Abstract

Fundo

A hipoxia em cancros resulta na regulação positiva de hipóxia fator inducible 1 (HIF-1) e um microRNA, hsa-miR-210 (miR-210), que é associado a um mau prognóstico.

métodos e resultados

Em linhas de células humanas de câncer e tumores, descobrimos que miR-210 alvos do ISCU ferro de enxofre proteínas scaffold mitocondrial, necessárias para a montagem de ferro- clusters de enxofre, cofatores para as enzimas-chave envolvidos no ciclo de Krebs, de transporte de elétrons, e metabolismo do ferro. regulação negativa de ISCU era a principal causa da indução de espécies de oxigénio reactivas (ROS) em hipoxia. supressão ISCU reduzida mitocondrial Actividade e aconitase complexo 1, causou uma mudança para a glicólise em normoxia e sobrevivência celular aumentada. Cancros com baixa ISCU tiveram um prognóstico pior.

Conclusões

A indução destas importantes características do show de câncer que um único microRNA, miR-210, medeia um novo mecanismo de adaptação à hipóxia, regulando função mitocondrial através do metabolismo centros ferro-enxofre e geração de radicais livres

Citation:. Favaro e, Ramachandran A, McCormick R, Gee H, branqueamento C, Crosby M, et al. (2010) MicroRNA-210 Regula mitocondrial Free Radical resposta à hipoxia e Ciclo de Krebs em células cancerosas por Segmentação Ferro ISCU Enxofre Protein Cluster. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10.1371 /journal.pone.0010345

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago (UIC), Estados Unidos da América

Recebido: 16 de dezembro de 2009; Aceito: 29 de março de 2010; Publicação: 26 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Favaro et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Cancer Research Reino Unido e Amigos do Fundo Kennington Cancer Research (EF, ALH, JL), The Wellcome Trust (CB1, CC, IR), Royal College of Surgeons Urologia Fundação Britânica (CB2, RMCC), União Europeia, ACGT (FB), Rhodes Scholarship (HG), Nuffield Medical Fellowship (AR), FIRC Studentship (EF). Biobanking suportado pelo NIHR Biomedical Research Centre Oxford; Fundação Elsa Pardee (MI), da American Cancer Society (MC, MI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hipoxia é uma grande diferença fisiológica entre tumores e tecidos normais, geradas principalmente pelo crescimento do tumor com uma irrigação sanguínea adequada e consumo de oxigênio pelas células tumorais [revisto em [1]]. Hipóxia induz uma resposta complexa transcricional principalmente através da indução de hipóxia fator inducible 1α (HIF1α), afetando muitos processos biológicos, tais como a via glicolítica, angiogênese, regulação do pH, invasão e imortalização [2].

Um paradigma emergente na hipóxia é que as mitocôndrias produzem espécies reativas de oxigênio, mediada por continuar em hipoxia [3] transporte de elétrons. Esta via radicais livres contribui para a sobre-regulação de HIF [4] e do crescimento in vivo aumentada [5], mas podem também ser tóxicos. Uma variedade de vias induzidas por HIF já sido relatado para proteger do último efeito, por exemplo, a indução de piruvato desidrogenase cinase inibe o complexo enzima de desidrogenase de piruvato e bloqueando a conversão do piruvato em acetil-coenzima A, o primeiro passo no ciclo de Krebs [6] e aumenta a produção de lactato [7]. Mitophagy pode ser induzida pela BNIP3 proteína do domínio BH3, [8], e citocromo C oxidase subunidades podem mudar para outros mais eficientes [9].

Recentemente microRNAs (miRs), que são pequenos (± 22 nt) Os ARN que regulam a expressão do gene de pós-transcricional, bloqueando a tradução de mRNAs alvo ou acelerando a sua degradação [10], de não codificação [11], têm sido relatados para ser induzida por hipoxia. No entanto, alguns de seus alvos ou mecanismos de ação são conhecidos [revisto em [12]]. Nós e outros [13] demonstraram miR-210 é robusta induzida por hipoxia em muitas linhas celulares, através de HIF1α [14]. Nós recentemente analisada a sua expressão em uma série de 216 pacientes com câncer de mama e mostraram expressão de miR-210 foi correlacionada com muitos alvos HIF1α a nível mRNA (medidos por um metagene hipóxia) e foi fortemente associados a menor sobrevida do paciente. Derivada apenas de algoritmos baseados em seqüência, algumas das metas previamente validados de miR-210 incluem Ephrin A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], e MNT [19]. Nós combinamos algoritmos publicamente disponíveis, com os nossos conjuntos de dados conjunto de genes, para prever potenciais alvos de miR de importância em células cancerosas. Descobrimos que o homólogo centro de ferro-enxofre mitocondrial ISCU foi o maior alvo previsto para miR-210. Recentemente, ISCU tem sido identificada como um alvo de miR-210, também em células endoteliais pulmonares normais [20], em que contribui para o efeito de Pasteur e controla o nível de produção de ROS em hipóxia, o que sugere o seu potencial papel adaptativo a hipoxia no contexto de endotélio pulmonar.

centro de ferro-enxofre [Fe-S] estão presentes nos sítios ativos de muitas enzimas e proteínas, fundamental para a sua actividade e capaz de conferir regulação pelo estado redox [21]. Estes aglomerados são montados na mitocôndria [22] por uma série complexa de chaperonas e enzimas incluindo ISCU, depois exportados para o citoplasma, onde são montados na proteína relevante [23]. Entre as proteínas de cluster Fe-S envolvidos vários que compreendem componentes-chave do complexo I, II e III na mitocôndria, e componentes do ciclo de Krebs tais como succinato desidrogenase e aconitase. A forma citoplasmática da última regula o metabolismo do ferro através de sua função como um translacional regulador de IRP1 [24].

Neste relatório nós mostramos os principais efeitos biológicos de miR-210 segmentação ISCU, todos os quais são susceptíveis de contribuir para fenótipos importantes no cancro. Por downregulating ISCU, miR-210 diminui a atividade da enzima ciclo de Krebs e função mitocondrial, fornece um importante mecanismo para o aumento da geração de radicais livres em hipóxia, aumenta a sobrevivência das células em hipóxia, induz uma mudança para a glicólise em normóxia e hipóxia (efeitos Warburg e Pasteur) e sobre-regulação da absorção de ferro necessário para o crescimento celular. Mais importante, a análise de mais de 900 doentes com diferentes tipos de tumores mostrou que a supressão da ISCU está fortemente correlacionada com um prognóstico pior. Este estudo revela, assim, um novo caminho activado em tumores hipóxicos, mediadas por miR-210 que afetam a atividade da enzima mitocondrial e geração de radicais livres e destaca a importância do metabolismo mitocondrial em biologia hipoxia [3].

Resultados

Seleção de ISCU como um alvo potencial

Nós comparamos miR-210 expressão em nossa série publicada de câncer de mama [14] com a nossa metagene hipóxia de mRNAs cluster [25] e avaliação combinada com algoritmos de previsão alvo mostrou ISCU foi o maior destino previsto, e de três genes-alvo conhecidos também sentados em posições altamente classificados foram selecionados por esta abordagem (Apoio material e Métodos S1, Apoio Tabela S1).

miR-210 e mRNA ISCU submeter a regulação recíproca

de acordo com publicações anteriores [13], [14], miR-210 foi robustamente induzida em MCF7 e HCT116 por hipoxia (1% ou 0,1% de oxigénio) às 24 e 48 horas, a indução máxima observada em 48 horas em 0,1% de oxigénio (Figura 1A e Apoio Figura S1A). ISCU ARNm quantificado por RT-PCR foi inversamente correlacionada com miR-210 e diminuiu significativamente maior quando as células foram expostas a hipoxia grave mais por períodos mais longos (Figura 1B e apoiando Figura S1B). Semelhante à regulação do miR-210 em condições de hipoxia, supressão ISCU no nível de transcrição era dependente HIF1α e não HIF2α (Figuras Apoio S1C e S1D). Além disso, o fenômeno da regulação recíproca de miR-210 e ISCU por hipóxia também foi encontrada em muitas outras linhas celulares (apoiando Figuras s1e e S1F).

A

, miR-210 aumenta sob hipoxia, com a indução mais robusta visto em 48 horas com 0,1% de oxigénio.

B

, sob as mesmas condições, a regulação negativa mais forte de ARNm ISCU é observada às 48 horas com 0,1% de oxigénio. Os níveis de expressão de miR-210 e ARNm ISCU sob hipóxia são em relação aos seus níveis de expressão de normóxia às 24 horas (N). Média ± S.E.M. de três experiências independentes são apresentados (* P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001).

C

, transfecção de anti-210 resgata parcialmente a supressão hipóxica de mRNA ISCU e mímica-210 superexpressão diminui mRNA ISCU em normoxia às 48 horas. A expressão de mRNA ISCU é relativo ao anti-ctrl em normoxia (N). Média ± S.E.M. de três experiências independentes são apresentados (** P 0,01, *** p 0,001).

D

, (

painel superior

) proteína ISCU é regulada negativamente em lisados ​​de MCF7 em 0,1% de oxigênio em comparação com lisados ​​norm�icas (N) quando o anti-ctrl é transfectadas durante 48 horas. Esta diminuição no nível de proteína em condições de hipóxia é parcialmente resgatado quando o anti-210 �transfectada. Em condições de normóxia, mímica-210 suprime os níveis de proteína ISCU comparação com células transfectadas mímica-ctrl.

D

, (

painel inferior

), a quantificação do resgate do nível de proteína ISCU mediante transfecção de anti-210. A transfecção de anti-210 resgata os níveis de proteína em ISCU MCF7 em aproximadamente 40%. A média ± S.E.M de dois experimentos independentes é mostrado. (* P 0,05).

Mimic-210 suprimiu ISCU em normoxia e anti-210 inverteu a supressão em hipóxia

Nós recapitulou a indução hipóxica observada de miR-210 por transfecção MCF7 e HCT116 com mímica-210 em normoxia. Mimic-210 suprimiram os níveis de mRNA ISCU em aproximadamente 60% (Figura 1C e Figura Apoiando S2A). Em seguida, antagonizou miR-210 induzida sob condições de hipóxia com anti-210. A inibição da endógena miR-210 resgatado significativamente a supressão de ARNm ISCU, embora isto não estava completa (Figura 1C e Figura Apoiando S2A).

ISCU tem duas principais isoformas de splicing alternativo. ISCU1 tem uma sequência N-terminal alternativo e está localizada no citosol, enquanto ISCU2 está associada com as mitocôndrias. Para confirmar a especificidade do anticorpo utilizada nestes estudos, as células MCF-7 foram tratadas com ARNsi contra ISCU. A banda detectada nas células de controlo foi completamente suprimida por transfecção com siISCU1 e siISCU3 (Apoiando Figura S2B). As duas isoformas de ISCU não distinguiam-se por Western blotting de lisados ​​de células inteiras por causa da diferença menor em peso molecular. No entanto, a banda imunorreactiva foi detectada tanto na citosólica e frações mitocondriais (apoiando Figura S2C). Esta banda é referida como proteína ISCU e o seu peso molecular é compatível com os resultados de Tong et. ai. [23].

De acordo com hipóxia, as células MCF-7 e HCT116 mostrou uma redução na proteína ISCU, e este foi replicado com mímica-210 em normoxia (Figura 1D e Apoio Figura S2D). Além disso, anti-210 inverteu parcialmente a supressão hipóxica de proteína ISCU (Figura 1D e Apoiando Figura S2D). Hipóxia reprimidas fortemente um repórter luciferase contendo o 3’UTR de ISCU que incluiu o miR-210 local alvo putativa e esta supressão poderia ser parcialmente resgatado por transfecção transitória de anti-210 (Apoio Figura S2E). Além disso, mímica-210 suprimiu significativamente a actividade de luciferase em comparação com o controlo em células MCF7 normóxicas (suportando Figura S2E). Finalmente, enquanto ARNsi contra ISCU levou a uma regulação negativa de ambos ISCU endógeno e exógeno um etiquetado ISCU falta 3’UTR, mímica-210 downregulation mediada apenas se observou na proteína ISCU endógena (Figura Apoiando S2F). Em conjunto, estas observações demonstram que miR-210 regula negativamente mRNA ISCU e os níveis de proteína, visando a sua 3’UTR.

Efeitos de ISCU regulação baixa em proteínas Fe-S

Um efeito esperado da regulação negativa da ISCU seria uma redução da prestação de Fe-S para alvejar proteínas. Portanto analisamos o impacto de ISCU repressão sobre duas enzimas que necessitam de Fe-S para as suas actividades, aconitase e complexo mitocondrial I ARNsi contra ISCU aconitase actividade significativamente reduzida em células MCF7 e de células HCT116, em comparação com células de controlo em normoxia (Figura 2A). Uma diminuição semelhante na actividade aconitase foi evidente em ambas as linhas celulares por transfecção de imitador-210 (Figura 2A). No entanto não houve nenhuma alteração nos níveis de proteína Aconitase como avaliado por Western blot (Figura Apoiando S3A). Aconitase esgotado de Fe-S age como o translacional regulador de IRP1, para aumentar a absorção de ferro. Encontramos a-210 mímico aumento da captação de ferro nas células HCT116 (Apoio Figura S3B). Há também uma inibição clara da actividade do complexo I mitocondrial induzida por mímico-210, nas duas linhas de células (Figura 2B). Em ambas as linhas celulares houve regulação para baixo de actividade por hipoxia, a um nível semelhante ao induzido por mímico-210 ou por esgotamento ISCU. Além disso, a transfecção de anti-210 em células MCF7 foi capaz de aumentar significativamente a actividade aconitase em hipoxia (Figura 2C).

Células transfectadas com ARNsi contra ISCU ou com mímico-210 mostram uma diminuição significativa na actividade do aconitase proteína Fe-S (

a

) e complexo I (

B

) às 48 horas. A actividade é expressa em relação ao scr para siISCU3 ou para imitar-ctrl para imitar-210. Média ± S.E.M. de três experiências independentes são apresentados (* P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001).

C

, hipóxia diminui aconitase e atividade do complexo I em MCF7 e HCT116. A actividade é expressa em relação à normoxia (N). Transfecção de MCF7 com anti-210 aumenta o nível de actividade aconitase, em comparação com anti-Ctrl. Média ± S.E.M. de três experiências independentes são apresentados (* P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001).

D

, em normoxia, MCF7 transfectadas com mímico-210 tem um aumento da concentração de lactato segregada e uma redução do piruvato extracelular após 48 horas. Lactato: piruvato rácio mostra um aumento significativo nas mesmas condições. A transfecção com anticorpos anti-210 em hipoxia reduziu a produção de lactato em comparação com células transfectadas anti-ctrl. Média ± S.E.M. de três réplicas biológicas é mostrado (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Como a diminuição da aconitase e da actividade do complexo I reduz o ciclo de Krebs e mitocondrial função que investigou se havia uma mudança para a glicólise e produção de lactato. Os nossos resultados mostraram uma redução altamente significativa de piruvato e aumento de lactato em normoxia com o imitador-210, com um aumento do rácio de piruvato lactato. Houve também uma diminuição na produção de lactato com o anti-210 em hipóxia (Figura 2D).

Efeitos de ISCU regulação negativa sobre a produção de radicais livres

A perda de Fe-S do complexo I é susceptível de afectar o transporte de elétrons na cadeia de transporte de elétrons e impacto sobre a produção de radicais livres. Por isso, mediu a produção de superóxido em células MCF7 e de células HCT116. Em normoxia, ambas as linhas de células mostraram um aumento acentuado na produção de radicais livres por transfecção de imitador-210 em comparação com imitar-controlo (Figura 3A).

Um

, em normoxia, transfecção de imitador -210 aumenta significativamente a produção de superóxido em 48 horas, conforme medido por coloração com MitoSox. Imagens representativas de-210 imitam células transfectadas são mostrados nos painéis de topo e a média ± S.E.M. de cerca de 300 células estão apresentados nos painéis de fundo (***, p 0,001).

B

, exposição de células a 0,1% de oxigénio durante 48 horas aumenta a produção de superóxido; este efeito é quase completamente revertidas após a transfecção de anti-210. Imagens representativas de miR-210 transfectadas são mostrados nos painéis esquerdo e a média ± S.E.M. de cerca de 300 células são mostrados nos painéis da direita (***, p 0,001).

C

, a produção de ROS induzidos por mímico-210 é inibida em células MCF7 por cotrasfection com o plasmídeo que expressa ISCU2. Média ± S.E.M. de cerca de 300 células é mostrada (*** p 0,001). Bares = 10 mm.

Em hipóxia observamos um aumento muito significativo na produção de superóxido, que foi quase completamente invertida pelo anti-210 (Figura 3B). Além disso, a transfecção da construção ISCU2 invertida quase completamente o radical livre induzida por miR-210 (Figura 3C). Isto demonstra um novo e importante mecanismo de regulação da ROS em hipóxia, e que não é um efeito passivo de disponibilidade de oxigênio reduzida.

Efeitos de miR-210 na apoptose e sobrevivência em normóxia e hipóxia

estudos anteriores em leveduras demonstraram as consequências letais do homólogos eliminação ISCU [23]. Esta noção nos levou a investigar os efeitos de miR-210 em apoptose em normóxia e hipóxia. Houve uma notável diferença nos efeitos do mir-210 nestas condições opostas. Em normoxia, mímica-210 aumentou significativamente a apoptose como medida por coloração de anexina V, mas em hipóxia, o antagonismo de miR-210 aumentou a apoptose (Figura 4A).

Um

, apoptose (anexina V + células) foi medido em MCF7 (

esquerdo) e HCT116 (

direito

) células tratadas com miR-210 inibidor ou imitar, após 48 horas de exposição a 0,1% de oxigénio ou normoxia. Média ± S.E.M. é representativa de 3 experiências independentes (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

B

, após a transfecção de células MCF7 com LNA mexidos ou miR-210 LNA e expostas a 0,1% de oxigénio ou normoxia (48 horas), as células foram re-plaqueadas (100 e 500 células /poço). Após uma incubação de 12 dias, as colónias foram fixadas, coradas e as fracções sobreviventes foram calculados com base na eficiência de plaqueamento.

C

, fracções sobreviventes foram calculados como em (

B

) em células HeLa, que foram transfectadas com anti-ctrl ou anti-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, EUA) e expostas a 0,01% de oxigénio ou de normóxia. Em todos os ensaios de colónias, a média ± S.E.M. é representativa de 2 experiências independentes realizadas em triplicado empregando 2 densidades diferentes do chapeamento. (** P 0,01, *** p 0,001).

D

, RT-PCR para ISCU e miR-210 em xenoenxertos U87 tratados com a terapia anti-angiogénica (bevacizumab). A expressão relativa de ISCU normalizada para p-actina, miR-210 normalizado para três pequenos controles de nucléolo, RNU43, RNU44 e RNU48. A média da expressão ± S.E.M. em 4 animais /grupo é mostrado (** p 0,01, *** p 0,001).

Para avaliar os efeitos de miR-210 sobre a proliferação de células em condições hipóxicas, utilizou-se um ensaio clonogénico com um antagonista de ácido nucléico bloqueado (LNA) molécula de miR-210 (Figura 4B). Embora a maior parte da redução da clonogenicidade em hipoxia é claramente através de outros mecanismos, os efeitos do anti-210 resultou numa diminuição da sobrevivência clonogénica em hipóxia, o que foi igualmente encontrado numa linha celular mais hipóxia-resistentes, células HeLa (Figura 4C).

em supressão vivo de ISCU por hipóxia e significado clínico de expressão ISCU

Nós investigamos se a expressão da expressão do gene ISCU foi regulada in vivo, através do estudo de xenoenxertos de tumores humanos. Os xenoenxertos da linha celular de glioblastoma U87 foram tratadas com o inibidor de VEGF Avastin (bevacizumab), ou com veículo de controlo. A imunohistoquímica destes tumores demonstraram necrose induzida por Avastin, expressão de HIF1α e a HIF genes alvo CA9 e VEGF (dados não mostrados). Analisamos o mRNA a partir dos tumores e descobriu regulação positiva acentuada de miR-210 e downregulation recíproca de ISCU mRNA (Figura 4D).

Os únicos dados disponíveis para comparação de miR-210 com ISCU RNA em amostras de tumores humanos é do nosso peito e cabeça e pescoço série. Houve uma relação inversa altamente significativo de miR-210 a ISCU expressão em 216 pacientes com câncer de mama (rho = -0,39, p 0,001) (Figura 5A,

esquerdo

). Houve uma correlação inversa altamente significativo de ISCU com tumores mais agressivos de alto grau (p = 0,008) e um pobre recaída sobrevida livre (Figura 5A,

direita). Em uma análise multivariada, ISCU permaneceu significativa (p = 0,028), juntamente com nós, o grau ea idade (Apoio Tabela S2). Em 2 outras séries de câncer de mama (Roterdão [26], 286 casos: Uppsala [27]; 235 casos) baixa ISCU foi um factor de mau prognóstico na análise multivariada (Armários S3 e S4) (p = 0,038 e 0,015, respectivamente). Na série Uppsala [27] pode-se avaliar o precursor de miR-210 utilizando as sondas de Affymetrix (Affymetrix U133b, 230710_at) e esta também mostrou uma relação inversa do precursor para ISCU pobre e sobrevivência (Figura 5B). Em nossa série câncer de cabeça e pescoço [25], houve uma relação inversa dessas variáveis ​​(Figura 5C,

esquerdo

). Em uma série com publicada acompanhamento, Chung et al [28], houve uma forte associação de ISCU suprimida com mau resultado (Figura 5C,

direita). Análise de expressão em tecidos normais versus tecidos tumorais em conjuntos de dados 9 tumorais usando Oncomine mostrou em todos os estudos de supressão em comparação com tecidos normais (apoiando Figura S4).

A

, expressão de miR-210 qPCR (DDCT) traçada em função da expressão de mRNA ISCU (matrizes Illumina) na série do cancro da mama Oxford (

esquerda), e, a sobrevida livre de recidiva para amostras com alta ISCU e low split ISCU por mediano no Oxford série do cancro da mama (

direito

).

B

, a expressão do mRNA do transcrito que hospeda o precursor de miR-210 representada graficamente como uma função da medida da expressão de ARNm ISCU pela Affymetrix U133b e U133a respectivamente na série do cancro da mama Uppsala (

esquerdo

), ea sobrevida livre de recidiva para amostras com alta e baixa ISCU ISCU dividido pela mediana na série cancro da mama Uppsala (

direito

).

C

, expressão de miR-210 qPCR (DDCT) traçada em função da expressão de mRNA ISCU (matrizes Affymetrix) na série câncer de Oxford-Manchester HNSCC onde ISCU foi inicialmente encontrado para ser associado à hipóxia (

esquerdo), ea sobrevida livre de recidiva para amostras com alta e baixa ISCU ISCU dividido pelo valor mediano no Chung et al. série HNSCC (

direito

).

Discussão

Os nossos estudos mostram claramente miR-210 regula a expressão de ISCU RNA e proteína usando o mímico em normoxia em câncer linhas de celular. ISCU mRNA e proteína foram suprimidas sob hipóxia e este efeito foi significativamente revertida pelo anti-210. A inversão incompleta implica outros mecanismos estão também envolvidas na regulação negativa ISCU e é bem reconhecido que a tradução de RNA é reduzida pela hipóxia através da resposta proteína desdobrada [29].

Uma diminuição na ISCU prejudicaria a capacidade das células para gerar agrupamentos de Fe-S e, subsequentemente, ter impacto sobre a actividade das enzimas que requerem estas porções co-factor. Nós mostramos que aconitase, uma enzima chave do metabolismo intermediário que requer agrupamentos Fe-S, havia diminuição da atividade após a redução ISCU. De relevância específica para o câncer é o duplo papel de aconitase como IRP1 quando ela não tem o seu cluster de Fe-S. IRP1 regula a estabilidade e tradução do mRNA de transferrina e ferritina [24]. Os efeitos de perda de aconitase seria a de modificar o metabolismo do ferro e aumentar a sua absorção, o que é crítico para o crescimento do tumor. De fato, observou-se uma acumulação de ferro intracelular sobre a transfecção de células com mímica-210 ou siISCU.

As mutações em ISCU dão origem a acidose láctica em indivíduos após o exercício moderado, que fornecem fortes evidências para a importância desta meta em a manutenção da actividade do ciclo de Krebs eficiente [30], [31]. Um efeito associado a partir de níveis diminuídos ISCU e subsequente diminuição da actividade do ciclo de Krebs era um interruptor para a glicólise e o aumento da produção de lactato. Este foi induzida em normoxia por miR-210 e, portanto, é semelhante ao efeito Warburg. Isto pode ser relevante em situações em que miR-210 upregulation ocorre em normoxia. Por exemplo, esta tem sido mostrado em linhas celulares de cancro renal com mutações na proteína de von Hippel Lindau [14]. Por outro lado, em hipóxia, anti-210 reduziu a produção de lactato, revertendo o efeito Pasteur (alternar para a glicólise em hipóxia).

ferro-enxofre são essenciais para a atividade eficiente da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. Nós mostramos que a atividade do complexo I é reduzido sob hipóxia e após a transfecção de mímica-210 em normoxia. Além Complexo I, II e III Complexos também conter aglomerados de Fe-S e especula-se que as actividades dos três complexos pode ser diminuída de um modo dependente de miR-210. Uma cadeia de transporte de electrões auditivos conduziria a um aumento na produção de radicais livres, como consequência da fuga de electrões. Em particular, complexo III é um dos principais contribuintes para ROS em hipoxia [32] e complexo I e II contribuem com cerca de 30% da ROS [33]. Em condições de normóxia, transfecção de mímica-210 levou ao aumento da produção de radicais livres. Além disso, a produção de ROS normóxica observado com 210 mímico-se quase completamente evitado com uma construção resistente ISCU miR-210. Por outro lado, em hipoxia, observou-se que a indução de miR-210 foi associada com um aumento na ROS, e isto pode ser quase completamente invertida por anticorpos anti-210. Isto proporciona um importante novo ligação para explicar o mecanismo de indução de ROS em hipóxia, o que foi relatado por diversos grupos [33] e podem ser responsáveis ​​pela maioria das ROS indução hipóxica. O ROS lançado em hipóxia foram mostrados para funcionar como o

2 sensores, na qualidade de agentes que activam o HIF [32] de sinalização, de mediar o crescimento do tumor in vivo através de um mecanismo de HIF dependente [5] e estender o tempo de células [34] .

em contraste com a indução hipóxica de ROS e alívio com anti-210 observado em nosso estudo, Chan et al. não poderia medir qualquer mudança significativa na produção de ERO após a exposição à hipóxia, e mostrou uma tendência inverte quando miR-210 foi inibida [20]. A razão para esta discrepância não é clara, mas pode potencialmente refletem uma diferença fundamental no câncer em comparação com as células endoteliais normais.

Por fim, analisamos se havia alguma associação de ISCU downregulation em cancros humanos primários com hipóxia e resultado, e encontrou um fenótipo agressivo foi associada com esta mudança de estudos de mais de 1000 pacientes, e regulação negativa em comparação com tecidos normais em muitos tipos de tumor.

em conclusão, encontrámos uma nova e importante mecanismo para a resposta de células cancerosas para hipóxia, coordenado pelo miR-210 supressão de ISCU e conseqüente redução na atividade das proteínas de cluster ferro-enxofre (apoiando Figura S5). Além aconitase, muitas enzimas metabólicas exigem grupos Fe-S para a sua actividade, sugerindo que a regulação baixa de ISCU teria consequências de longo alcance sobre o metabolismo celular. Mutações em muitas destas enzimas de fragmentação Fe-S incluindo succinato desidrogenase subunidades SDHD, SDHB e SDHC [35] e fumarato hidratase [36] estão implicadas em distúrbios hiperproliferativos e câncer, demonstrando uma importante ligação entre o metabolismo celular e transformação subsequente e destaca um papel para HIF, através de um eixo de miR-210-ISCU nestes processos. Para além das enzimas metabólicas, várias enzimas de reparação do ADN [37] com os conjuntos de Fe-S são alvos potencialmente. Temos demonstrado anteriormente miR-210 pode ser detectado em um nível elevado no soro de pacientes com câncer [38] por isso vai ser interessante se eles refletem o estado metabólico do seu cancro primário e, portanto, poderia ser usado no futuro selecção terapêutica. A regulação das vias biológicas distintas por ISCU downregulation sugere uma potencial abordagem terapêutica de letalidade sintética em que drogas que medeiam o dano ao DNA reparado pelo cluster ferro-enxofre contendo helicases Rad3 [39] ou anemia de Fanconi [37] poderia ser usado em sinergia com inibidores de PARP ou inibidores da glicólise [36] e glutaminolysis no subgrupo de pacientes com altos níveis de miR-210.

Embora este trabalho estava em preparação, três novos alvos de miR-210 foram validados, ou seja, HOXA1, HOXA9 e FGFRL1 ea análise de xenoenxertos de tumores derivados de linhas celulares de cancro que sobre-expressam miR-210 sugeriu um potencial envolvimento de miR-210 na iniciação crescimento do tumor [40].

Materiais e Métodos

cultura celular

a exposição das células a hipoxia (1%, ou 0,1%, ou 0,01% de oxigénio) foi realizada numa incubadora com hipoxia (MiniGalaxy a, RS Biotech, Escócia, Reino Unido), utilizando um fluxo contínuo de um humidif uma mistura de 95% N

2 e 5% CO

2.

miRNA transfecção mímica ou inibidor

a transfecção foi realizada com Dharmacon anti-210, miR-210, ou oligos de controlo de imitar (Thermo Scientific, CO, EUA), a uma concentração final de 20 nM, utilizando meio isento de soro e reagente Oligofectamine Optimem (ambos da Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante.

a transfecção e luciferase ensaios

plasmídeos repórter da luciferase contendo 3 ‘regiões não traduzidas (UTR) do ISCU ou na sequência genómica aleatória (controle) foram obtidos a partir de manobra Genomics (Menlo Park, CA. Um plasmídeo de expressão de luciferase de Renilla (pRL-TK vector, Promega, Southampton, Reino Unido) foi utilizada como controlo de transfecção.

Os ensaios de actividade da enzima

Aconitase actividade utilizando o ensaio foi Bioxytech Aconitase-340 (Oxis International Inc, Beverly Hills, CA). Os dados são apresentados como% da actividade em comparação com o controlo.

As células foram testadas quanto à actividade utilizando o Complexo I Mitoprofile Complexo I rápida kit de ELISA (MitoSciences, Eugene, OR, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados são apresentados como% da atividade em relação ao controle.

lactato e piruvato medições

O lactato e piruvato foram ensaiadas utilizando kits de Instruchemie (Delfzijl, Países Baixos).

MitoSOX coloração

superóxido mitocondrial foi ensaiada utilizando MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal (Radiance 2000, a Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Reino Unido), e analisados ​​como descrito anteriormente [41].

A expressão gênica de mineração de dados

Nós já derivou uma metagene hipóxia na cabeça primária e carcinoma pescoço cancro de células escamosas [HNSCC] [25]. Os conjuntos de genes anti-correlacionada com a expressão de miR-210 foram formados tal como descrito anteriormente [25]; correlação de Spearman foi utilizado para identificar genes significativamente anti-correlacionadas miR-210 e taxa de descoberta de falsas (FDR) foi estimada utilizando um método baseado em permutação [42]. Genes com FDR 0,05 foram selecionadas. Nós também usado 5 algoritmos de previsão de destino: – TargetScanHuman (https://www.targetscan.org/); PicTar [43]; Miranda (https://microrna.sanger.ac.uk/); DianaLab (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (https://mirdb.org/miRDB/).

analisa Survival e outras análises estatísticas

correlação de Spearman foi utilizado para variáveis ​​contínuas e teste de Wilcox para variáveis ​​categóricas.