal primário) (6114)]. Estas linhas celulares foram mantidas em DMEM (alto teor de glucose, Gibco) contendo soro fetal bovino a 10% e 1X penicilina estreptomicina. De-identificado amostras tumorais e ascite usados para criar as linhas celulares imortalizadas foram coletados, seguindo disposição do doador de consentimento informado por escrito, pelo tumor Duke Oncologia Ginecológica Bank (Pro00013710) e utilizado para este estudo sob o protocolo Duke IRB Pro00027325. O paclitaxel (T7191) e docetaxel (01885) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. linhas celulares de cancro do ovário humano foram mantidas para um máximo de duas passagens antes da análise.
preparação ascite Murino
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Care Use Committee da Universidade de Duke (número de protocolo: A295-12-11). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. foram usados; Feminino 6-8 semanas de idade C57BL 6 ratos /(Raleigh, NC Charles River). células ID8 (1-10×10
6) foram injectados no peritoneu do rato. Após a acumulação de ascite, os ratinhos foram sacrificados. fluido peritoneal foi recolhido e centrifugado duas vezes a 500 x g durante 5 minutos para separar as fracções celulares e acelulares. fracções acelulares de vários ratinhos foram reunidas e filtradas através de filtros estéreis de 0,22 um. As condições de tratamento ascite 50% foram normalizados para as condições de cultura normais no que respeita à FBS, glucose e concentrações de antibiótico.
análise citométrica de fluxo com Green Dye efluxo ID
As funções das proteínas de resistência a múltiplas drogas MDR1 , MRP e BCRP foram analisados por eFluxx-ID verde multirresistência Assay Kit (ENZ-51029-K100, Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, suspensões de células individuais por tripsina colhidas foram contados, números iguais de células (500.000 /condição) foram ressuspensas em meio completo contendo specificinhibitors ou suas combinações (ou DMSO como controlo de diluente) andincubated durante 10 min a 37 ° C. Fontes /concentrações finais dos inibidores são como se segue: Verapamil (inibidor de MDR1, Sigma V4629; 40? M); MK-571 (inibidor de MRP1; Sigma M7571; 100? M); Novobiocina (inibidor da BCRP; Sigma N1628; 200 uM). corante verde foi então adicionada e incubada a 37 ° C durante 40 min. As células foram lavadas uma vez em PBS antes da aquisição de dados de FACS utilizando um instrumento de goiaba Easycyte Plus (Millipore, Billerica, MA), 7-AAD foi usada para excluir as células mortas da análise. Os dados foram analisados usando o software FlowJo_V10 (Ashland, OR):
Cálculo do factor de actividade multirresistência
O fator de atividade multirresistência (MAF) para cada transportador, foi calculada utilizando as seguintes fórmulas:., Onde F representa a média geométrica da intensidade de fluorescência (GMFI), F
0 – sem inibidor, F
MDR1 – com inibidor de MDR1, F
MRP – com inibidor MRP, F
BCRP – com inibidor da BCRP
rodamina 123 retenção de ensaio
função de efluxo da droga foi determinada em células ID8 tratados e não tratados com ascite por rodamina 123 ensaios de retenção [18]. ID8 células obtido a partir de cultura normal, de 7 dias de cultura de pré-tratamento de ascites ou de ascite
In vivo
foram semeadas a 40000 células por poço em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. Estas células foram então incubadas com Rodamina 123 durante 30 min. As células de cada condição foram então lavadas com PBS e incubadas com meio regular durante 2,5 h. imagens fluorescentes foram tomadas em uma excitação λ = 485 nm e emissão λ = 530 nm usando BioTek Cytation3 Imager (Winooski, VT) a 0 min (após a remoção de corante e de lavagem PBS) e em 2,5 h horas após Rodamina 123 remoção. As experiências foram repetidas três vezes, independentemente,
em tempo real quantitativa de RT-PCR
O ARN total a partir de células foi extraído utilizando Qiagen RNeasy Micro kit de acordo com o protocolo do fabricante. (Qiagen; Valencia, CA) e tratada com ADNase isenta de ARNase para remover qualquer ADN genómico residual. cDNAs de cadeia simples foram sintetizados por incubação de ARN total (1 ug) com RNase H-transcriptase inversa (500 L), oligo (dT) 12-18 iniciador (100 nM), dNTP (1 mM), e inibidor de RNase ( 40 L) a 42 ° C durante 1 h num volume final de 20 ul. Kit de Transcrição First Strand cDNA Synthesis foi adquirido a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, IN). primers Q-PCR para rato
Abcc1
,
Abcb1a
,
Abcb1b
e
beta-actina
foram adquiridos de Origene (Rockville, MD). Quantitative PCR em tempo real foi realizada para comparar os níveis de cada amostra de ARN total de expressão. PCR em tempo real sobre o QPCR Sistema Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA) foi realizada na presença de 12,5 jil VeriQuest rápida SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (USB, Cleveland, OH) e o ADNc ul 2, e H
2O foi adicionado a um volume final de 25 ul. PCR em tempo real foi realizada com um passo de desnaturação inicial de 5 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 3 s a 95 ° C, 30 s a uma temperatura de recozimento a 60 ° C. Os produtos de PCR foram monitorizados em tempo real, através da medição do aumento da fluorescência causada pela ligação do corante SYBR Green I. A significância foi analisada utilizando o pacote de software Software MXPRO QPCR (Stratagene, La Jolla, CA).
Western blots
As células foram recolhidas utilizando tripsina-EDTA e lavadas com PBS. As células colhidas foram incubadas em tampão de lise total de (50 mM de Tris pH 7,5, 1% de SDS), mais de protease e fosfatase cocktail inibidor (Halt, Thermo Scientific). As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de BCA. quantidades equivalentes de proteína foram sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) e imunotransf. As membranas foram incubadas com os anticorpos primários seguintes, seguido por as espécies apropriadas de anticorpo secundário conjugado com IRDye-(Life Technologies, Carlsbad, CA): MDR1 (BIOSs; Cat # 1468R); MRP1 (Biorbyt Cat # ORB76148); BCRP (Biorbyt Cat # ORB10178); beta actina (Sigma Cat # SAB5500001). MDR1, MRP1, proteínas BCRP foram detectados utilizando o sistema de imageamento infravermelho Odyssey (LI-COR, Lincoln, NE). As bandas de proteína foram quantificados usando o software Image J. (NIH, Bethesda, MD), e foi calculada a razão relativa da proteína de interesse para controlo de carga beta actina.
Os ensaios de proliferação
As células foram semeadas a 2,5×10
3 células por poço em placas de 96 poços e deixou-se crescer durante a noite. As células foram lavadas uma vez com DMEM isento de soro. As células foram então incubadas com diferentes concentrações de paclitaxel ou docetaxel diluído em 200 ul de DMEM durante 24 h. As células tratadas com ascites ID8 ou células colhidas a partir de ascites ID8 receberam os tratamentos diluído em 200 ul de 50% de sobrenadante de ascites. Às 18 h, 0,5 ^ Ci [
3H] -timidina (Perkin-Elmer, Waltham, MA) foi adicionada a cada poço. Após 8 h, o meio foi removido e as células foram dissociadas em 10X tripsina-EDTA e recolhidas utilizando um microharvester de 12 canais (Skatron Instruments, Noruega). As amostras foram contadas num espectrofotómetro de cintilação líquida. Todas as condições foram em quadruplicado, e cada experimento repetido pelo menos duas vezes.
7-AAD coloração
células ID8 de diferentes pré-tratamentos foram semeadas a 4×10
4 células por poço e permitiu a crescer durante a noite em placas de 6 poços. Elas foram lavadas uma vez com DMEM isento de soro. As células foram então incubadas com diferentes concentrações de paclitaxel ou docetaxel diluído em 2 ml de DMEM durante 4 dias. Ascite tratada ID8 células ou células colhidas a partir de ascites ID8 recebeu os tratamentos diluído em 2 mL de sobrenadante de ascites 50%. No final dos tratamentos, as células foram colhidas por tripsinização e coradas com 7-AAD (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante seguido por análise num instrumento de goiaba Easycyte Plus (Millipore) e analisadas por software FlowJo_V10.
A análise estatística
visualização Graph, transformação de dados e análise estatística (bicaudal teste t não pareado ou dois sentidos – ANOVA) foram realizadas utilizando Prism (versão 5.0, GraphPad Software) e Microsoft Office Excel (versão 2010, a Microsoft ).
resultados
ascite aumenta ID8 resistência à quimioterapia célula
Nós testamos o efeito de ascite sobre a resistência de células de cancro do ovário ao paclitaxel, um primeiro agente quimioterapêutico linha. A comparação foi realizada entre 1) células ID8 crescidas em meio de cultura normal, 2) células ID8 isoladas de fresco a partir de fluido de ascites num modelo singeneico, e 3) células ID8 tratados durante 7 dias in
in vitro
com ascite derivado de sobrenadante camundongos ID8-rolamento. dose de quimioterapia foi optimizado para uma gama de atingir 0 a 95% de inibição de crescimento celular, tal como medido por [
3H] -timidina. Tanto as células ID8 tratados durante 7 dias com ascite sobrenadante e as células isoladas de fresco a partir de ID8 fluido de ascites foram mais resistentes ao paclitaxel do que as células ID8 cultivadas em meio normal, tal como medido por [
3H] -timidina ensaio de incorporação (Fig 1A). Para validar a hipótese de que a ascite unidades de células de cancro do ovário quimio-resistência, o próximo estudada a resposta das células do cancro do ovário (+/- tratamento de ascite) para outro reagente quimioterapêutico na família taxano (docetaxel). Notavelmente, células tratadas ID8 durante 7 dias com ascite sobrenadante, assim como as células isoladas de fresco a partir de ID8 fluido de ascites foram significativamente mais resistentes do que as células para o docetaxel ID8 de cultura normal (Fig 1B).
células de cancro do ovário murino ( ID8) a partir de três fontes diferentes foram estudados: 1) células ID8 de meio de cultura normal (meio), 2) células ID8 isoladas de fresco a partir de fluido de ascites num modelo singeneico (
In vivo
células), e 3) ID8 células tratadas durante 7 dias
in vitro
com sobrenadante ascite (ascite tratados 7 dias). Cada uma destas populações de células foi exposto ao paclitaxel (A) ou docetaxel (B) na concentração indicada durante 24 h e [
3H] -timidina foi determinada. Três experimentos independentes foram realizados e um resultado representativo é mostrado. barra de erro representa SD de quadruplicado em cada condição. * Indica p 0,05, *** p 0,001, ANOVA. A. Células ID8 pré-tratados com ascite acelulares para 7 dias (ascite tratados 7 dias) ou isolados a partir de ascite (
In vivo
células) aumentaram a resistência ao paclitaxel em comparação com células de ID8 meio normal. células B. ID8 pré-tratados com ascite acelulares para 7 dias (ascite tratados 7 dias) aumentaram a resistência ao docetaxel às 2 e 4 nM em comparação com células de ID8 de cultura normal. células ID8 isoladas de ascite (
in vivo
células) têm maior resistência à docetaxel em comparação com células ID8 de médio normal (Medium). CD. absorção de 7-AAD foi medida por análise de citometria de fluxo. A percentagem de células positivas para 7-AAD de três experiências independentes, é apresentada para o paclitaxel (C) e células tenha sido tratada com docetaxel (D). As barras de erro representam SD. * Indica P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, ANOVA de duas vias. ID8 células pré-tratadas com ascites acelulares durante 7 dias (ascite tratados 7 dias) são mais resistentes à morte celular induzida por quimioterapia (
i
.
E
., apresentam menos 7-AAD + células ) do que as células de ID8 de cultura normal.
Os dados acima indicam que aumentos de ascites de células de cancro do ovário quimio-resistência, tal como avaliado usando um [3H
] ensaio de incorporação de timidina, a qual é uma medida da proliferação celular. A seguir, procuraram determinar se ascite protege as células de cancro do ovário a partir de morte celular induzida por quimioterapia efectuando coloração com 7-AAD. Como mostrado na Fig 1C e 1D, células ID8 tratados durante 7 dias com ascite livres de células foram protegidos do paclitaxel e docetaxel- morte celular induzida, proporcionando mais provas de que ascite sobrenadante promove o cancro do ovário quimio-resistência.
a ascite impulsiona efluxo em células ID8
a seguir, analisaram a função de efluxo em células de câncer de ovário tratados com ascite utilizando dois ensaios de efluxo de drogas (efluxo ID corante verde e rodamina 123) [18]. O efluxo ID ensaio mede a intensidade da fluorescência verde após incubação de células com corante fluorescente. Figura 2A mostra a intensidade de fluorescência reduzida em ambos os ascite pré-tratados células ID8 e ID8 células isoladas a partir de ascite de rato (modelo singeneico) em comparação com intensidade de fluorescência em células não tratadas. Estes resultados sugerem que a ascite promove a função de efluxo em células de cancro do ovário. A seguir, mediu a retenção de corante rodamina 123 em células ID8 (+/- tratamento de ascites). Como mostrado na Fig 2B e 2C, 2,5 h após a remoção rodamina, as células não tratadas tinham retido ID8 corante. Em contraste, os níveis significativamente reduzidos de corante foram detectados em células pré-incubadas ID8 ascite, apoiando a conclusão de que as células do tumor ascitico-tratadas exibem aumento do efluxo. Juntos, estes resultados sugerem que mecanismos conduz ascite efluxo do cancro do ovário.
(A). função de efluxo foi medido por ensaio de corante verde de efluxo ID. ID8 células isoladas a partir de cultura normal, obtido após o tratamento de ascites de 7 dias, ou isolado a partir de ascite (
In vivo
células) foram incubadas com efluxo ID corante verde durante 40 minutos, permitindo que as células de absorção e efluxo este corante. ID8 células pré-tratadas com ascites retidos menos corante em comparação com células ID8 de cultura normal, indicando uma função de efluxo aumentado. (B). função de efluxo foi medido por ensaio de Rodamina 123. ID8 células obtido a partir de cultura normal, de 7 dias de cultura de pré-tratamento de ascites ou de ascite
In vivo
foram incubadas com Rodamina 123 durante 30 min. Em seguida, as células de cada condição foram lavadas com PBS e incubadas com meio regular durante 2,5 h. imagens fluorescentes foram retiradas aos 0 minutos (após a remoção de corante e lavagem com PBS) e a 2,5 h horas após a remoção rodamina 123. A quantificação da intensidade de fluorescência (menos o fundo) em cada grupo é mostrado em (C). Três experimentos independentes foram realizados e um resultado representativo é mostrado. barra de erro representa o desvio padrão de medição de intensidade fluorescente de cada célula em cada imagem. * Indica p . 0,05, teste t de Student
tratamento de ascite aumenta a expressão de múltiplas drogas transportadores relacionados com a resistência
Nós estudamos a expressão de três genes transportadores ABC (MDR1, MRP1 e BCRP) que são comumente envolvidos no câncer quimio-resistência. Foi realizada quantitativa PCR em tempo real (Q-PCR) no ARN colhido a partir de células ID8 e ID8 células pré-tratadas com ascites. células não tratadas ID8 expressa tanto MRP1 e mRNA BCRP (Fig 3A). Após o tratamento com ascite
In vitro
durante 7 dias, as células ID8 exibiram aumento significativo da expressão de MDR1a (118- vezes), MDR1b (75 vezes), e BCRP (17 vezes) (Figura 3A e 3B) .
O ARN total foi colhido a partir de células em cultura ID8 normal, bem como a partir de células ID8 pré-tratados com ascite durante 7 dias. Os níveis de expressão dos genes indicados (em relação ao beta-actina) foram determinadas por PCR em tempo real (A). Dobre o aumento na expressão gênica (ascite trataram células ID8 mais células ID8 normais) são mostrados na B. três experimentos independentes foram realizados e barra de erro representa SD. * Indica p 0,05 e *** p . 0.001, teste t de Student
Inibidores de multidroga transportadores relacionados com a resistência reduzir a eficiência de efluxo em células de câncer de ovário ascite associada
depois de demonstrar upregulated transportadores ABC relacionados-MDR na ascite tratadas células de cancro do ovário, o próximo procuraram determinar se os inibidores específicos destes transportadores de efluxo evitar nestas células. Foram estudados três inibidores dos transportadores MDR verapamil: (inibidor de MDR1), MK-571 (MRP1 /inibidor 2), e novobiocina (inibidor da BCRP). Em primeiro lugar, o inibidor efeitos sobre a função de efluxo em células ID8 cultivadas em meio normal foi avaliada. Os inibidores foram adicionados às células durante 10 minutos antes da adição de efluxo ID corante verde. Como mostrado na Fig 4A e 4B, apenas o inibidor de MRP1 aumento da intensidade de fluorescência de efluxo ID verde- células marcadas ID8. Estes resultados indicam que as células de cancro do ovário ID8 não tratados apoiar efluxo dependente de MRP1, mas não MDR1 ou efluxo dependente da BCRP. Em seguida, estudamos os efeitos destes inibidores sobre a função de efluxo em ambos os ascite trataram células ID8 e em células ID8 isolados directamente a partir de ascite (
in vivo
células). MDR1 inibidor não aumentou a fluorescência em células ID8 pré-incubadas com ascite por 7 dias
in vitro
. No entanto, MDR1 inibidor fez aumento de fluorescência em células ID8 isoladas de ascite
in vivo
(Fig 4A e 4B). A adição de um ou outro inibidor ou inibidor MRP1 BCRP aumentou significativamente a fluorescência (MAF) em ambas as células tratadas com ascites ID8 e em células de ascite (
In vivo
) (Figura 4B). Nós também demonstraram que as combinações destes inibidores não aumentou a intensidade de fluorescência de efluxo ID células ID8 verde-marcado ou células tratadas com ascites através da intensidade de fluorescência obtida com inibidores individuais, sugerindo que a actividade destes transportadores individuais não foi compensada por outros transportadores ( dados não mostrados). Colectivamente, estes dados sugerem que a ascite promove MRP1 e de efluxo dependente da BCRP em células de cancro do ovário ID8.
(A). ID8 células de cultura normal, ascite cultura de pré-tratamento, ou ascite (
In vivo
células) foram tratados com ou sem inibidores de segmentação MDR1, MRP1 ou BCRP durante 10 min e depois incubadas com o efluxo ID corante verde por 30 min. intensidade de fluorescência de cada condição foi medida por citometria de fluxo. Multidroga fator de atividade de resistência (MAF) foi calculada para cada amostra, e significa MAF (+/- SD de amostras em triplicado) é mostrado para cada condição em valores B. MAF caindo abaixo de fundo são indicadas por uma margem cinzenta. aumentos estatisticamente significativos na MAF entre tratados com ascite e
in vivo
ascite células (em comparação com células não tratadas) são indicados. As barras de erro representam desvios-padrão de três experiências independentes. * Indica p . 0,05, teste t de Student
células de cancro do ovário humanos obtidos a partir de ascite, mas não as células de cancro do ovário derivadas de tumores, exibem função de efluxo
Em seguida, procuramos para estender nossas descobertas para as células de cancro do ovário humanos. Estudamos imortalizado células de cancro do ovário humanos derivados de ascite de pacientes (HA1, células HA2) ou a partir do local do tumor primário (células TD). Utilizando o ensaio verde efluxo ID, que mostraram que as células HA1 e HA2 apresentaram efluxo mais elevado do que as células TD (Fig 5A e 5B), apoiando a nossa conclusão de que ascite impulsiona a função de efluxo de células de cancro do ovário. Western blot foi realizada para investigar a expressão da proteína de efluxo nestas células de cancro do ovário humano e derivada de tumor ascite-derivados. Como mostrado na Fig 5C, a expressão de MDR1, MRP1 e BCRP foi significativamente mais elevada em linhas de células do tumor ascitico-derivados (HA1, HA2) do que numa linha celular derivada do tumor primário (TD). Para determinar quais as proteínas de efluxo foram funcional nestas células, que próxima investigados os efeitos de inibidores de MDR no efluxo em células de cancro do ovário humano derivadas de tumor e derivadas de ascites. MRP1 e inibidores da BCRP, mas não um inibidor de MDR1, suprimiu o efluxo de corante em HA1 e HA2 células de forma significativa. Em contraste, os inibidores de MDR1, MRP1 e BCRP não teve impacto retenção de corante em células TD (Fig 5D e 5E). Mostrámos que as combinações destes inibidores não aumentou a intensidade de fluorescência de células TD (dados não mostrados), sugerindo que a actividade de transportadores individuais não foi compensada por outros transportadores. Estes resultados indicam células de cancro do ovário humanos derivados de ascite, mas as células derivadas de tumores primários não, apoiar ABC efluxo dependente do transportador.
A e B. Imortalizada células de cancro do ovário humanos derivados de ascite de pacientes (HA1 e HA2 células ) ou local do tumor primário (células TD) foram incubadas com o efluxo ID corante verde para 40 min. A intensidade da fluorescência para cada condição foi medida por citometria de fluxo. Histograma de cada linha celular de cancro derivadas a partir de ascites de pacientes (HA1 ou HA2; azul) é sobreposta com histograma da linha primária derivada de tumor (TD; vermelho)). B. intensidade de fluorescência média (IFM) foi calculada para cada linha a partir de três experiências independentes. Fold diminuição na intensidade de fluorescência média geométrica (GMFI) (em relação à linha derivada de tumor) foi calculada para cada linha de células em três experiências independentes. Os resultados são relatados como a diminuição de dobragem média de três ensaios independentes tratadas (+/- SD). C. Total de extractos celulares foram obtidos a partir de uma linha humana derivada de tumor primária de células de cancro do ovário (TD) e a partir de cada um dos dois ascite derivadas linhas celulares de cancro humano do ovário (HA1, HA2). quantidades equivalentes de proteínas extraídas foram sujeitos a SDS-PAGE e immunblotted com anticorpos específicos para MDR1, MRP1, BCRP, ou beta actina, seguido por as espécies apropriadas de anticorpo secundário conjugado com IRdye. As bandas proteicas foram detectadas por imagem de infravermelhos Odyssey. As bandas de proteína foram quantificados usando o software Image J. (NIH). Coeficientes de proteína indicada para beta actina são mostrados. D e E. A ascite-derivado e linhas de células humanas derivadas de tumor foram incubadas com ou sem inibidores de segmentação MDR1, MRP ou BCRP durante 10 min e, em seguida, incubadas com corante verde ID efluxo durante 30 min. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo. Os histogramas (+ inibidor vs – inibidor) foram sobrepostas para cada linha (D). E. Multidrug a actividade do factor de resistência (MAF) foi calculada para cada amostra, e significa MAF (+/- DP) de três experiências independentes, é apresentada para cada condição em valores E. MAF que caem abaixo de fundo são indicadas a cinzento. aumentos estatisticamente significativos na MAF entre tratados com ascite e
in vivo
ascite células (em comparação com células não tratadas) são indicados. * Indica P 0,05. ** Indica p . .01, T de Student
Discussão
células do cancro do ovário adquirir resistência a quimioterapia após a curto prazo [7] ou a longo prazo [12, 14] O tratamento com fármacos quimioterapêuticos. Ambos os ascite maligna [15] e quimio-resistência [19] têm sido associados com a sobrevivência reduzido de pacientes de cancro do ovário. Neste estudo, demonstramos que as células de câncer de ovário murino (ID8) apresentam aumento taxano quimio-resistência quando expostos a ascite
in vitro
ou
in vivo
(em comparação com células ID8 cultivadas em meio normal de ). Para nosso conhecimento, nosso trabalho é o primeiro a demonstrar diretamente inducible quimio-resistência por ascite sobrenadante.
Até o momento, nenhum estudo investigou a associação entre a presença de ascite [15] e transporte MDR [20-22 ], embora cada um é um fator de risco independente na previsão de mau prognóstico para pacientes com câncer de ovário. Estudos têm caracterizada a nível do transportador MDR em tecidos primários ou recorrentes do cancro do ovário [10] ou polimorfismo MDR1 e progressão do cancro do ovário ou sobrevivência [23] expressão. O nosso estudo é novo em sugerindo que ascite é capaz de dirigir a expressão e função de transportadores MDR.