Abstract

O principal problema decorrente do câncer de próstata (PCA) é a sua propensão a metástase em ossos. MicroRNAs (miARNs) desempenham um papel crucial em muitas metástases tumorais. A importância de miARNs em metástases ósseas de CaP não foi elucidado até à data. Investigou-se a expressão de determinados miARNs foi associado com a metástase óssea de CaP. Foram examinados os perfis de expressão de miRNA de amostras de CaP metastático 6 primárias e 7 ósseas pela análise microarray miRNA. A expressão de 5 miRNAs significativamente diminuída na metástase óssea em comparação com PCA primária, incluindo miRs-508-5p, -145, -143, -33 e -100. Examinamos ainda outras amostras de 16 CaP primária e 13 metástases ósseas através da análise de PCR em tempo real. As expressões de miRs-143 e -145 foram verificadas para regular negativamente de forma significativa em amostras de metástases. Ao investigar relação dos níveis de miRs-143 e -145 com características clinicopatológicas dos pacientes APC, encontramos down-regulamentação da miRs-143 e -145 foram negativamente correlacionados com metástase óssea, o escore de Gleason e nível de PSA livre em CaP primária . Sobre-expressão de miR-143 e -145 por transfecção retrovírus reduzida a capacidade de migração e invasão

in vitro

e desenvolvimento do tumor e invasão óssea

in vivo

de células PC-3, um ser humano linha de células CaP originado a partir de uma amostra de metastático CaP óssea. A sua sobre-regulação também o aumento da expressão de E-caderina e a diminuição da expressão de fibronectina de células PC-3 revelou que um fenótipo morfológico menos invasiva. Estes resultados indicam que miRs-143 e -145 está associado com a metástase óssea de CaP e sugerem que eles podem desempenhar papéis importantes na metástase óssea e estar envolvido na regulação da EMT Ambos também podem ser clinicamente utilizados como novos biomarcadores para discriminar diferentes estágios de CaP humana e prever a metástase óssea

Citation:. Peng X, Guo W, Liu T, Wang X, Tu X, Xiong D, et al. (2011) Identificação de miRs-143 e -145 que está associado com metástase óssea do câncer de próstata e envolvido na regulação da EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10.1371 /journal.pone.0020341

editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, França |

Recebido: 27 Janeiro, 2011; Aceito: 21 de abril de 2011; Publicado em: 27 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. NSFC- financiamento Guangdong conjunta, China (No. u0732001); Natural Science Foundation da província de Guangdong, China (No. 06021290); Ciência e projeto de planejamento Tecnologia da Província de Guangdong, China (No. 2008B030301037) e Ciência e Tecnologia Projeto Planejamento de Zhuhai, China (2009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O autor Tiejian Liu é empregado por uma empresa comercial, Laura Biotech Co., Ltd ., e se juntou a grupo de pesquisa dos autores por motivos particulares. Devido ao seu trabalho no grupo de pesquisa, ele vai ganhar experiência significativa, que será útil para o seu pedido de seu PhD. Este artigo não tem nenhuma relevância comercial em termos de Laura Biotech, e os dados e resultados detalhados aqui não têm relação com essa empresa. Os autores confirmam que isso não altera a sua adesão a todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é o mais frequentemente diagnosticado tumor maligno ea segunda principal causa de mortes por câncer nos países ocidentais [1]. O principal problema decorrente da PCA é a sua propensão para metástase para os ossos. metástases ósseas ocorrem em até 90% dos pacientes com CaP avançado. Importante, uma vez que os tumores metastizar para o osso, eles são praticamente incurável e resultam em morbidade significativa antes da morte do paciente [2], [3]. É muito importante compreender o mecanismo da formação de metástases para a prevenção de metástases e desenvolvimento de terapias anti-metastáticos que podem proporcionar redução adicional sobre a morbidade e mortalidade de pacientes APC.

metástase esquelética de tumor é um multi-etapa complicada processo que inclui o desengate celular e a motilidade do microambiente local, degradação da matriz extracelular que rodeia, movimento celular, preso em capilares, extravasar e distais finalmente proliferam para formar tumores ósseos secundários distantes. Todos estes processos são regulados por múltiplos factores e vias moleculares [4]. Apesar de conhecimentos básicos relacionados a esse processo estruturado tem aumentado recentemente, muitos dos elementos-chave ainda são mal compreendidos.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes reguladoras (19-25 nucleotídeos) expressas por plantas e animais envolvidos na regulação da expressão gênica. Eles exercem a sua função através da ligação à região 3 ‘não traduzida de um subconjunto dos ARNm, resultando na sua degradação ou repressão da tradução [5]. análises de bioinformática previram que único miRNA tem múltiplos alvos, e, assim, miRNAs poderia mediar a regulação de um grande número de genes codificadores de proteínas. Estimativas recentes sugerem que um terço de mRNAs humanos pode ser regulada por miARNs [6], [7]. miARNs têm sido mostrados para interferir funções celulares tais como a proliferação celular, diferenciação celular e apoptose [8].

Muitos relatórios têm elucidado o papel de determinadas miARNs como promotores ou supressores de tumores [9], [10] , [11]. Um número cada vez maior de observações também dá uma evidências colectivos que coordenam miARNs alguns dos programas de expressão genética intrincados e desempenham um papel crucial na metástase tumoral [12]. miARN pode influenciar vários passos da cascata metastática, tais como migração de células de tumor, invasão e intravasamento. Por exemplo, o cancro da mama é um dos mais importantes contribuintes de metástases ósseas [13]. Uma série de microARNs foram identificados como factores de metástase, incluindo let-7, miR-9, miR-10b, o miR-21, o miR-373, miR-520c, e miR-103/107 [12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Por outro lado, o miR-335, o miR-206, miR-31, o miR-145, o miR-661 e miR-126 foram identificados como miARNs metástase supressores de cancro da mama humano [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].

Na APC, vários miRNAs foram identificados como mediadores da metástase. Demonstrou-se que a desregulação de miR-221 e miR-222 foi associada com a progressão da APC, prognóstico reservado, e o desenvolvimento de metástases [28]. miR-21 foi também sobre-expressa em APC e actua como um regulador chave oncogénica que contribui para o crescimento tumoral, invasão e metástase [29], [30], [31]. Um estudo revelou que o miR-146a tem como alvo ROCK1, e níveis elevados de ROCK1 promover a proliferação celular, invasão e metástase nas células CaP [32]. Além disso, a perda genómico de miR-101 em CaP humano, envolvidos na progressão do cancro, leva à sobre-expressão de EZH2 [33], [34]. No entanto, a importância da miARNs em metástases ósseas de CaP não foi elucidado até à data.

epitelial-mesenquimal transição (EMT) é uma certa via de sinal de descrever um passo chave da progressão de metástases de células de tumor que inclui processos consecutivos de células-descolamento, que migram, invadindo, dispersantes e residentes final [35]. Tem sido identificada como uma característica de metástases em múltiplos tumores, conectando a abundância de factores de transcrição [36], [37], [38], [39]. miARNs também são componentes dos circuitos de sinalização celular que regula o programa EMT [40]. Um trabalho recente demonstrou vários miRNAs, incluindo a família miR-200 e miR-205, desempenhou um papel crítico na EMT [41], [42]. Até agora, o papel preciso de miRNAs na regulação da EMT ainda é incerto.

Para investigar o papel dos miRNAs em metástases ósseas de CaP e sua relação com EMT, é, em primeiro lugar precisam saber expressão miRNA profiling no primário e osso CaP metastático. No presente estudo, foram comparados os perfis de expressão de miRNA em CaP metastático primário e ossos de humanos e miRs-143 e -145 relacionadas com metástases ósseas identificadas. Além disso, demonstramos que os upregulations de miRs-143 e -145 reprimida migração e invasão

in vitro

, o desenvolvimento do tumor e invasão óssea

in vivo

e EMT de células PC-3, um linha de células CaP humana se originou de um osso espécime CaP metastático.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

As amostras de tecido de dois grupos de pacientes CaP foram estudados. CaP tecidos primários foram de prostatectomia transuretral ou a ressecção no tratamento de carcinoma da próstata local. tecidos metastáticos esquelético de CaP eram da operação no tratamento de metástases ósseas. Todas as amostras foram fixadas em formol e (FFPE), com procedimentos padrão incluído em parafina. Regiões de amostras de tecido 70% de tecido canceroso foram utilizados para a extracção de ARN total. O diagnóstico histológico foi feito por um patologista e foi confirmada por um segundo patologista (D. H.). metástase óssea foi diagnosticada de acordo com sintoma clínico e sinal, cintilografia óssea, radiografia, tomografia computadorizada e ressonância magnética. Nenhum dos pacientes havia recebido hormonal neoadjuvante, a radiação ou quimioterapia antes de começar os tecidos tumorais. A informação clínica foi revisto sobre a idade, metástase óssea, o nível de PSA total, nível de PSA livre ea pontuação de Gleason em pacientes CaP primários. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética Institucional (IRB) no Primeiro Hospital Filiado de Sun Yat-sen University e consentida pelos pacientes envolvidos.

RNA extração

Todas as amostras foram enviadas para CapitalBio Corp . e ARN total de amostras de tecido FFPE foi isolado como anteriormente descrito [43]. Em resumo, as amostras de tecido foram cortadas em fatias a partir de blocos de parafina e colocadas em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga livre de nuclease (Eppendorf), em seguida, desparafinadas três vezes em 1 mL de limoneno, seguido por lavagem com 1 mL de etanol a 100% por duas vezes e secagem ao ar a sala temperatura. As amostras foram então incubadas com tampão de digestão (20 mM de Tris-HCl, EDTA 10 mM, SDS a 1%) e proteinase K (Merck) a 55 ° C durante a noite, a fim de se obter uma digestão completa das amostras. Subsequentemente, foi adicionado o reagente TRIzol (Invitrogen), e o restante do protocolo foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de ARN foram novamente suspensos em água isenta de RNase após o passo de precipitação final. qualidade e quantidade de RNA foram avaliadas com BioPhotometer (Eppendorf).

análise Microarray

amostras de RNA total foram analisados ​​por CapitalBio (CapitalBio Corp.) para experimentos de microarray miRNA. Cada chip microarray miRNA continha 924 sondas em triplicado, correspondendo a 677 humana (incluindo 122 previu miRNAs), 461 mouse e 292 miRNAs rato encontrado no Registro miRNA (https://microrna.sanger.ac.uk; miRBase lançamento 10.0, 2007). Os procedimentos foram realizados como descrito em detalhes no site da CapitalBio (https://www.capitalbio.com). Resumidamente, o ARN-baixo peso molecular (LMW-RNA) foi isolado usando o método PEG solução de precipitação de acordo com um protocolo anterior [44]. LMW-ARN foi desfosforilado por fosfatase alcalina (NEB) no primeiro, seguindo o protocolo dado por Wang H, et al. [45]. Em seguida, o desfosforilado LMW-ARN foi marcado com 500 ng de 5′-fosfato-cytidyl-uridil-cy3-3 ‘(Dharmacon) com ligase de ARN de 2 unidades de T4 (NEB) [44]. ARN marcado foi precipitado com acetato de sódio 0,3 M, 2,5 volumes de etanol e ressuspensa em 20 ul de tampão de hibridação contendo 3 x SSC, 0,2% SDS e 15% de formamida. A matriz foi hibridada a 42 ° C durante a noite e lavou-se com duas soluções de lavagem consecutivos (0,2% de SDS, 2 x SSC a 42 ° C durante 4 min, e 0,2% SSC durante 4 minutos à temperatura ambiente). Arrays foram digitalizadas com um scanner a laser de duplo canal (LuxScan 10K /A, CapitalBio). A configuração da digitalização foi ajustada para se obter uma intensidade igual de pontos visualizados U6 ao longo das matrizes. Os dados foram extraídos das imagens TIFF usando LuxScanTM software 3.0 (CapitalBio Corp). Os dados brutos foram normalizados e analisados ​​utilizando a análise da significância dos microarrays (SAM, versão 2.1, da Universidade de Stanford, CA, EUA) software. análise de agrupamento foi realizada por Cluster 3.0 [46]. Todos os dados são Miame compatível e que os dados brutos foi depositado em um banco de dados compatível Miame (GEO, ID adesão: GSE26964).

quantitativa transcrição reversa-PCR

O cDNA obtido utilizando TaqMan miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia). Resumidamente, miRNA foi transcrito de forma inversa utilizando iniciadores sequência específica haste-laço (Invitrogen) com as seguintes miRNAs: hsa-miR-125b, hsa-miR-145, hsa-miR-153, hsa-miR-210, hsa-miR-143 , hsa-miR-100, hsa-miR-363, hsa-miR-451, hsa-miR-572 e miR-HSA-508-5p, com base na análise microarray e seus genes-alvo previstos. A reacção foi realizada com os seguintes valores de parâmetros: 15 min a 37 ° C, 10 minutos a 65 ° C, 5 min a 85 ° C, e -20 ° C até à sua utilização. a análise por PCR em tempo real foi realizada num Sistema de Detecção de PCR IQ5 Tempo Real (Bio-Rad) com reacção volume de 20 ul contendo 2 ul de produtos de transcrição reversa, de 10 uL de 2 × all-in-one ™ Q-PCR mistura, 2 mL de PCR Adiante iniciador (2? M), 2 uL Iniciador de PCR adaptador universal (2 ^ M), 4 mL ddH2O. As reacções foram incubadas em placas de 96 poços a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos, e depois subiu de 66 ° C a 95 ° C para se obter a curva de fusão. Cada amostra foi analisada em triplicado. Nenhum modelo e sem a transcrição reversa foram incluídos como controlos negativos. U6 snRNA foi utilizado como controlo de normalização. Os valores de expressão relativa de três experimentos independentes foram calculados após a 2

-ΔΔCt método de Schmittgen e Livak [47].

ácido nucleico Locked (LNA) hibridização in situ

O procedimento foi realizada como previamente descrito [48]. Resumidamente, secções de tecido embebidas em parafina foram desparafinadas, desidratados, em seguida, tratada com proteinase K (20 ug /ml; Roche) a 37 ° C durante 30 min. Depois lavou-se por 0,2% de glicina /PBS durante 1 min e fixadas com paraformaldeído a 4%, as secções foram incubadas em tampão de hibridação (formamida 50%, 5 × SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para ajuste a pH 6,0, 50 ug /mL de heparina, 500 ug /ml de ARN de levedura), a 37 ° C durante 2 h. Foram adicionados Digoxigenina-marcada, as sondas modificado com LNA de miR-143 (20 nmol /L;; 5′-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 ‘, Exiqon) e miR-145 (5′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3 20 nmol /L’, Exiqon) , respectivamente, e incubou-se a 55 ° C durante 18 h. As secções foram lavadas com 2 x SSC duas vezes, em seguida, com 2 x SSC e 50% de formamida a 50 ° C três vezes (30 minutos cada). O anticorpo anti-DIG-AP (1:1000, Roche) foi adicionado após lavagem com PBS-T (0,1% de Tween 20) e incubou-se a 4 ° C durante a noite. As secções foram lavadas quatro vezes com PBS-T, e fosfato de cloreto de tetrazólio nitroazul /5-bromo-4-cloro-3-indonyl foi utilizado para a mancha.

Cultura celular

linhas celulares metastático CaP incluídos PC-3 e LNCaP no presente estudo. PC-3 foi adquirido a American Type Culture Collection (ATCC) e mantida em meio F-12 de cultura (Hyclone), complementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone). LNCaP foi adquirido a partir de Xangai Cell Bank, Academia Chinesa de Ciências, e mantidas em meio RPMI-1640 cultura (Gibico, Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone). As células estavelmente transf ectadas foram mantidas em meios com a presença de puromicina (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C.

Geração de linhas celulares transfectadas de forma estável

A sequência de pri-miR-143 e miR-pri -145 foram clonados no plasmídeo pMSCV-puromicina com a enzima de restrição Bgl II e Eco RI (New England Biolabs). 293FT células foram então transfectadas com plasmídeos construídos acima mencionados combinados com vector vazio ou PIK pMSCV-vector, como controlo, utilizando o método do fosfato de cálcio como descrito anteriormente [49]. Após incubação a 37 ° C durante 6 h após a transfecção, os meios foram mudados e as células foram incubadas durante a noite. Para produzir novos vírus, os meios de comunicação foram coletadas três vezes por dia até 293FT células atingem a confluência total. Os vírus são usados ​​para infectar células PC-3 e LNCaP. 24 h após a adição de vírus, as células infectadas foram seleccionadas por adição de puromicina ao meio de crescimento. As linhas celulares estáveis ​​foram verificadas por qRT-PCR. Ambos os plasmídeos pMSCV e PIK foram concedidos pela generosa Prof. Canção LB, Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, China.

cicatrização de feridas ensaio

Um dia antes de zero, linhas celulares estáveis ​​de As células PC-3 e LNCaP foram tripsinizadas e semeadas igualmente em placas de 6 poços de cultura de tecidos, e cresceu para atingir confluência quase total em 24 h. Quando a fome não-soro, mantido por 24 horas após a monocamada de células formadas, uma ferida homogênea artificial foi criado para a monocamada com uma ponta de 100 mL estéril. Depois de riscar, as células foram lavadas com meio isento de soro. Imagens de células que migram para dentro da ferida foram capturados em pontos de tempo de 0 h, 6 h, 12 he 24 h por microscópio invertido (40 vezes).

In vitro

ensaio de invasão

O ensaio de invasão foi feito usando câmara Transwell consistindo de 8 uM inserções de filtro de membrana (Corning), revestida com Matrigel (BD Biosciences) como anteriormente descrito [50]. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e suspensas em meio isento de soro. Em seguida, 1,5 × 10

5 células foram adicionadas à câmara superior, enquanto a câmara inferior foi preenchida com o meio com FBS a 10%. Depois incubou-se durante 48 h, as células foram invadidas através da membrana revestida para a superfície inferior, em que as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com hematoxilina. A contagem das células foi feito sob o microscópio (100 ×).

ensaio de adesão

O ensaio de ades foi realizado como descrito anteriormente [51]. Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidas com fibronectina de 50 ul (50 ug /ml) em meio de células original a incubadora durante 1 h. Depois lavou-se com meios quentes, as placas foram bloqueadas com 1% de BSA a 37 ° C durante 1 h e lavadas duas vezes. Após tripsinização, as células em suspensão foram semeadas em cada cavidade com meio isento de soro a uma densidade de 1,5 x 10

4 células por poço. Quando as placas incubadas durante 30 minutos, as células não-aderentes foram removidas e as placas foram suavemente lavadas duas vezes com PBS. As células aderentes foram fixadas em 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente, em seguida, coradas com hematoxilina e contadas sob microscópio invertido (100 ×).

Western blotting

Para a análise da expressão EMT- proteínas relacionadas, o ensaio de imunotransferência foi realizada. Todas as linhas de células estáveis, incluindo PC-3 /vector, PC-3 /miR-143, PC-3 /miR-145, LNCaP /vector, LNCaP /miR-143 e LNCaP /miR-145, foram semeadas em placas de 100 mm placas de cultura de tecido. Após 24 h, as células foram lavadas com PBS pré-arrefecido a confluência quando atingiu a 60-70%, seguido de serem colhidas em tampão de amostra [62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 2% de SDS, 10% de glicerol, e 5 % de 2-mercaptoetanol-β]. Quantidades iguais de proteína a partir do sobrenadante foram carregados por pista e resolvido por electroforese em SDS-poliacrilamida. Em sequência, proteína foi transferida para uma membrana de PVDF (Millipore), bloqueados por leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente, e sondados com os anticorpos primários (1:1000) durante 3 h, incluindo ratinho anti-E-caderina (BD Biosciences ), rato anti-fibronectina (BD Biosciences) e rato anti-vimentina (BD Biosciences). As membranas foram lavadas três vezes (10 minutos cada) em tampão de TBS-T, e incubadas durante 40 min à temperatura ambiente com os anticorpos secundários anti-ratinho conjugados com peroxidase de rábano. As membranas foram lavadas três vezes (10 minutos cada) em TBS-T, e desenvolvidos utilizando o sistema ECL. carga de proteína foi normalizada por reprobing as manchas com anticorpo de rato anti-α-tubulina (Abcam).

In vivo

modelos de câncer de próstata metástase óssea

injecção intra-tibial foi utilizado um modelo. dez camundongos machos grave imunodeficiência combinada (SCID) de 3~4 semanas de idade foram adquiridos de HFK Bio-Technology.CO., LTD (Pequim, China). Antes da inoculação, PC-3 de células foram ressuspensas em meio de 40 mL livre de serun F-12 a uma densidade de 2 × 10

5 células por 40 ul, e injectada com uma agulha de calibre 26 na tíbia com um movimento de perfuração . Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos de igual modo, quando cada um 5 animais foram tratados com o PC-3 /miR-143 ou PC-3 /miR-145 nas tíbias direita, respectivamente. Todos os 10 camundongos foram injetados com PC-3 /vetor na tíbia esquerda como auto-controle. Os ratinhos foram monitorizados semanalmente para o crescimento do tumor. Na semana 5, os membros posteriores foram radiografadas utilizando um aparelho de raios-X Faxitron (Faxitron X-ray Corp., EUA) para detectar as lesões ósseas. Em seguida, os ratinhos foram sacrificados, e as tíbias foram recolhidos, descalcificadas e fixados em formalina para análise histológica. As lesões ósseas foram avaliados e calculado como descrito como descrito anteriormente [52], em que 0 grau para nenhuma lesão, 1 para lesões menores, 2 para pequenas lesões, 3 para lesões significativas com menor quebra das margens, e 4 para lesões significativas com grande quebra em lesões periféricas.

a análise estatística

Para determinar a expressão diferente de miRNAs em Microarray, análise Significado dos Microarrays (SAM, versão 2.1) foi realizada utilizando duas classes comparação não pareado no procedimento SAM. Significativamente miRNAs diferencialmente expressos foi selecionado como seguintes normas: | Score (d) | ≥2 [Numerator (r) /Denominador (s + s0)], Dobre Change≥2 ou ≤0.5 e q-valor (%) ≤5 ( taxa de falsa descoberta, FDR) em metástases ósseas de CaP em comparação com CaP primário.

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (SD). As estatísticas foram avaliadas usando SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Na PCR em tempo real e as experiências com animais, os dados foram comparados por Student

t-teste

. A relação entre a expressão de miRNA-regulado para baixo e características clínico-patológicas em CaP primário e metástases ósseas foi analisada pelo teste de correlação de Spearman. Em experimentos de metástases à base de ensaio, os dados foram analisados ​​com a ANOVA one-way. Para entender a relação entre miRNAs, as correlações significativas foram determinadas usando o teste de correlação de Kendall.

p

-Valores de . 0,05 foram considerados significativos

Resultados

expressão miRNA perfilar entre CaP primário e metástases ósseas por análise de microarray

Para investigar se miRNAs são diferencialmente expressos em CaP primário e osso tecidos metastáticos, foram coletadas seis correspondência pares de tecidos primários e metastáticos (do mesmo paciente) e compararam seus perfis de expressão utilizando um microarray miRNA. Uma vez que o ARN total em cinco pares de amostras não foi o suficiente para uma experiência de microarray, apenas a-par correspondente de amostras foi realizada com sucesso com um experimento de microarray. Observou-se, obviamente, a expressão aumentada de 18 miRNAs em metástase óssea em comparação com PCA primária, incluindo miRs-451, -210, -141, -19b, -29b, -16, -20, -30b, -193a-3p, -15 , -181a, -26b, -200, -106b, -20b, -486-5p, -15b, -363. A expressão dos três miARNs (miRs-145, -143, -612) foi obviamente diminuição na metástase óssea, especialmente a expressão de miR-145 e miR-143 com a redução de 5,4 vezes e 2,7 vezes, respectivamente.

a fim de determinar ainda se a expressão dos miRNAs teve diferença estatisticamente em CaP primário e tecidos com metástases ósseas, comparamos a expressão miRNAs em 6 amostras de CaP primárias e 7 ósseas amostras metastático usando um microarray miRNA. Descobrimos que a expressão de 5 miARNs tinha estatisticamente significativa diminuição na metástase óssea em comparação com o APC primária, incluindo miRs-508-5p, -145, -143, -100 e -33 com a redução de 4,1 vezes, 8,1 vezes, 5,7 vezes, 3,2 vezes e 5,3 vezes, respectivamente. Nenhuma expressão miRNA foi significativamente aumentada (Tabela 1).

Tomado todos os dados juntos, temos reanalisados ​​os dados de 10 miRNAs, incluindo expressão miRs-508-5p, -143, -145, -100 , -125b, -153, -210, -363, -451 e -572, pela análise de agrupamento (Figura 1

A

).

A,

O certificado resultado da análise de microarray.

B,

em tempo real ensaios de RT-PCR em miR-143 (painel esquerdo), miR-145 (painel direito), e miR-125b (painel inferior) em 16 cancro da próstata primário e 13 tecidos metástase óssea . A ordem das amostras de tecido é o mesmo para todos os três lotes.

p

-Valores pelo

t-teste

.

Verificação de dados de microarranjos de miRNA por análise em tempo real PCR em CaP primário e metástases ósseas

para confirmar os dados obtidos de microarray, PCR em tempo real foi realizado para analisar a expressão dos miARNs mais significativamente regulados, incluindo miRs-508-5p, -143, -145, -100 e -33. Foi examinada a expressão de miARN acima de 16 amostras independentes de CaP primária e 13 metástases ósseas, que não tinha sido usado para a análise de micro-arranjo. Após o nível de miARN individual em cada amostra foi quantificado e normalizado para expressão U6, em tempo real de dados de PCR confirmou que a expressão de miRs-145, -143, -100 e -33 com a redução de 17,3 vezes, 12,9 vezes, 1,7 fold e 1,7 vezes nos tecidos com metástases ósseas, respectivamente. Os níveis de miRs-143 e -145 expressão foram sub-regulada de forma significativa em amostras de metástases contra CaP primário (

P

= 0,012 e P = 0,014, respectivamente) (Figura 1

B

). No entanto, a expressão de miRs-33a e -100 não teve significância estatística (

p

= 0,236 e

p

= 0,448, respectivamente). miR-508-5p não expressou em todas as amostras de CaP primários e metastáticos amostras ósseas. Embora a expressão de miRs-125b, -153, -210, -363, -451 e -572 foi sobre as mudanças de 2 vezes na metástase óssea em comparação com em amostras primárias APC no microarrays análise, não houve diferença estatisticamente significativa, exceto para o expressão de miR-125b com a redução de 3 vezes nos tecidos ósseos metastáticos por análise de PCR em tempo real. Este foi estatisticamente significativa diminuição da regulação em amostras com metástases ósseas (

p

= 0,012) (Figura 1

B

). Assim, os resultados indicaram que houve uma diminuição da regulação significativa da miRs-145, -143, e quando os tumores -125b CaP metastizado para o osso.

para continuar a identificar as principais fontes de expressão em amostras de CaP primárias, o técnica LNA-ISH foi aplicado. Os resultados mostraram que miRs-143 e -145 expresso principalmente nas células cancerosas e a sua expressão nas células estromais foram inferiores ou ausente (Figura 2).

Secções no painel superior revelou a identificação de células tumorais e do estroma células por H e-stainning. Seções no painel inferior mostrou a localização de miR-143 (à esquerda) e miR-145 (à direita) em células CaP por LNA-ISH. Sinais de miRs-143 e -145 estavam em azul, púrpura. Fotos foram tiradas sob o microscópio 200 ×.

A expressão relativa de miRs-143 e -145 na mesma amostra

Para investigar se a tendência de miR-145 e miR- expressão 143 foi idêntica na mesma amostra, a expressão relativa de miR-145 e miR-143 na mesma amostra foi traçada a partir da PCR em tempo real em todas as 22 amostras de CaP primária (incluindo 6 amostras de microarray) (Figura 3

A

) e 20 amostras de metástases ósseas (incluindo 7 amostras de microarray) (Figura 3

B

), respectivamente. As correlações significativas de miR-145 e miR-143 foram encontrados em CaP primário (correlação Kendall = 0,850,

p Art 0,001) e metástases ósseas (correlação Kendall = 0,765,

p

.. 0.001)

A-B,

expressões de miRs-143 e -145 e suas relações em amostras primárias de câncer de próstata (A) e amostras de metástase óssea (B)

regulação negativa do miRs-143 e -145 está negativamente correlacionada com metástase óssea, nível sérico de PSA e a pontuação de Gleason na primária

CaP

Uma vez que descobrimos que miRs-143 e -145 foi regulada negativamente em metástase óssea, postulamos que a regulação negativa da miRs-143 e -145 também pode estar associado a características clínico-patológicas de pacientes APC. Em primeiro lugar, foi realizada uma investigação retrospectiva de 22 pacientes com PCA primário. Os resultados mostraram 12 pacientes sem metástases ósseas e 10 pacientes com metástases ósseas. A distribuição de idade em 22 pacientes com e sem metástases ósseas houve diferença significativa. A expressão de miRs-143 e -145 em 10 pacientes com metástases ósseas foi significativamente menor do que em 12 pacientes sem metástases ósseas (

p = 0,039

e

p

= 0,041, Figura 4,

A

e

D

). Em segundo lugar, avaliamos se a expressão de miRs-143 e -145 foi relacionada ao nível sérico total antigénio específico da próstata (PSA) e nível de PSA livre em CaP primário. Os resultados mostraram correlações inversa significativa entre a expressão de miRs-143 e -145 e nível de PSA livre (Spearman de correlação = -0,501,

p

= 0,018; Spearman de correlação = -0,536,

p

= 0,010. Figura 4,

B Comprar e

e), e uma significativa correlação inversa entre a expressão de miR-145 e nível total PSA (Spearman de correlação = -0,456,

p

= 0,033, Figura 4

F

); Considerando que não há correlação entre a expressão de miR-143 e nível total PSA (Spearman de correlação = -0,403,

p

= 0,063). Finalmente, nós investigamos se a expressão de miRs-143 e -145 foi relacionada com a pontuação de Gleason em CaP primário. Há também uma correlação inversa estatisticamente significativa entre a expressão de miRs-143 e -145 e pontuação de Gleason (Spearman de correlação = -0,574,

p

= 0,005; correlação de Spearman = -0,546,

p

= 0,009, Figura 4,

C Comprar e

G

). Estes resultados indicaram que downregulations de miRs-143 e -145 foram associados com a progressão do tumor e metástases ósseas. Regulação baixa de miR-125b não se correlacionou com metástase óssea, nível de PSA e a pontuação de Gleason em primárias CaP (dados não mostrados).

A e D,

A expressão de miRs-143 ou -145 nos pacientes com metástases ósseas foi significativamente menor do que sem metástases (

t-teste

,

p

= 0,039,

p

= 0,041, respectivamente).

B e E, as amostras tumorais

foram divididos em quatro grupos com tamanhos de amostra aproximadamente iguais com base no nível de PSA livre. O nível de PSA livre em pacientes com tumor primário é apresentada no eixo x. O eixo y representa a média de miRs-143 ou -145 dentro de cada grupo. As barras representam erros padrão. Houve uma correlação estatisticamente significativa Spearman que caracterizou uma relação inversa entre miRs-143 ou -145 expressão e PSA livre (Spearman de correlação = -0,501,

p

= 0,018; Spearman de correlação = -0,536,

p

= 0,010).

F,

O nível de PSA total também está correlacionada com miR-145 (Spearman de correlação = -0,456,

p

= 0,033).

C e G,

As pontuações Gleason do grupo tumor primário são apresentados no eixo x. O eixo y representa a média de miRs-143 ou -145 dentro de cada grupo. As barras representam erros padrão.