Abstract

plantas na família Meliaceae são conhecidos por possuir actividades biológicas interessantes, tais como actividades antimalaral, anti-hipertensivos e anti-tumorais. Anteriormente, o nosso grupo relatou o composto derivado de plantas cycloart-24-eno-26-ol-3-ona isolado a partir dos extractos de hexano de

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folhas, que mostra a citotoxicidade para com várias linhas celulares de cancro, em particular , linhas celulares de cancro do cólon. Neste relatório, que mostram, adicionalmente, que cycloart-24-eno-26-ol-3-ona, daqui por diante conhecida como cicloartanos, reduz a viabilidade das linhas celulares de cancro do cólon HT-29 e Caco-2 em uma dose e -time dependente maneira. Além disso elucidação de um mecanismo do composto revelou que ele se liga ao factor de necrose tumoral-receptor 1 (TNF-R1) que conduz ao início da caspase-8 e, através da activação de uma oferta, na activação de caspase-9. Esta actividade causa uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial (MMP) e à libertação de citocromo-C. A activação de caspase-8 e -9 ambos actuar para confirmar as células cancerosas a apoptose através da caspase-3 a jusante /7 activação, a clivagem de PARP e a falta de NFkB translocação para o núcleo. Um estudo de ancoragem molecular mostrou que a cicloartanos se liga ao receptor através de uma interacção hidrof óbica com ligações de hidrogénio e de cisteína-96 por lisina-75 e -132. Os resultados mostram que o desenvolvimento da cicloartanos como uma droga anti-câncer é pena

Citation:. Leong KH, Looi CY, Loong X-M, Cheah FK, Supratman U, Litaudon M, et al. (2016) Cycloart-24-eno-26-ol-3-ona, um Novo cicloartanos isolado de folhas de

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disparadores Factor de Necrose Tumoral-1 Receptor-Mediated Caspase-Dependente apoptose numa linha celular de cancro do cólon . PLoS ONE 11 (4): e0152652. doi: 10.1371 /journal.pone.0152652

editor: Rubi John Anto, Rajiv Gandhi Centro de Biotecnologia, Índia |

Recebido: 26 Abril 2015; Aceito: 17 de março de 2016; Publicação: 12 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Leong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade da Malásia [subvenções RP001 /2012A, RP001A-13BIO]; Pesquisa do Impacto Universidade Malaya alta [concessão H-20001-E00002]; e do Ministério da Educação Superior da Malásia [conceder FP006-2011A]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer é uma doença debilitante que afeta uma parcela significativa da população do mundo, e é de facto um problema global de saúde. O câncer colorretal continua a ser um dos cânceres mais prevalentes entre os pacientes nos Estados Unidos, constituindo 8% e 9% de todos os casos de câncer para homens e mulheres, respectivamente [1]. Apesar dos recentes avanços em tratamentos contra o cancro, tais como o desenvolvimento de terapia-alvo [2], as taxas de sobrevivência relativa para pacientes que sofrem de câncer colorretal não melhoraram significativamente [3]. Além disso, a quimioterapia usando drogas sintéticas muitas vezes causa efeitos colaterais, tais como perda de cabelo, hemorragia, diarreia e mielotoxicidade [4]. Os investigadores continuam a procurar novos agentes terapêuticos que são mais seletivos contra as células cancerosas e que geram menos efeitos colaterais.

Plantas continuam a ser uma das maiores fontes de produtos naturais que são usados ​​para descobrir novos agentes quimioterapêuticos [5-6 ]. Notavelmente, alguns novos compostos foram descobertos a partir de plantas que tinham mecanismos exclusivos de ação, maior potência ou menores efeitos adversos do que as drogas usadas atualmente [7]. Em colaboração com instituições francesas de pesquisa para novos medicamentos, realizamos perfil fitoquímico preliminar da planta

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. Aglaia é o maior gênero da família Meliaceae, e as árvores Aglaia comumente crescer em florestas tropicais e subtropicais na China continental, Indo-Malásia e Ilhas do Pacífico. partes de árvores Aglaia (folhas, flores e frutos comestíveis) possuem várias propriedades medicinais, tais como anti-inflamatório, anti-câncer, propriedades anti-diabéticos. Seis triterpenóides e dois esteróides foram previamente isolados das folhas de

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por nosso grupo. Anteriormente, demonstrou que o novo cicloartanos exibiu o maior efeito citotóxico na linha celular de cancro do cólon HT-29 de todos os compostos isolados a partir de

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pelo nosso grupo, com um IC

50 de 11,5 | iM [8]. Curiosamente, estudo anterior relatou cicloartanos de

Aglaia

espécies apresentaram seletividade 10 vezes para a linha de células de câncer de cólon HT-29, em comparação com linha de células do cólon normal, CCD-112CoN [9].

A maioria a quimioterapia corrente de drogas desencadear apoptose para causar a morte de células de cancro. A apoptose é um processo activo de morte celular programada que ocorre com as mudanças morfológicas e bioquímicas específicas nas células [10]. Estas alterações morfológicas incluem a externalização de fosfatidilserina à superfície da célula, vesiculação da membrana, condensação da cromatina e a formação de corpos apoptóticos [11]. Avanços na compreensão da sinalização da apoptose levou a duas principais vias de iniciação ser amplamente aceite, ou seja, a extrínsecos e intrínsecos vias de apoptose. A via extrínseca é desencadeada através de receptores de morte presentes na superfície da célula, ao passo que a via intrínseca é desencadeado pela libertação de factores proapototic, tais como o citocromo c, a partir de mitocôndria da célula [12]. receptores do factor de necrose do tumor, proteínas transmembranares, estão entre os receptores de morte externos bem conhecidos. Estes receptores incluem dois tipos: receptor de factor de necrose tumoral-1 (TNF-R1) e 2 (TNF-R2). TNFR-1 é expresso ubiquamente na maior parte das células, enquanto que o TNFR-2 encontra-se principalmente em oligodendrócitos, astrócitos, células T, os miócitos, os timócitos, células endoteliais e células estaminais mesenquimais [13]. O processo de sobrevivência e morte é regulado principalmente por TNF-R1, como este receptor contém um domínio de morte intracelular que não está presente no TNF-R2. Uma vez activado, o domínio de morte recruta outros sinais de morte, tais como TRADD, FADD e pró-caspase-8, para formar um complexo de sinalização indutor de morte-(DISCO). A liberação de caspase 8 sinais Bid para ativar Bax, Bad, e citocromo C na mitocôndria da célula. A activação de TNR-R1 é acreditado para fazer com que a TACE metaloprotease para libertar o componente extracelular do receptor solúvel de TNF-R1 (sTNF-R1), que é uma citocina que é capaz de activar outro TNF-R1S para aumentar os sinais de morte [ ,,,0],14].

no entanto, as principais executores de vias apoptóticas são proteases da família da caspase proteoliticamente que se desintegram as células sob a forma de corpos apoptóticos. Esta família de proteases é dividido em caspases executoras, tais como caspases 3 e 7, e o iniciador caspases, tais como caspase 8 e 9. Iniciador de caspase-8 é conhecida por ser activada através dos receptores de morte, enquanto que a caspase-9 é activado pelo citocromo c vazamento da mitocôndria. Estas caspases iniciadoras levar à activação de caspases a jusante de 3 e 7, comprometendo a célula à morte por apoptose. Em contraste com a necrose, a apoptose é uma via de morte celular não-inflamatório, que tem a vantagem de minimizar os efeitos indesejados sobre as células vizinhas [15]. Portanto, os cientistas estão constantemente em busca de moléculas pequenas que podem desencadear a apoptose no tratamento de cancro. Neste estudo, foi avaliado o potencial anti-câncer do cicloartanos na linha de células de cancro do cólon humano HT-29, com foco no mecanismo de apoptose subjacente a esta actividade.

Materiais e Métodos

cultura celular e ensaio de citotoxicidade

linhas celulares de cancro de cólon humano (HT-29 e Caco-2) foram obtidas a partir da American Tissue Culture Collection (Rockville, MD). As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 50 ug /ml de gentamicina e 2,5 jig /ml de anfotericina B (Gibco, Carlsbad, CA) numa incubadora humidificada a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO

2.

a citotoxicidade do cicloartanos foi avaliado contra 2 linhas celulares de cancro do cólon (HT-29 e Caco-2). As células foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

3 células por poço em placas de 96 poços e tratados continuamente com o composto (0,39-200 uM) ou cisplatina (3,9-2000 ^ M) ou 5-fluorouracilo (200- 8 x 10

-6 mM) durante 24, 48 e 72 horas. Cisplatina e 5-fluorouracilo de mais do que 99,9% de pureza foi obtido de Sigma-Aldrich. Os poços de controlo foram tratados com 0,05% v /v de DMSO no meio de cultura. No final do tratamento, o meio foi refrescado com cuidado, e 20 uL de reagente MTS (, CellTiter 96 AQ

ueous® Uma solução Promega, Madison, WI) foi adicionado. As placas foram incubadas durante 2 horas, e a absorvância foi lida utilizando um leitor de microplacas (Infinito 200, Tecan, Männedorf, Suíça) a 490 nm, com 690 nm como o comprimento de onda de fundo. A percentagem de células viáveis ​​foi calculada em relação aos poços de controlo, e IC

50 foi determinada utilizando a curva de dose-resposta ajustados utilizando software Prism 5.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Todos os experimentos foram realizados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias aritméticas ± SD

A apoptose e ciclo celular analisa

A apoptose e ciclo celular análises foram realizadas separadamente usando comercial anexina V:. FITC Detection apoptose kit I e kit CycleTest ™ Além disso DNA Reagente, respectivamente (BD Bioscience, San Jose, CA). As células foram semeadas a 5 x 10

5 células por poço em placas de doze poços. Após fixação durante a noite, as células foram tratadas com o composto a 12,5, 25 e 50 uM, durante 24 horas para a análise da apoptose e a 2,5 uM para 12, 24 e 48 horas para análise do ciclo celular. Após o tratamento, as células foram colhidas por tripsinização suave e centrifugou-se a 1500 x g durante 5 minutos. A coloração de células foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Um kit de ADN Partículas QC foi usada para calibrar o fluxo FACSCanto citómetro II (BD Biosciences, San Jose, CA). populações de células foram sujeitas a citometria de análise, e os quadrantes foram definidos de acordo com a população de células viáveis ​​em amostras não tratadas. FacsDiva 5.0.3 software (BD Biosciences, San Jose, CA) foi utilizado para calcular a percentagem de células nos respectivos quadrantes para a análise da apoptose, e da modificação do software Fit LT (Verity Software House Inc., Topsham, ME) foi utilizado para a análise do ciclo celular.

mitocondrial potencial de membrana Δѱm (MMP), análise do citocromo c liberação e NFkB translocação

Um Kit Cellomics Multiparameter citotoxicidade 3 para MMP e liberação do citocromo e Kit Núcleo fator kappa B Activation (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) foram utilizados tal como previamente descrito [16]. As células foram plaqueadas a 1 x 10

4 culas por po em placas de 96 poços durante a noite. As células foram lavadas e incubadas com o composto durante 24 horas a várias concentrações (3,125-50 uM). Como para a actividade de translocação de NFkB, as células foram tratadas a 12,5 uM de cicloartanos sozinho ou 10 ng /ml de TNF-α sozinho ou 12,5 uM de cicloartanos e 10 ng /ml de TNF-α no tratamento de combinação. Em seguida, as células foram fixadas com formaldeído a 4% durante 15 minutos e depois permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em solução salina de tampão fosfato (PBS). Após a fixação, as células foram incubadas com corante de MMP ou bloqueadas com 3% de albumina de soro bovino seguido por anticorpo primário de coelho NFkB ou citocromo c anticorpo primário do rato e, em seguida, anticorpo de cabra anti-coelho secundário conjugado com DyLight

TM 488 ou cabra anti- anticorpo secundário rato conjugada com DyLight

TM 649 para 1 hora cada. As células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem II (1 X PBS com 1% de Tween-20). Os núcleos foram corados com Hoechst 33258. Em seguida, as células coradas foram visualizadas, e as imagens foram capturadas usando leitor Cellomics ArrayScan HCS ((ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). O módulo bioapplication perfis saúde das células foi usada para quantificar a intensidade de fluorescência cada corante.

atividade Caspase e inibidor ensaios

as células foram colocadas em placas de 96 poços brancos em 1 x 10

4 células por poço e foram autorizados a ligar. em seguida, as células foram tratados com o composto (50 uM) durante diferentes períodos de tempo (1, 3, 6, 12, 18, 24 e 30 horas). actividade de caspase foi medida por adição de 50 ul de caspase-Glo® 3/7 (Z- DEVD-aminoluciferin), Caspase-8 Glo® (Z-LETD-aminoluciferin) ou caspase-Glo® 9 (Z-LEHD-aminoluciferin) (Promega, Madison, WI) e, em seguida, ler a luminescência utilizando um leitor de microplacas (Infinito 200, Tecan, Männedorf, Suíça). as actividades das caspases individuais foram expressos como aumentos vezes em relação ao controlo não tratado. para o ensaio de inibidor, as células foram pré-tratadas com 10? M de caspase 3 inibidor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inibidor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inibidor (Z-LEHD-FMK) ou inibidor de caspase geral (Z-VAD-FMK) durante 30 minutos. Em seguida, as células foram incubadas com o composto (50 uM) durante 18 horas, e os ensaios de caspase foram realizadas como descrito acima. Depois de mais 6 horas de incubação com o composto, a viabilidade celular foi medida utilizando o reagente MTS, tal como descrito na secção de cultura de células e ensaio de citotoxicidade.

extracção de proteína, matriz e proteínas western blotting analisa

Um total de 1 x 10

6 as células foram tratadas com o composto (50 uM) ou TNFa (10 ng /ml) como controlo positivo para a NFkB translocação, e alterações na expressão de proteína foram monitorizados ao longo de intervalos de tempo de 6, 12, 18 e 24 horas. As células foram colhidas, lavadas com PBS gelado e lisadas em tampão de M-PER contendo Pierce 1x cocktail Halt inibidor de protease para o total dos extractos celulares ou tampão NE-PER de extractos nucleares celulares em experiências NKkB ou mem-per mais tampão para a proteína da membrana celular extratos em experiências TNF-R1 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Para o array de proteínas, os níveis de expressão de 43 proteínas relacionadas com a apoptose na lisado celular foram determinados utilizando o kit de apoptose matriz G1 RayBio humano, de acordo com o protocolo do fornecedor. Dobre mudanças entre tratadas e amostras não tratadas foram analisados ​​utilizando o RayBio Antibody matriz Analysis Tool (RayBiotech, Norcross, GA). Para Western blot, os lisados ​​celulares (proteína de 20 ug /poço) foram fervidas durante 5 minutos e, em seguida, resolvido em 12% de dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas electroforeticamente para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite magro em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 (TBST) a 0,5% durante 1 hora e incubada com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Os kits utilizados foram o kit de anticorpo apoptose amostrador (# 9915), pró-apoptose Bcl-2 família kit de anticorpo amostrador (# 9942), e kit de amostrador de receptor de morte (# 8356), e os anticorpos utilizados foram o factor nuclear kappa B p65 (# 8242), beta-actina (# 8457) e anticorpos B2 lamina (# 13823) (Cell Signaling, dançarinos, DA). Subsequentemente, as membranas foram lavadas com tampão de TBST e incubadas com o anticorpo apropriado de rábano silvestre conjugado com peroxidase secundário (anti-IgG de coelho de cabra) (# 7074). As membranas foram desenvolvidos usando um kit de quimioluminescência aumentada (Super Signal Oeste Dura, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

acoplagem molecular computacional e estatística análises

A estrutura cristalina de raios-X do fator de necrose tumoral receptor 1 (TNF-R1) foi recuperada a partir do Protein Data Bank (PDB entrada 1NCF) e preparado utilizando o campo de força CHARM. Acoplagem foi realizada utilizando o módulo C-DOCKER de 4,1 software de descoberta Estúdio (Acceryls, San Diego, CA) para simular as interacções entre o composto e o TNF-R1. A energia de interação de ligação foi calculada usando o

in-situ

ferramenta de minimização de incorporar acoplamento flexível no local encaixado, seguindo um protocolo previamente descrito [17]. As análises estatísticas foram realizadas utilizando t-teste do estudante ou ANOVA com Bonferroni pós-teste em 5,02 software Prism para determinar diferenças significativas entre os grupos experimental e controle (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA), e a significância estatística foi definida como p ≤ 0,05 ou p ≤ 0,01.

resultados

efeito citotóxico do cicloartanos sobre HT-29 e câncer de Caco-2 cólon linhas celulares

a estrutura química do cicloartanos é mostrado na Figura 1. Ambos, HT-29 e Caco-2 as células foram tratadas com diferentes doses de 0.39-200 | iM do composto para 24, 48 e 72 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. Como mostrado na Figura 2, o composto reduziu a viabilidade celular de uma forma dose e dependente do tempo. Além disso, o CI

50 valores da cicloartanos foram 3-30 vezes inferior do que a da cisplatina chemodrug padrão (3,9-2000 ^ M) em cada ponto de tempo de tratamento, 42-862 vezes menores em comparação com 5-fluorouracilo em 24 e 48 horas de pontos de tempo, mas 16-27 vezes mais potente após 72 horas de tratamento (Tabela 1). A IC

50 valores obtidos foram utilizados como um guia para as experiências subsequentes.

O composto tem um cyclopentano por hidro fenantreno andaime com um anel de ciclopropano entre C-9 e -10. A cadeia lateral ligada a C-17 tem um substituinte do grupo hidroxilo em C-26.

Para cicloartanos (0,39-200 uM) no modelo HT-29 (A) e células Caco-2 (B) linhas, cisplatina (3,9-2000 ^ M) no modelo HT-29 (C) e Caco-2 (D) As linhas celulares em 24, 48 e 72 horas, 5-fluorouracilo (200-8 x 10

-6 mM) sobre linhas HT-29 e células Caco-2 em 24 (e), 48 (F) e 72 horas (G). As diferenças significativas estão indicadas: * p 0,05; ** P 0,01.

cicloartanos induz a paragem do ciclo celular e apoptose em células HT-29

Para avaliar o modo de morte celular causada pelo cicloartanos, HT-29 células cancerígenas do cólon foram tratados com o composto durante 24 horas. Em seguida, foi realizada a análise de citometria de fluxo de células que foram duplamente coradas com anexina-V e iodeto de propídio (PI). As células de controlo foram tratadas com veículo (0,1% v /v de DMSO

4) e a viabilidade celular tinha 99,4%, com 0,6% de células em apoptose. O tratamento com o composto a concentrações crescentes, a partir de 12,5 uM a 50 uM, causada viabilidade celular reduzida de 68,6% para 30,6% e um aumento concomitante na percentagem de células apoptóticas de 30,7% para 59,6% e a percentagem de células necróticas de 0,7% a 9,8% (Figura 3A)

(a) Percentagem de células que apresentam a translocação de fosfatidilserina, como medido pelo da superfície celular de ligação de anexina V e PI livre:. as células negativas para anexina V e são positivas para PI necrótica (Q1 ); células positivas tanto para anexina V e PI estão em apoptose tardia (Q2); As células negativas para ambos anexina V e PI (Q3) são células viáveis; e células positivas para anexina V e negativas para o PI estão em apoptose precoce (Q4). As células foram incubadas durante 24 horas com 0,1% v /v de DMSO

4 (controlo de veículo) ou o cicloartanos em concentrações de 12,5, 25 ou 50? M, tal como indicado. (B) A citometria de fluxo histogramas que mostram a distribuição de células em diferentes fases do ciclo celular (L

1, S e G

2 /M) no início da experiência (0 h) e aos 12, 24 e 48 horas de tratamento com 2,5 uM do cicloartanos. O resultado é representante de um dos três repetições que tiveram resultados essencialmente semelhantes.

Em seguida, investigamos o perfil do ciclo celular das células HT-29 tratado com cicloartanos. Como mostrado na Fig 3B, a citometria de fluxo mostrou um aumento dependente do tempo de células em G

1 fase, com 45,6%, 56,8%, 64,3% e 76,2% das células estarem em L uma fase após

0 , 12, 24 e 48 horas de tratamento, respectivamente.

cicloartanos induz a activação das caspases 3/7, 8 e 9

As caspases desempenhar um papel central na apoptose-indução, e como mostrado na Fig 4A, HT-29 células tratadas com o composto mostrou um aumento acentuado nas atividades de caspases 3/7, 8 e 9 de 6 a 12 horas. As suas actividades atingiu um máximo de 18 horas para a caspase 9 e 24 horas para a caspase 3/7 e 8, a que se seguiu uma tendência decrescente. Pré-tratamento com caspase 8 (Z-IED-FMK) ou um inibidor da pan-caspase (Z-VAD-FMK) seguido pela cicloartanos resultou em maior viabilidade celular do que em células sem pré-tratamento. No entanto, os inibidores de caspase 3 (Z-DEVD-FMK) e 9 (Z LEHD-FMK-) não resgatar as células da apoptose induzida por cicloartanos (Fig 4B).

curso (A) Tempo ( 0-30 horas) quadruplicou caspase 3/7, 8 e 9 atividades das células HT-29 após o tratamento com o cicloartanos (50 mM). (B) Efeitos de inibidores de caspases em células HT-29 foram tratados. Mudanças na caspase 3/7, 8 e 9 actividades e viabilidade celular de células pré-tratadas com caspase 3 inibidor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inibidor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inibidor (Z-LEHD -FMK) ou inibidor geral de caspases (Z-VAD-FMK), seguido de incubação com o cicloartanos (50 uM). Às 18 horas de tratamento, foram determinadas as actividades de caspase, e às 24 horas de tratamento a viabilidade celular foi medida. Todos os resultados são três determinações independentes, com aumentos de dobra e viabilidades celulares por cento calculado com base no controlo não tratado. Os símbolos indicam significativamente maior em comparação com 0 horas ou sem inibidor de pré-tratamento: * p 0,05; ** P 0,01.

Efeitos de cicloartanos na apoptose proteínas sinalizadoras

Em seguida, foram coletados lisados ​​de proteína em 6, 12, 18 e 24 horas após o tratamento com o cicloartanos e carregado-los para o a apoptose RayBio humano matriz para detectar os níveis de 43 proteínas que induzem apoptose. O maior aumento na expressão da proteína foi visto para a caspase 8, que aumentou de 2 a 4 vezes aos 12 e 18 horas de pontos de tempo. Caspase 3 e Bid aumentou apenas após 18 horas de tratamento do composto (Fig 5A e 5B).

(A), proteínas regulado positivamente detectadas na matriz de anticorpo humano apoptose. (B) Fold mudanças de moléculas de sinalização de apoptose, em comparação com o controlo com um limite de corte de 1,5 vezes. (C) análise de transferência de Western de proteínas apoptótica em cicloartanos tratados células HT-29 e de sinalização de TNF-α-tratado como controlo positivo para a translocação de NFkB através vários intervalos de tempo (6, 12, 18 e 24 horas).

lisados ​​de células inteiras de células tratadas com o cicloartanos foram recolhidas em diferentes intervalos de tempo e submetida a análise de transferência de Western. Consistente com os resultados de array de proteínas (Fig 5A e 5B), foram observados aumentos dependentes do tempo no Bid e caspase 3 clivada e 8 proteínas (Fig 5C). Além disso, o TNF-R1, FADD, e TRADD expressão de proteínas foram sobre-regulada, o que indica que o composto induziu a apoptose extrínseca através da via de sinalização do receptor do TNF-R1 (Fig 5C); sTNF-R1 também mostrou ser sobre-reguladas pelos resultados array de proteínas (Fig 5A e 5B). As proteínas pró-apoptóticas relacionados com mitocondriais Bax e Bad também aumentou significativamente a partir de 6 a 24 horas. Além disso, não se observou translocação de NF-kB do citoplasma para o núcleo ao longo do tempo e o nível de PARP clivada ao longo do tempo aumentou. As células tratadas com 10 ng /ml de TNF-α serviu como um controlo positivo para as experiências de translocação de NFkB (Fig 5C).

cicloartanos reduz o potencial de membrana mitocondrial (MMP), aumenta a libertação de citocromo c eventos e NFkB translocação

para examinar se o composto provoca danos mitocondrial e libertação de citocromo c, que trataram células HT-29 com o composto durante 24 horas e, em seguida, realizou uma análise de despistagem celular alto teor. Como mostrado na Fig 6A, o cicloartanos a 6,25 | iM e 12,5 uM diminuiu (P 0,01) MMP. Além disso, observou-se libertação de citocromo C no interior do citosol de células HT-29 tratadas com 6,25 uM do composto em comparação com o controlo não tratado (Fig 6B). Ao examinar se o composto em competir com o ligando natural, o TNF-α, a translocação de NFkB para o núcleo a jusante foi medida. Na Figura 6C, o tratamento de TNF-α (10 ng /mL) resultou num aumento de intensidade de fluorescência de NFkB (p 0,01) na região do núcleo. No entanto, o tratamento com cicloartanos (12,5 | iM) não de forma significativa (p 0,05) aumentar a intensidade de fluorescência de NFkB em comparação com o controlo. O tratamento de combinação de cicloartanos (12,5 ^ M) e TNF-α (10 ng /mL) resultou em um aumento significativo (p 0,05). diminuição da intensidade de NFkB de fluorescência em comparação com o tratamento de TNF-α sozinho

Imagens de (a) e gráfico de barras do potencial de membrana mitocondrial (MMP) diminuição. (B) O citocromo c localização (setas vermelhas) nas células de controle ou liberar a partir de células de cancro do cólon HT29 tratados com cicloartanos. intensidade da fluorescência (C) de NFkB na região do núcleo são semelhantes entre o controlo e as células tratadas com cicloartanos, reduzir a intensidade do tratamento de combinação cicloartanos e TNF-α ou aumentar a intensidade do TNF-α sozinho. As imagens foram capturadas a uma ampliação de 100X e diferenças significativas estão indicadas: * p 0,05; ** P . 0,01

Estudo do acoplamento cicloartanos para TNF-R1

acoplagem molecular computacional ilustrado a ligação do composto a TNF-R1 (Fig 7) e revelou uma energia de ligação total de – 67,032 kcal. O local de ligação para o cicloartanos em TNF-R1 é diferente do sítio ativo para o ligando natural, TNFa. O composto liga-se ao domínio extracelular perto da membrana celular. Observou-se a interacção hidrofóbica entre um dos grupos ciclo-hexano e ciclopentano das ligações compostos e de cisteína-96, e de hidrogénio formadas entre o hidroxilo em C-26 e os grupos carbonilo em C-3 do composto com lisina-75 e -132 do receptor, respectivamente.

Ampliação mostrando ligações de hidrogênio (verde linhas tracejadas) entre os grupos hidroxila e carbonila do composto com interações de lisina-75 e -132 e hidrofóbicas (linhas tracejadas roxo) entre o ciclohexano e ciclopentano do composto com cisteína-96 do receptor.

Discussão

Nossa triagem citotóxica anterior de um painel de linhas celulares de cancro mostrou que a cicloartanos é mais citotóxico para a linha de células de cancro do cólon HT- 29 [8]. Neste estudo, foram observados efeitos citotóxicos semelhantes em outra linha celular de cancro do cólon humano, Caco-2. Os resultados dos ensaios de MTS mostram que o tratamento com o composto causa uma redução da dose e dependente do tempo da viabilidade celular em ambas as células HT-29 e Caco-2. Como o IC

50 do composto foi menor para a linha de células HT-29, foram realizadas experiências adicionais em que a linha de células.

externalização de fosfatidilserina à superfície da célula é uma das marcas de apoptose [15 ]. A citometria de fluxo estudos mostraram um aumento dependente da concentração nas populações de células de anexina V-FITC em comparação com populações de células PI, indicando que este composto induz a apoptose em vez de necrose. Além disso, a acumulação de células em G

1 fase ao longo do tempo foi detectada por citometria de fluxo após o tratamento cicloartanos. crescimento celular normal e diferenciação exigir uma regulação adequada do ciclo celular. controlo do ciclo celular desregulado, devido a mutação, eliminação e a repressão da transcrição de genes, tais como FBXW7, pRB, e p53, tem sido mostrado para contribuir para a progressão do cancro colo-rectal [18-20]. Deste modo, inibir a progressão do ciclo celular poderia impedir a proliferação descontrolada de células cancerosas do cólon e levá-los para entrar apoptose

Outra característica da apoptose é a activação de caspases, e existem duas vias estabelecidas com base nas caspases iniciadoras:. O via de morte do receptor, o qual envolve a caspase-8, e a via mitocondrial, o que envolve a caspase-9 [16]. Início de uma ou ambas as caspases ativa a caspase carrasco (caspase 3/7), que acaba por conduzir à morte celular bem regulamentado. A incubação com o composto causa uma activação dependente do tempo de caspase 3/7 do 6

th hora em diante. O aumento da activação de caspase-8 foi concomitante com o aumento da activação de caspase-9, sugerindo o envolvimento de ambas as vias de receptor de morte e mitocondriais na indução de apoptose pela cicloartanos. No entanto, não está claro que a caspase é o iniciador primário de acordo com a tendência da activação da caspase. Para determinar isso, foi realizado um experimento inibidor de caspase. A caspase 8 inibidor (Z-IETD-FMK) foi capaz de suprimir a caspase 9 e 3/7 actividades que conduzam a um aumento em células viáveis. Portanto, caspase 8 é o iniciador primário, enquanto que a caspase 9 é um mediador secundário que amplifica o sinal apoptótico.

Outras investigações da via apoptótica por análise de array de proteínas demonstraram a libertação de factor de necrose tumoral solúvel receptor-1 ( sTNF-R1) a partir de extractos de células inteiras. A activação de TNF-R1 é acreditado para fazer com que a TACE metaloprotease para libertar o componente extracelular do receptor solúvel de TNF-R1 (sTNF-R1) [14], que leva a supor que o TNF-R1 foi accionado em caso de montante . A análise de transferência de Western de extracto de membrana celular das células tratadas confirmou a supra-regulação de TNF-R1. TNF-R1 pertence à família dos receptores de morte, e a cauda citoplasmática de TNF-R1 contém um domínio de morte (DD), que é essencial para a indução de apoptose [21, 22]. Os estudos revelaram que o TNF-R1 activa o programa apoptótico por recrutamento sequencial da proteína adaptadora TRADD, a TRADD-interagindo proteína adaptadora FADD e a proteína ICE FADD-like (FLICE, também chamados pró-caspase-8) para formar a morte de indução sinalização complexo (DISC) [23, 24]. A activação do receptor de TNF-R1 pela drogas foi mostrada para aumentar a eficiência de tratamento em ambas as linhas celulares resistentes a drogas e células de carcinoma primário [25].

activação de TNF-R1 ainda mais induz Bid, que activa Bad e Bax , fazendo com que o potencial de membrana mitocondrial para diminuir, citocromo c para ser lançado e caspase 9 para ser activado. O papel de proposta e Bad na transdução de sinais a partir de receptores de morte apoptóticos para a via intrínseca mitocôndrias envolve a amplificação dos sinais apoptóticos [26]. Bad e Bax pertencem aos membros da família Bcl-2, que regulam a morte celular e sobrevivência. Por exemplo, a sobre-regulação de Bax tem sido demonstrado que induz a apoptose através da redução da permeabilidade mitocondrial para a libertação de citocromo c [27]. A consequência da libertação de citocromo C e a activação da caspase 9 é a activação de caspases a jusante 3 e 7, o que provoca a clivagem de PARP e conduz à morte apoptótica sem a translocação de NFkB para o núcleo. Além disso marcação por fluorescência de NFkB revelou que o composto não foi significativamente (p 0,05) aumentar a translocação de NFkB para o núcleo em comparação com o controlo.