Abstract
Fundo
sialilação superfície celular está emergindo como uma característica importante da metástase da célula cancerosa. expressão sialiltransferase tem sido relatada a ser alterada em tumores e pode contribuir para a formação de antigénios tumorais sialilados. Nós nos concentramos sobre a influência de alfa-2,3-sialiltransferase ST3Gal III em etapas fundamentais do processo de tumorigênese de pâncreas.
Metodologia /Principais Achados
ST3Gal III com superexpressão linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas Capan- 1 e MDAPanc-28 foram gerados. Eles mostraram um aumento do tumor antígeno associado sialil-Lewis
x. capacidade de ligação de E-selectina Os transfectantes ‘foi proporcional à superfície celular sialil-Lewis
x níveis. migração celular positivamente correlacionada com ST3Gal III e sialil-Lewis
x níveis. Além disso, a injecção interna do baço do ST3Gal III transfectadas células em ratinhos nus atímicos mostrou uma diminuição na sobrevivência e maior formação de metástases quando em comparação com as células pseudo.
Conclusão
Em resumo, a sobre-expressão de ST3Gal III nestas linhas celulares de adenocarcinoma do pâncreas sublinha o papel desta enzima e seu produto em etapas-chave da progressão do tumor, tais como a formação de adesão, migração e metástase
Citation:. Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, Llorens de R, de bolos C, Vidal-Vanaclocha, F. et al. Motilidade celular (2010) α2,3-sialiltransferase ST3Gal III modula cancro do pâncreas e Adesão
In Vitro Comprar e aumenta a sua potencial metastático
In Vivo
. PLoS ONE 5 (9): e12524. doi: 10.1371 /journal.pone.0012524
editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 07 de maio de 2010; Aceito: 31 de julho de 2010; Publicação: 01 de setembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Pérez-Garay et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por La Marato de TV3 fundação (concessão 050.932, atribuído a RP), Espanhol Ministerio de Ciencia e Innovacion (conceder BIO 2007-61323, atribuído a RP), o Governo da Catalunha (concessão 2005SGR00065, atribuído a RL), a Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT) do Governo espanhol em Madrid (no. SAF2006-09341, atribuído a FVV) eo Governo País Basco (no. IT-487-07 atribuído a FVV). M.P.-G. graças Fundació La Marató para uma bolsa de pré-doutoramento e Universidade de Girona para uma bolsa de mobilidade de curto prazo. Os financiadores não têm nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem
Introdução
sialilação superfície celular está emergindo como uma característica importante da metástase da célula cancerosa. Resíduos de ácido siálico e seus derivados são onipresentes nas posições terminais de glicoconjugados. Esses açúcares acídicos conferir carga líquida negativa e estão em condições de modular uma grande variedade de eventos na célula-célula, célula-matriz e as interacções célula-molécula [1]. A transferência dos ácidos siálicos a partir de ácido 5-cystidine-monophospho-N-acetilneuramínico (CMP-NeuAc) para as posições terminais de grupos hidrato de carbono de glicoproteínas e glicolípidos é catalisada por sialiltransferases [2].
sialiltransferases humanos são uma família de 20 intracelular diferente, glicosiltransferases Golgi ligadas à membrana; agrupados em três subfamílias [3]. Alfa-2,6-sialiltransferases mediar a transferência de ácido siálico com uma ligação alfa 2,6-a Gal terminal (ST6Gal I-II) [4], [5], ou os resíduos de GalNAc (ST6Gal NAc I-VI). Alfa-2,8-sialiltransferases mediar a transferência de ácido siálico com uma ligação alfa 2,8-(ST8 SIA I-IV). Alfa-2,3-sialiltransferases mediar a transferência de ácido siálico com uma ligação alfa 2,3-a resíduos Gal terminais. ST3Gal I-II e IV catalisar a transferência para o resíduo Gal localizado em estruturas Galβ1-3GalNAc terminais; ST3Gal IV e VI a transferência de ácido siálico (2,3 com alfa-ligação) ao resíduo Gal localizado em estruturas Galβ1-4GlcNAc terminais; ST3Gal V actua sobre o resíduo Gal terminais localizados em estruturas Galβ1-4Glc-Cer e, finalmente, ST3Gal III catalisa a transferência de ácido siálico com uma ligação alfa 2,3-a resíduos Gal terminais, localizados em ambos estruturas Galβ1-4GlcNAc ou Galβ1-3GlcNAc [6].
alterações na expressão de sialiltransferase específicos têm sido relatados para ser alterado em vários tumores e pode contribuir para a formação de antigénios tumorais, tais como sialilados sialil-Lewis X, sialil Lewis a, sialil-t e Tn sialil. No carcinoma do ducto biliar extra-hepática níveis ST3Gal III correlacionada com a progressão do tumor, metástase e diferenciação [7]. No cancro da mama, o mais sialiltransferase expressa foi ST3Gal III que positivamente correlacionada com o tamanho do tumor e o número de nódulos axilares; e, além disso elevado rácio ST3Gal III /ST6Gal eu estava correlacionada com uma sobrevida global mais curto e mau prognóstico [8], [9]. Além disso, ST6GalNAc V foi recentemente relatado para mediar metástases cerebrais de células de cancro da mama [10]. No cancro da bexiga ST3Gal I desempenha o papel principal na sialilação do antigénio t e a sua sobre-expressão parece ser parte da transformação oncogénica inicial [11]. No carcinoma de células escamosas colo do útero, ST6Gal I e ST3Gal III níveis de expressão foram significativamente aumentados em pacientes com metástases linfonodais quando comparados com aqueles sem metástases [12], [13] e ST3Gal III, ST3Gal IV e ST6Gal I foram aumentadas em neoplasia intra-epitelial cervical . No carcinoma renal humano uma sub-regulação de ARNm ST3Gal IV pode ser um dos factores associados com a sua progressão maligna [14]. No cancro do cólon ST6Gal I e III ST3Gal aumentaram sua expressão em amostras de carcinoma [15]. ST3Gal III foi proeminentemente aumentada em tecidos de cancro em comparação com a mucosa não maligna colorrectal [16] e uma elevação da actividade da ST6Gal I foi observada em tecido maligno e de transição [17]. No cancro gástrico, altos níveis de ST3Gal III a no tecido tumoral correlacionados com a recidiva tumoral secundária [18].
Apesar de alfa-2,3-sialiltransferase expressão ST3Gal III correlaciona com a malignidade do tumor em vários carcinomas seu papel mecanicista não foi totalmente avaliada. ST3Gal III está envolvida na biossíntese de antigénios sialil-Lewis, que são sobre-expressas no adenocarcinoma do pâncreas (PDAC) [19], [20], [21], [22], [23], [24], e correlacionam com o seu mau prognóstico [25], [26], [27], [28]. No presente trabalho, nosso objetivo foi investigar a influência específica da alfa-2,3-sialiltransferase ST3Gal III em algumas das principais etapas da progressão PDAC tais como adesão, migração e metástase. Para isso, escolhemos duas linhas celulares de cancro adenocarcinoma do pâncreas Capan-1 e MDAPanc-28, com diferentes ST3Gal III e os níveis de expressão de antigénios sialil-Lewis, e gerou ST3Gal III superexpressão clones. ST3Gal III expressão aumentada foi relacionada a uma sialil-Lewis
nível x superfície aumento e conduzido a um E-selectina reforçada capacidade e migração de células de ligação. Além disso, a injecção interna do baço em ratinhos nus atimicos de as células overepressing ST3Gal III mostraram um decréscimo na sobrevivência e ratinhos maior formação de metástases. Em resumo, o aumento da expressão de ST3Gal III nessas linhas de células de adenocarcinoma do pâncreas destaca o papel desta enzima e do seu produto nas etapas chave da progressão do tumor, tais como adesão, migração e metástase.
Resultados
superexpressão estável de ST3Gal III em Capan-1 e MDAPanc-28 células
Para explorar o papel mecanicista da ST3Gal III na progressão adenocarcinoma do pâncreas, o gene ST3Gal III rato, que exibe especificidade receptor praticamente idênticos e atividade enzimática como humanos gene ST3Gal III [29], foi usado. Assim, as células Capan-1 e MDAPanc-28 foram transfectadas com o gene ST3Gal III pcDNA 3.1 vector que codifica rato. células parentais foram concomitantemente transfectadas com o vector pcDNA3.1 vazio. Vários clones de células estáveis foram seleccionadas na presença de geneticine e III mRNA ST3Gal sobre-expressão foi analisada por PCR semi-quantitativo (dados não mostrados). Os clones sobre-expressando III mRNA ST3Gal, C31 e C32 (para o modelo Capan-1) e M33 e M34 (para o modelo MDAPanc-28) foram seleccionados para mais estudos. Como controles, as linhas celulares parentais (Capan-1 e MDAPanc-28) e clones transfectadas em falso (CP para Capan-1 e MP para MDA-Panc 28) foram utilizados. III expressão de ARNm ST3Gal foi quantificada por PCR quantitativa (qPCR) (Figura 1). Capan-1 células parentais tinha 3 vezes maior (
P 0,001
) expressão ST3Gal III do que MDAPanc-28 células parentais. Em relação ao modelo Capan-1, ST3Gal III expressão de ARNm foi de 140 vezes mais elevada (
P 0,001
) no clone C31 e 100 vezes mais elevada (P 0,001) no clone C32 do que em Capan-1 e CP as células de controlo. Para o modelo MDAPanc-28, ST3Gal III expressão de ARNm foi de 7 vezes mais elevada (
P 0,001
) no clone M34 e 3,6 vezes mais elevada (P 0,001) no clone M33 que em ambas as células de controlo, MDAPanc -28 e MP. Avaliação da actividade de sialiltransferase geral foi realizada por glicosilação ensaio imunoenzimático (GISA), como previamente descrito [24]. Como esperado, um aumento geral actividade de sialiltransferase foi detectada nas células transfectadas quando comparada com os seus controlos correspondentes, sendo cerca de 3,2 vezes maior nos Capan-1 ST3Gal III clones que sobre-expressam
relação
CP e Capan-1 e 1,3 vezes maior nos MDAPanc-28 ST3Gal III clones com superexpressão
contra
MP e MDAPanc-28
MDAPanc-28 células parentais, MP:. MDAPanc-28 células simuladas, M34 e M33: MDAPanc-28 as células transfectadas com o gene ST3Gal III. Capan-1: células parentais, CP: Capan-1 células simuladas, C31 e C32: células Capan-1 transfectadas com o gene ST3Gal III. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 experiências separadas, cada um em seis repetições (n = 18). * Significativamente diferente (
P 0,001
).
ST3Gal III aumento da expressão de novo de SLex pela competição enzimática
superfície celular padrão de expressão glicano para ambos os modelos foi estudadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais específicos contra os antigénios de Lewis e lectinas específicas (resultados apresentados na Figura 2). A análise do Tipo II Lewis antígenos no modelo Capan-1 (Figura 2A) revelaram que as células Capan-1 e CP tinham níveis alto, médio do Le
x, SLE
x e antígenos H2 e altos níveis de o Le
antígeno y. Quando comparados com os controlos, os clones C31 e C32 apresentado um grande aumento no LES
x expressão à custa de perder completamente a expressão de antigénios não-sialiladas (Le
X, H2 e Le
y). Além disso, acompanhando o aumento no LES
x, foi observada uma diminuição em ácido α2,6-siálico, detectado pelo
Sambucus nigra aglutinina
(SNA).
Maackia amurensis aglutinina
(MAA) não apresentaram diferenças entre os clones, provavelmente devido ao fato de que é incapaz de se ligar ao LES
x estrutura (dados não mostrados). Tipo I Lewis antigénios SLE
A, Le
A, Le
b e H1 não foram detectadas no modelo Capan-1 (dados não mostrados). Assim, estes resultados demonstraram uma competição enzimática múltipla para as cadeias de tipo II. A análise do modelo MDAPanc-28 (Figura 2B) mostrou que as células controle MDAPanc-28 e MP tiveram muito baixo
x expressão LES e expressão de ácido alta α2,6-siálico e também não dispunha antígenos Tipo I Lewis. Quando clones M33 e M34 foram comparados com os controles, um aumento no LES
x com uma redução simultânea em ácido α2,6-siálico também foi detectado. Como acima, MAA não mostraram diferenças entre clones provavelmente porque ele não reconhece SLE
x (dados não mostrados). Desde ST3Gal III transfectadas clones C31 e C32 comportamento semelhante no modelo Capan-1, bem como o M33 e M34 ST3Gal III transfectadas clones no modelo MDAPanc-28, a seguir
in vitro
e
in vivo
estudos foram realizados apenas com os mais altos ST3Gal III e SLE
x clones expressando: C31 para o modelo Capan-1 e M34 para o modelo MDAPanc-28
Figura 2A.. Capan-1 (esboço de ponto fixo: ………), CP (espaçada esboço ponto:…..), C31 (contorno em negrito: _______), C32 (esboço simples: ______). Figura 2B. MDAPanc-28 (esboço de ponto fixo: ………), MP (esboço dot espaçadas:…..), M34 (contorno em negrito: _______), M33 (esboço simples: ______). As experiências foram realizadas em triplicado. histogramas citometria representativos são mostrados. Anti-Le
x mAb se liga a Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc; anti-LES
x mAb se liga a NeuAcα2-3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc; anti-H2 MAb liga-se a [Fucα1,2] Galβ1,4GlcNAc-; anti-Le
y MAb liga a [Fucα1,2] Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc; SNA lectina (
Sambucus nigra
aglutinina) liga-se a estruturas NeuAcα2-6Galβ-.
ST3Gal III reforçada pancreático células de adenocarcinoma de adesão ao rh-E-selectina
E -selectin é uma molécula de adesão celular, expresso em células endoteliais activadas que reconhece e liga-se a determinantes de hidrato de carbono específicos, tais como SLE
x e com SLE
um presente em glicoconjugados de superfície [30]. Os ensaios de ligação para RH-E-selectina foram realizadas para analisar se o padrão diferente da expressão do antigénio de Lewis era capaz de induzir alterações na adesão (resultados mostrados na Figura 3). Ambos os modelos mostraram diferentes padrões de adesão para rh-E-selectina. MDAPanc-28 células parentais exibido menor adesão ao RH-E-selectina do que Capan-1 células parentais, o que foi consistente com o nível mais baixo de expressão ST3Gal III e com SLE
X de MDAPanc-28 em comparação com células Capan-1. No modelo Capan-1 (Figura 3A) que sobre-expressam o clone ST3Gal III, C31 triplicado a adesão (
P 0,001
) para RH-E-selectina, quando comparados com os controlos correspondentes Capan-1 e CP. Para confirmar que o LES
x expressão induzida por ST3Gal III causada ligação do up-regulamentado E-selectina, as células foram previamente incubadas com o anti-LES
anticorpo monoclonal x (MAB) ea ligação a E-selectina foi inibida . No modelo MDAPanc-28 (Figura 3B), o clone ST3Gal III superexpressando, M34, quadruplicou (
P 0,001
) a adesão de RH-E-selectina, quando comparados com os controlos correspondentes MDAPanc-28 e MP . Quando as células foram previamente incubadas com o LES anti-
x MAb a ligação de E-selectina foi completamente revogada. Estes resultados demonstraram que, nesses modelos, os níveis ST3Gal III modulou a
in vitro
ligação a rh-E-selectina via SLE
x expressão.
Capan-1 células da variante (Figura 3A) e MDAPanc-28 células da variante (Figura 3B), previamente incubadas com PBS-BSA a 1% (barras claras) ou anti-LES
x MAb (barras escuras), foram adicionados a microplacas de 96 poços revestidas com rh e BSA -selectin% ou PBS-1 (controlo negativo). As células aderentes foram estimados com um ensaio colorimétrico baseado em MTT. Os resultados são expressos como a ligação específica a E-selectina (OD 570 nm de células delimitadas a E-selectina – OD 570 nm de células ligadas a PBS-BSA a 1%)
relação
células previamente incubados ou não com anti -SLe
x MAb. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 experiências separadas, cada uma em cinco repetições (n = 15). * Significativamente diferente (
P 0,001
).
O efeito de diferentes citocinas na adesão das células do cancro do pâncreas endotelial sinusoidal hepática células (HSE)
porque ST3Gal III e SLE níveis
x expressão foi diretamente proporcional à
in vitro
rh-e-selectina de adesão, a ligação das células do cancro do pâncreas células HSE cultura principal foi avaliado. O modelo Capan-1 foi selecionada para este experimento devido a sua maior adesão ao rh-E-selectina. Em primeiro lugar, determinou-se a adesão específica de Capan-1 para células progenitoras de HSEC estimuladas com TNF-α, IL1-β ou lipopolissacárido (LPS) durante 16 horas antes do ensaio (resultados mostrados na Figura 4A). O tratamento com TNF-α e IL1-β aumentou significativamente o número de células aderentes, e IL1-β resultou ser as melhores para o nosso modelo de estímulos. Quando da incubação com anti-E-selectina AcM, o aumento da aderência foi totalmente abolida. Estes dados mostraram que a citocina HSE célula pré-tratamento, especialmente IL-1β, promovida a sua expressão de E-selectina, o que causou um aumento de Capan-1 de adesão
HSE células foram incubadas com . Sel = Anti-murina CD62 E (E-selectina) ou o MAb IgG = Anticorpo de controlo de isotipo. células parentais Capan-1 foram marcados com calceína e adicionado a células de controlo de HSE, o TNF-α estimulada células HSE, células estimuladas com LPS de HSE ou IL-1β estimulada células HSE. Os resultados são expressos como a% de adesão específicas para células HSE [78]. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 experiências separadas, cada uma em três repetições (n = 9). * Significativamente diferente (
P 0,001
) quando se comparam anti-E-selectina HSEC incubadas com células de controlo. # Significativamente diferente (
P 0,001
) na comparação entre os tratamentos. ensaio de adesão de células tumorais para células de cultura principal de HSE (Figura 4B). Capan-1 células da variante foram marcadas com calceína e adicionou-se IL-1β estimulada células de HSE ou – as células de controlo não estimuladas HSE (). Sel = Anti-murina CD62 E (E-selectina) MAb foi adicionado às células IL-1 HSE ou HSE – células antes da adição de células de tumor. * Significativamente diferente (
P 0,001
) quando se compara Capan-1, CP e células C31. # Significativamente diferente (
P 0,001
). Quando se comparam cada clone (Capan-1, CP e C31) de adesão para os diferentes tratamentos com células HSE
ST3Gal III aumento da adesão de células tumorais para células de HSE
a seguir determinou-se a adesão das diferentes ST3Gal III e com SLE
X níveis de células que expressam Capan-1 para as células IL-1 pré-tratados ou de controlo de HSE (resultados apresentados na Figura 4B). células Capan-1 e de controle CP mostrou uma adesão basal às células de SMS, que aumentaram significativamente em células de SMS pré-tratadas IL-1b e retornou aos níveis basais em células pré-incubadas mAb anti-E-selectina HSE. C31 apresentaram uma adesão basal de células de HSE (maior do que Capan-1 e de controlo CP células), que aumentaram significativamente em células pré-tratadas HSE IL-1 e também retornou aos níveis basais em anti-E-selectina MAb células pré-incubadas HSE. Estes dados mostraram que a E-selectina desempenhou um papel importante para mediar a adesão de células de HSE, embora uma não-E-selectina dependente de adesão basal (para maior do que C31 para as células de controlo) existia. Além disso, a alta ST3Gal III e LES
x expressando células C31 tinha uma maior adesão às células HSE do que meio ST3Gal III e LES
x expressando células controle.
expressão ST3Gal III aumento da migração de células
para investigar se os clones que sobre-expressam ST3Gal III pode levar à obtenção de um fenótipo de célula mais migratório, avaliou-se a migração celular em colagénio do tipo I utilizando um ensaio de migração de Transwell (resultados apresentados na Figura 5). Ambos os modelos celulares mostraram diferentes capacidades migratórios, com o modelo Capan-1 ser nove vezes maior do que o modelo migratório MDAPanc-28. Em relação ao modelo Capan-1 (Figura 5A), o ST3 Gal III e LES
x clone superexpressão C31 exibiu dupla (
P 0,001
) recursos de migração do que as células de controlo Capan-1 e CP. Para o modelo MDAPanc-28 (Figura 5B), a ST3Gal III e com SLE
X clone que sobre-expressam M34 aumento da migração por quatro em relação às células de controlo MDAPanc-28 e MP. Os resultados demonstraram uma correlação positiva entre ST3Gal III e LES
x níveis e capacidades migratórias.
Capan-1 células variantes (Capan-1, CP e C31)
(
Figura 5A
) MDAPanc-28 células variantes (MDAPanc-28, MP e M34) Comprar e
(
Figura 5B
)
foram semeadas 8 um para-poros do tipo I-colagénio revestidas inserções, colocadas na parte superior dos poços contendo DMEM-FBS a 1% e incubadas a 37 ° C (6 horas para Capan-1 e 18 h modelo para MDAPanc-28, modelo). As células que não migraram foram eliminados e as células migraram fixadas, coradas e contadas. Os resultados são expressos como células que migraram por poço. Os dados representam a média ± desvio padrão dos valores obtidos em 3 experiências separadas, (n = 9). * Significativamente diferente (
P 0,001
).
ST3Gal III superexpressão aumenta tumorigénese e diminui a sobrevivência em camundongos nus atímicos
Uma vez que o
in vitro
resultados descritos acima sugeriu um papel importante para o gene ST3Gal III em progressão tumoral,
in vivo
ensaios foram realizados para estudar se ST3Gal III pode ser importante na metástase tumoral. Em primeiro lugar, a formação de metástases e na sobrevivência de ratinhos nus atímicos após injecção interna do baço com diferentes quantidades de células parentais Capan-1 e MDAPanc-28 foram ensaiadas. Em nossas mãos, quando 1,5 × 10
6, 3 × 10
6 e 5 × 10
6 células Capan-1 foram injectados, os ratos nu morreu de formação de êmbolos, provavelmente devido ao Capan-1 tamanho e capacidade de agregação. A injeção de 1 × 10
6 células Capan-1 não formam êmbolos e os tumores do baço gerados, embora sem metastático se concentra. Como as células MDAPanc-28 são 4-5 vezes menor do que as células Capan-1, 7 × 10
6 células MDAPanc-28 foram injetados intrasplenically em ratinhos nus, o que gerou pequenas células metastático macroscópica se concentra em 2/3 dos ratos, 20 -22 semanas mais tarde. Portanto, as células MP e M34 foram escolhidos para estudar a influência do ST3Gal III superexpressão na formação de metástases e sobrevivência ratinhos nus. Crescimento exponencial 7 × 10
6 células viáveis MP e M34, que partilham as mesmas características morfológicas, foram injetados no baço de ratinhos nus atímicos (n = 8 /grupo) e sobrevivência análise foi realizada utilizando o método de Kaplan-Meier ( A Figura 6). Camundongos injetados com células com superexpressão ST3Gal III (M34) mostrou uma grande diminuição na sobrevivência (
P = 0,019
), quando comparado com camundongos injetados com células de controlo MP. A maior parte do M34 ratinhos (08/05) injectado morreram depois de 103-110 dias após a injecção, enquanto MP injectados ratinhos sobreviveram até ao final do estudo (190 dias). Todos os ratinhos injectados com M34 foram necropsiados e a análise mostrou tumores do baço em 62,5% delas (5/8) e vários metastático macroscópica concentra-se para o intestino, o diafragma, o rim, supra-renais ou gânglios em 75% dos ratinhos (08/06) . Todos MP injetaram em ratos foram necropsiados (dias 103, 138, 161 e 190 de pós-injecção) e nenhum deles (8/8) mostraram evidência de qualquer tumores do baço ou metástases macroscópica. Assim, a sobre-expressão de ST3Gal III em células MDAPanc-28, que levam a uma maior expressão de SLE
x e uma maior adesão e migração, pode ser directamente correlacionada com uma diminuição na sobrevivência quando injectadas em ratinhos nus. Além disso, é dotado células com uma maior capacidade de formação de tumores e ocorrência de metástases quando injectadas intrasplenically.
Células (7 × 10
6) foram injectados intrasplenically em ratinhos nus no dia 1 da experiência. Camundongos foram diariamente examinados e sacrificados quando parecia doente. As diferenças entre grupos foram avaliadas pelo teste de long-rank (
P
= 0,019; n = 7-8 /grupo).
Discussão
O nosso anterior estudos mostraram que a actividade de alfa-2,3-sialiltransferase correlacionada a sialil-Lewis a expressão do antigénio na superfície das células do cancro pancreático [24]. Nós nela estendida nossas investigações para estudar o papel especificamente mecanicista da ST3Gal III na aquisição de adesivo, capacidades migratórias e metastáticos em linhas celulares de cancro de adenocarcinoma pancreático. Descobrimos que: 1) os níveis de expressão de mRNA III ST3Gal correlacionada com SLE
x expressão de superfície; 2) ST3Gal III sialilação induzida aumento da adesão do cancro do pâncreas células de SMS pré-estimuladas IL1-beta rh-E-selectina e, via SLE
x-E-selectina interação; 3) uma correlação positiva entre migração e ST3Gal III e LES
x expressão; e 4) a injecção interna do baço de ST3Gal III linhas de células que sobre-expressa em murganhos nus atímicos induziu um aumento na tumorigénese e uma diminuição na sobrevivência.
ST3Gal III clones sobre-expressando (C31, C32, M33 e M34) exibiu um aumento no Sle
x expressão quando em comparação com os controlos correspondentes (células não transfectadas, Capan-1 e MDAPanc-28, e as células transfectadas com o vector vazio, CP e MP). Embora substrato Tipo I é considerado ST3Gal III aceitador preferido, do Tipo II substrato é também um bom aceitador. Os estudos enzimáticos realizados, a fim de caracterizar a atividade ST3Gal III mostraram que substratos aceitadores Tipo II Tipo I e levou a bastante semelhante V
max valores, enquanto que K
valores m eram muito mais elevados para o tipo II. Como consequência, as taxas de incorporação foi de aproximadamente duas vezes a de tipo I do que para estruturas de tipo II [31]. Resultados semelhantes foram obtidos em trabalhos posteriores em que estudam naturais [32], [33] ou sintéticos aceitadores especificidades [34], [35], [36], [37], [38]. Tendo em conta que as linhas celulares utilizadas neste estudo não expressam tipo I Lewis antigénios e que ST3Gal III podem actuar em ambos os tipos I e substratos II, a sobre-expressão de ST3Gal III actuaram sobre os precursores do tipo II que conduzem a um aumento da expressão de SLE
x. Recentemente, e de acordo com nossos resultados, foi descrito que a superexpressão de ST3Gal III em células de carcinoma gastrointestinais também resultou em SLE
x aumento determinante [39]. Além disso, estes autores descrevem que os níveis de mRNA de ST3Gal III correlacionada com o aumento SLE
X níveis de expressão em células confluentes, mas não com os níveis de ARNm de ST3Gal IV e ST3Gal VI, que são as enzimas que têm sido relatados para actuar preferencialmente no tipo de cadeias II. Tomados em conjunto, estes dados reforçam o papel da ST3Gal III na biossíntese de SLE
x nestas células de carcinoma. Juntamente com SLE
x aumento, uma diminuição em ácido α2,6-siálico foi observada em ambos os modelos. Além disso, C31 e C32 apresentaram uma perda completa de tipo não-sialilada II antigénios de Lewis (Le
X, H2 e Le
y). Estes resultados são provavelmente explicada pela competição enzimática múltipla para as cadeias de tipo II. Por um lado, não houve competição entre os alfa-1,2-fucosiltransferases, alfa-1,3 (4) fucosiltransferases e alfa-2,3-sialiltransferases [23], [40], [41], e por outro lado entre alfa-2,3-sialiltransferases e alfa-2,6-sialiltransferases [6], [31], [42].
Os mecanismos moleculares que regulam a metástase do tumor pancreático são ainda mal compreendidas. Um passo importante é a ligação de células tumorais para células endoteliais activadas, que envolve a sua adesão ao endotélio selectinas que reconhecem determinantes de oligossacáridos expressas na superfície de células cancerosas. Sle
X tem sido relatada a participar nos primeiros passos do extravasamento através da interacção com a E-selectina, ao facilitar a laminagem e a ligação de células de tumor para as células endoteliais [27], [28], [43], [44 ], [45]. células A correlação direta entre os níveis ST3Gal III, SLE
x níveis e adesão celular do cancro do cólon para IL-1β activadas humanas endoteliais da veia umbilical (HUVEC) tem sido descrita [46]. LES
x expressando células cancerígenas do cólon foram também relatados para aderir às células endoteliais sinusoidais hepáticas via E-selectina-LES
x interação [47]. Além disso, vários trabalhos relataram uma correlação entre SLE
x, ea adesão a citocina estimulada HUVEC em H7721 hepatocarcinoma [48], [49], [50], [51] e em células de adenocarcinoma de pulmão [52]. De acordo com estes dados, os nossos resultados mostraram uma correlação direta entre a adesão adenocarcinoma do pâncreas de
in vitro
rh-E-selectina níveis ST3Gal III e nas células tumorais pancreáticas, via SLE
x. Além disso, quando se estuda a adesão de células de adenocarcinoma pancreático de células endoteliais hepáticas sinusoidais, ST3Gal III e com SLE
x sobreexpressam células C31 demonstrou uma maior capacidade para aderir a IL-1β estimulada HSE células em comparação com os controlos. HSE célula pré-tratamento com IL1-β e citocinas TNF-α aumentou significativamente a adesão celular Capan-1 a células de HSE e retornou aos níveis basais em células pré-incubadas HSE anti-E-selectina. Estes resultados são consistentes com trabalhos anteriores relatórios de que a expressão de E-selectina é reduzida ou ausente em células HSE sob condições normais, mas pode ser sobre-reguladas por citocinas [53], por hepatócitos [54], ou como uma resposta a células tumorais metastáticas [ ,,,0],55]. Adesão de ST3Gal III e LES
x superexpressão células C31 de células não estimuladas de SMS foi significativamente maior quando comparada com células de controlo Capan-1 e CP. Esta adesão não foi revertida quando pré-incubação de células de HSE com anticorpos anti-E-selectina, o que pode ser explicado por um não-E-selectina dependente, mas SLE
mediada por X, a adesão de células do cancro do pâncreas para células não estimuladas HSE . Esta interacção pode ser mediada por outro SLE
X celular Moléculas de Adesão de ligação, tais como P-selectina [55], [56] ou lectinas de tipo I. Na verdade, um estudo anterior relatou a ligação do ST3Gal III superexpressão células cancerígenas do cólon para HUVEC não activado, sugerindo que este não-E-selectina dependente SLE
x adesão mediada poderia ser devido a lectinas I-Type [46].
Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório sobre uma correlação positiva entre a migração celular e ST3Gal III e LES
x níveis de expressão em células de adenocarcinoma do pâncreas. Apesar da ausência de estudos sobre células de câncer pancreático, algumas investigações apoiar nossos achados. Quando a expressão do ácido siálico-α2,3 superfície de células de tumor na linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 foi deprimido (por inibição da actividade celular α2,3-sialiltransferase com soyasaponin I), a migração celular diminuiu significativamente [57]. ST3Gal III sobre-expressão na linha de células de glioma L-374 aumentou a expressão do ácido siálico ligado a α2,3 na superfície da célula e resultou em uma
In vitro
fenótipo invasivo mais [58]. Além disso, as células de hepatocarcinoma H7721 mostrou uma correlação direta entre a quantidade de superfície SLE
x expressão e migração [50], [51], [59]. Além disso, SLE
x foi crucial para a migração H7721, uma vez que a migração foi inibida por anti-LES
x MAb e após a eliminação resíduo de ácido siálico [60]. A migração celular é um processo de passos múltiplos que desempenha um papel fundamental na metástase. A resposta inicial de células migratórias a um agente de promoção da migração é a polarizar e estender saliências. Estas saliências são estabilizadas por moléculas de adesão da matriz extracelular, tais como integrinas, e servem como locais de tracção para a migração como a célula move-se para a frente sobre eles [61]. Existe um crescente corpo de evidência que demonstra que as capacidades de influências de sialilação de migração através da modulação da função da integrina [58], [62], [63], [64]. Assim, a hipótese de que ST3Gal III poderiam estar influenciando a migração de células, alterando integrina sialilação. Um aumento em ácido α2,3-siálico na superfície da célula C31 e M34 também podem alterar os níveis de sialilação das suas integrinas, modulando a sua adesão matriz extracelular.