Abstract
Introdução
Na maioria dos casos de cancros cervicais, DNA HPV é integrado no genoma de células de carcinoma. Esta inserção mutacional constitui um marcador molecular altamente específica de ADN do tumor para cada paciente. Circulating ADN do tumor (ctDNA) é um marcador emergente da dinâmica de tumor as quais a detecção exige motivo molecular específico. Para determinar se a sequência da junção célula-viral pode ser usada na prática clínica como um marcador específico da ctDNA, analisou-se uma série de soros de pacientes do cancro do colo do útero.
Métodos e Descobertas
Soro amostras de 16 pacientes com diagnóstico de HPV16 /18-cancro cervical associado, e para o qual o locus da integração virai tinha sido previamente localizada, foram analisados. amostras de soro sequenciais, tomados em momentos diferentes durante o curso da doença, foram também disponíveis para dois destes casos. ctDNA foi encontrado em 11 dos 13 pacientes com o tamanho do tumor maior do que 20 mm no momento do diagnóstico, e análise de amostras de soro sequenciais mostraram que a concentração ctDNA no soro pacientes estava relacionado à dinâmica de tumor.
Conclusões
Relata que o HPV inserção mutacional constitui um marcador molecular altamente específica de ctDNA em pacientes tumorais associadas ao HPV. Usando essa abordagem original, ctDNA foi detectada em doentes com cancro do colo do útero mais sobre a fase I e concentração ctDNA foi encontrado para refletir a carga tumoral. Em adição ao seu potencial valor prognóstico e preditivo, HPV inserção mutação é susceptível de constituir um novo substituto molecular da doença residual mínima e de recaída subclínica no tumor associado ao HPV. Isto é de grande importância na perspectiva da terapia anti-HPV específica
Citation:. Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordière A, et al. (2012) Papilomavírus Humano mutacional de Inclusão: marcador específico de circulação de DNA do tumor no colo do útero pacientes com câncer. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10.1371 /journal.pone.0043393
editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |
Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 20 de julho de 2012; Publicação: 24 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Campitelli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma parceria com La Maison Goyard e por uma generosa doação de Ms. A. Mauresmo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Este trabalho foi apoiado em parte pela parceria de La Maison Goyard, luggage- luxo maker, através do evento “Un Bagage despeje Curie”. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Os tipos específicos de papilomavírus humanos (HPV) são reconhecidos como o principal fator etiológico na cervical neoplasia [1]. Em lesões pré-invasivas, os genomas virais estão presentes como moléculas epissomais no núcleo de células infectadas. Na maior parte dos casos de carcinoma invasivo, no entanto, as sequências de DNA de HPV são integrados no genoma celular [2], [3], [4]. a integração do genoma viral representa, assim, um passo crucial na tumorigênese [5]. Um único local de integração virai única foi encontrada em mais de 80% dos cancros cervicais [6].
A clonalidade característica, especificidade e estabilidade ao longo do tempo de inserção do ADN do HPV no genoma de células de carcinoma constituem uma altamente específica marcador genético do ADN do tumor. Dados recentes têm mostrado que o ADN mutante pode ser detectada no sangue de pacientes com tumores e que a quantidade de ADN de tumor circulantes (ctDNA) foi relacionada com a dinâmica de tumores [7]. Isso abre grandes perspectivas para a utilização de ctDNA como um biomarcador de tumor em pacientes [8] cancerosas. No estágio do câncer do colo do útero avançado, vários estudos relataram evidências de circulação de DNA do HPV (c-HPV DNA) [9], [10], [11] ou circulando HPV RNA [12]. Estes estudos mostraram que era possível detectar ácidos nucleicos virais no sangue de pacientes com cancro do colo do útero, mas devido à falta de sensibilidade [10], [13], [14] e especificidade questionável [11], [13], o dados era de pouco impacto clínico. Neste contexto, foi elaborado um estudo para avaliar o valor de mutação de inserção do DNA do HPV como um marcador para a detecção e quantificação de ctDNA no momento do diagnóstico no soro de pacientes com câncer cervical invasivo. Também analisámos as variações de concentração ctDNA durante o curso da doença. Além disso, para comparar a sensibilidade do nosso ensaio original e específica para que, com base na detecção de sequências de DNA de HPV, que também procurou c-ADN de HPV utilizando iniciadores localizados no gene E7 de HPV16 /18.
Materiais e Métodos
os pacientes e tumores
a partir de uma série de HPV16 (14 casos) ou HPV18 (2 casos) carcinoma cervical acumulada entre 2001 e 2011, determinou-se o locus de inserção viral usando o DIPS- método de PCR [15]. Nos 16 casos, as amostras de soro recolhidas no momento do diagnóstico antes do tratamento estavam disponíveis. Em dois destes casos, as amostras de soro sequenciais adicionais tomadas durante o curso da doença foram também disponíveis. Quatorze tumores eram carcinoma escamoso e dois eram glandular. De acordo com a regulamentação francesa, todos os pacientes foram informados e não se opôs aos seus espécimes biológicos ser usado para pesquisa. A carga viral, em amostras de biopsia de tumor foi avaliada por PCR quantitativa (qPCR), utilizando iniciadores concebidos no gene E7 de HPV16 /18, como previamente descrito [6]. Uma vez que as sequências de ADN de HPV integradas podem apresentar amplificação no locus de inserção, do número de cópias de inserção mutacional foi também avaliada por qPCR utilizando os iniciadores e os reagentes fornecidos na Tabela S1.
KLK3
estado do gene foi tomado como referência duas cópias.
analisa soro de DNA
DNA foi isolado de 200 mL de soro com QIAamp Min Eluir Kit Virus rotação (Qiagen® , Courtaboeuf, França) seguindo as instruções do fabricante. O passo de eluição foi realizada com 25 ul de tampão fornecido. As concentrações de ADN isolados foram medidas utilizando um sistema de PCR quantitativa (qPCR-RT) em tempo real baseada em Long intercalados elementos de detecção nuclear (LINHA) sequência [16]. As diluições do ADN humano normal foram usadas como padrões e a PCR foi realizada em 25 ul com SYBR® mistura verde PCR Master (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, França), iniciadores de mistura (1? M) e 2 ul de ADN eluído com o seguindo as condições dos ciclos: 15 min a 95 ° C e 45 ciclos (15 s, 95 ° C; 15 s, 61 ° C; 1 min, 72 ° C), seguida por uma fase de dissociação (15 s, 95 ° C; 15 s , 60 ° C; 15 s, 95 ° C). ensaio de RT-qPCR utilizando Sybr®Green (Applied Biosystems) foi desenhado para amplificar especificamente sequências de ADN junção célula-vírus (fluido de DNA 2 pi) ou E7 de HPV16 ADN (ADN eluído 2 ul) com 400 nM de cada iniciador num volume final de 25 ul. Cada conjunto de iniciadores foi testado em diluições em série (a partir de 50 ng /ul de 0,5 pg /mL) de ADN de tumor correspondentes em Tris-EDTA-tampão com condições termociclador de 15 min a 95 ° C e 45 ciclos (15 s, 95 ° C ; 1 min, 62 ° C) seguido por uma fase de dissociação (15 s, 95 ° C; 1 min, 60 ° C; 15 s, 95 ° C). As sequências dos iniciadores e MgCl
2 as concentrações são dadas na Tabela S1. A sensibilidade do ensaio de PCR teve que ser igual ou superior a 5 pg /mL para validar os conjuntos de iniciadores. A fim de aumentar a sensibilidade da detecção, 10 repetições de ensaio de RT-qPCR foram realizados em cada amostra de soro para a detecção de ctDNA e de ADN-c de HPV. A quantidade de ctDNA em 200 ul de soro correspondeu à soma do ctDNA detectada em cada repetição positivo. A concentração de ctDNA foi finalmente expressa em cópias /ml de soro.
Resultados
Clinicamente, estágios FIGO eram de IB a IVA e um caso foi uma recaída pélvica do SCC cervical (Tabela 1). O tamanho do tumor variou de 10 a 120 mm. Os valores disponíveis antígeno carcinoma espinocelular (CEC) variou de 1,1 ng /ml a 17,4 ng /ml (limite de positividade: 1,5 ng /ml). DNA de HPV foi integrado em loci diferentes (Tabela 1). A carga viral em amostras de tumor variou de 0,5 a 160 genomas HPV16 por célula (0,8 10
6 a 24 10
6 HPV16 cópias /ug de ADN). A concentração de circulação de ADN do hospedeiro variou de 6 a 10
1-77 10
3 cópias /ml de soro (Tabela 1). Fomos capazes de detectar ctDNA em 11 dos 16 pacientes com diagnóstico de câncer cervical invasivo. Três casos negativos correspondeu ao carcinoma de fase precoce (Ib) com um tamanho variando de 10 a 20 mm (Tabela 1). A concentração de soro de ctDNA variou de 5 a 890 cópias /ml de soro, o que representa 0,01% a 25% de circulação de ADN do hospedeiro. DNA c-HPV foi detectado em 13/16 casos, os três casos precoces restante negativo. Os valores variaram 5-8,5 10
3 cópias /ml de soro (Tabela 1). Os três valores mais elevados (8.5, 3.5 e 3.4 10
3 cópias /ml) corresponderam a casos com elevada carga viral em amostras de biopsia do tumor, o que sugere que o DNA derivado de moléculas epissomais também foi detectado pelo ensaio.
dinâmica ctDNA foram analisadas amostras de soro sequenciais em dois pacientes. O primeiro paciente recebeu chemoradiotherapy combinados seguido de braquiterapia utero-vaginal e cirurgia (Figura 1, caso n ° 6). O valor ctDNA diminuíram durante o tratamento e era nulo no final da terapia em que se introduz uma resposta histológica completa foi observada na amostra de histerectomia. Dois meses depois, o paciente desenvolveu uma metástase hepática 8 mm e ctDNA tornou-se detectável novamente. aumento dos níveis de ctDNA foram encontrados mais tarde, quando o paciente desenvolveu recorrência nó abdominal. A mesma dinâmica foi observada no segundo paciente tratado exclusivamente com quimioradioterapia (Figura 1, caso n ° 13). De interesse durante o follow-up, enquanto a ressonância magnética pélvica mostrou nenhuma modificação significativa, foi observado um aumento de ctDNA. Logo depois, o paciente apresentou uma recaída abdominal associada com altos níveis de ctDNA. Os mesmos foram observados dinâmica com ADN-c de HPV.
Discussão
Relatamos aqui que, através de mutação integração de HPV como um marcador molecular, ctDNA poderia ser detectado no soro de mais pacientes com diagnóstico de carcinoma cervical invasivo ao longo estágio Ib e que a quantidade de ctDNA refletido dinâmica tumorais. Uma vez que o local de integração virai é único para cada paciente, este marcador é altamente específica, muito mais do que o marcador de SSC [17]. Em relação à sensibilidade, poderíamos detectar ctDNA em 11 out 13 (85%) pacientes com tumores estágio II-IV, uma taxa de grande parte maior do que os 12% [9], 18% [13], 20% [14] e 50% [ ,,,0],11] de positividade relatados até agora para o ADN de C-HPV. A prática de 10 réplicas para a detecção de ctDNA em cada amostra de soro pode contribuir para o aumento da sensibilidade do nosso ensaio. Por exemplo, na maior parte dos nossos casos positivos, menos de 50% das réplicas fornecida evidência de ctDNA. No entanto, em 2 dos 13 casos com um tamanho do tumor 20 mM, não foi encontrado ctDNA Considerando C-HPV foi detectado ADN. Ambos os casos corresponderam a tumores com carga de inserção HPV baixa (≤1 copy /célula). Em contraste, células de carcinoma cervical frequentemente abrigam os genomas de HPV livres que também são libertados na circulação geral, aumentando assim a taxa de detecção de ADN virai em circulação. No entanto, este ativo pode ser equilibrado por um risco de falsos positivos. Por exemplo, os ensaios baseados na detecção de ADN de HPV fornecida taxas de falsos positivos de 13,5% em indivíduos normais e 33% em pacientes CIN3 [11]. Além disso, também foram relatadas frequentes discrepâncias entre genótipos de HPV encontrado no cancro do colo do útero e no soro dos mesmos pacientes [13]. Estas dificuldades devem ser superadas por controlos adequados de especificidade e, para fins clínicos, análise c-HPV DNA podem representar uma alternativa útil, onde a identificação ou o uso de sequências de junção de células viral é difícil.
Análise dos sequencial amostras de soro mostrou a dinâmica dos resultados: a concentração de ctDNA diminuiu sob tratamento e aumento no tempo de recidiva. A positividade de ctDNA precedida recidiva radiológica, num caso, e foi associado com uma metástase do fígado 8 mm de um outro. DNA do tumor pode ser mais facilmente liberado do tecido do tumor correspondente a recaída ou metástase do que a lesão primária. Ele também pode derivar a partir de células tumorais circulantes. Um marcador molecular específica e quantitativa de ctDNA podem ser usadas para seguir o curso do cancro do colo do útero. Durante o tratamento inicial, ctDNA pode ajudar a avaliar o prognóstico da doença e a sensibilidade do tumor para a terapia. Estudos prospectivos maiores serão necessários para validar este utilitário. Durante o acompanhamento, a concentração ctDNA poderia ser um marcador substituto altamente específico da doença residual mínima e recaída subclínica. Isto é de grande importância na perspectiva da terapia anti-HPV específica [18], cuja eficiência potencial é em grande parte dependente da massa do tumor. Estas abordagens poderiam ser facilmente estendido para outros tipos de tumores associados ao HPV, canal anal e carcinoma de cabeça e pescoço, por exemplo. A localização do local de integração do HPV não é actualmente apreciada na prática clínica. Novas tecnologias, como Next Generation Sequencing [19], no entanto, deverá facilitar esta determinação e fornecer caracterização molecular ideal de tumores para personalizar o tratamento dos pacientes. Além disso, a sensibilidade da detecção de ctDNA pode ser facilmente aumentada, simplesmente através da análise de uma quantidade maior de soro e /ou aumentando a eficiência da técnica de PCR, por exemplo, utilizando digitais de PCR [20] avanços .Estes irá facilitar a avaliação do uso de ctDNA em oncologia clínica e irá melhorar o biológico seguimento dos pacientes tratados com câncer cervical.
Informações de Apoio
Tabela S1. sequências
Primers e reagentes para a detecção de CT-ADN.
doi: 10.1371 /journal.pone.0043393.s001
(DOC)
Reconhecimentos
Agradecemos Sr. F Radvanyi para discussões frutíferas e Ms A. Le Cunff e Z. Maciorowski por sua ajuda na preparação do manuscrito.