Abstract

Fundo

metástase óssea é a forma mais letal de diversos tipos de câncer. O β2-microglobulina (β2-H) /hemocromatose (HFE) complexo desempenha um papel importante no desenvolvimento do cancro e metástases ósseas. Foi demonstrado anteriormente que a sobre-expressão de β2-H na próstata, mama, pulmão e cancro renal leva ao aumento da metástase óssea em modelos de ratos. Portanto, a hipótese de que β2-M é um alvo racional para tratar a próstata metástases ósseas de câncer.

Resultados

Neste estudo, demonstramos o papel de β2-M e do seu parceiro de ligação, HFE , na modulação da sensibilidade à radiação e quimio-sensibilidade do câncer de próstata. Por eliminação genética de β2-M ou HFE ou utilizando um anticorpo anti-β2-M (Ab), demonstramos que as células de câncer de próstata são sensíveis à radiação

in vitro

e

in vivo

. A inibição da β2-M ou HFE sensibilizados células cancerosas da próstata à radiação, aumentando ferro e espécies reativas de oxigênio e diminuindo o reparo do DNA e as proteínas de resposta ao estresse. Usando o modelo de xenoenxerto de ratinho, que demonstram que os anticorpos anti-M-Ab β2 sensibiliza as células de cancro da próstata para tratamento por radiação. Além disso, anti-β2-M Ab foi capaz de prevenir o crescimento do tumor em um modelo de ratinho imunocompetente espontânea do cancro da próstata. Uma vez que a metástase óssea é letal, foi utilizado um modelo de xenoenxerto de osso para testar a capacidade de anticorpos anti-M-Ab β2 e radiação para bloquear o crescimento tumoral no osso. O tratamento de combinação impediu significativamente o crescimento do tumor no modelo de xenoenxerto de osso por inibição β2-H e induzindo a sobrecarga de ferro. Além dos efeitos sensíveis de radiação, a inibição da β2-M sensibilizados células cancerosas da próstata aos agentes quimioterápicos.

Conclusão

Uma vez que os doentes metastáticos de câncer de próstata ósseos têm alta β2-M no tecido tumoral e na a forma segregada, a segmentação β2-M e anti-β2-M Ab é um agente terapêutico promissor. Além disso, a inibição da β2-M sensibiliza células cancerosas para terapias clinicamente utilizadas, tais como a radiação através da indução de sobrecarga de ferro e diminuindo as enzimas de reparo do DNA

Citation:. Josson S, Matsuoka Y, Gururajan M, Nomura T, Huang WC, Yang X, et al. (2013) Inibição da β2-microglobulina /Hemocromatose Melhora a radiação Sensibilidade por Indução de sobrecarga de ferro em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (7): e68366. doi: 10.1371 /journal.pone.0068366

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril 2013; Aceito: 16 de maio de 2013; Publicação: 10 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Josson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte por bolsas de investigação PO1CA098912 e RO1CA122602 dos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer (LWK Chung). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metástases ósseas de câncer de próstata é letal. Mais de 70% dos doentes com cancro da próstata têm metástases ósseas na autópsia [1]. A taxa média de sobrevida de 5 anos é de apenas 31% para os doentes metastáticos. pacientes com cancro da próstata com metástase óssea têm demonstrado ter expressão elevada de β2-microglobulina (β2-M) em células [2] cancerosas. β2-H é uma proteína de membrana de células que se complexa com a classe 1 MHC de família. β2-H é elevado em vários tumores sólidos e líquidos agressivos. É um factor pleotropic que medeia vários processos, tais como o desenvolvimento do cancro [3], metástase do cancro [4], e osteomimicry [2]. Os estudos anteriores demonstram que a segmentação β2-M e anti-β2-H de anticorpo (Ab) é uma estratégia terapêutica promissora na próstata, tumores renais e líquidos [5] – [7]. Os estudos anteriores demonstram que β2-H interactua com a proteína hemocromatose (HFE), que é um não-clássica de MHC de classe 1 membro [8]. β2-M /HFE complexo interage com o receptor da transferrina (TFRC1), e reduz a afinidade de ligação a transferrina TFRC1 [9]. Assim, β2-M /HFE impede a absorção excessiva de ferro. Camundongos sem β2-M ou HFE desenvolver sobrecarga de ferro mais tarde na vida e doenças relacionadas com o ferro [10], [11]. Neste estudo, demonstramos que a inibição da β2-M utilizando um anticorpo ou eliminação genética de β2-M ou HFE em células cancerosas faz com que a sobrecarga de ferro e sensibiliza células cancerosas da próstata à radiação

in vitro

e

in vivo Comprar e agentes quimioterápicos

in vitro

.

Materiais e Métodos

Bioética Declaração

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo IACUC da Universidade Emory e os Cedars-Sinai Medical Center e feito de acordo com as diretrizes institucionais.

Cultura de células

Arcap

M, Arcap

e [12], C4-2, e C4 -2B [13] as células de cancro da próstata foram obtidas no nosso laboratório, como descrito anteriormente, e p69 (células não tumorigénicas), LNCaP, PC-3, DU145, TRAMP C1 e TRAMP C2 células de cancro da próstata foram compradas a partir de ATCC. As células foram cultivadas em t-forma (GibcoBRL, Grand Island, NY) suplementado com 5% de soro inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS) (Bio-Whittaker, Walkersville, MD), 50 UI /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina (GibcoBRL ) e mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C. Todas as células foram testadas para micoplasma cada seis meses e foram negativas (kit de detecção de Mycoplasma, R D systems)

viabilidade celular Ensaios

ensaio Clongenic foi realizada como mencionado anteriormente [14].. A viabilidade celular foi determinada com um CellTiter 96 Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação (ensaio MTS) (Promega, Madison, WI).

Radiation Estudos

feixe externo radioterapia foi entregue em um 600 Varian acelerador linear com um feixe de fótons de 6 MV para

in vitro

e

in vivo

(subcutânea e intra-tibiais) experimentos.

Análise Immunoblot

Western a análise foi realizada como previamente descrito [2]. As membranas foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho contra β2-H, HFE, HSP27, HSP70 (Santa Cruz Biotechnology), NUDT1 e MPG (uma oferta do Dr. Jugo Wah Kow), EF-1α (Upstate), e β-actina ( Sigma), respectivamente, a 4 ° C durante a noite.

Anti-β2-M Ab Estudos

O anticorpo utilizado nas Figuras 1, 2 e 5 é a partir de Santa Cruz Biotechnology. Uma vez que a solução de anticorpo tinha concentração final de 0,005% de azida de sódio e gelatina, testou-se azida de sódio ou gelatina foi tóxica para estas células.

M células cancerosas da próstata Arcap não foram afetados pelas doses elevadas (0,1%) de azida de sódio ou gelatina (Figura S1). O anticorpo utilizado na Figura 3 e 4 é de ratinhos produzidos a partir de ascites de hibridomas BBM.1 (ATCC). O anticorpo IgG foi purificado utilizando um kit de purificação em gel do melão IgG (Fisher Scientific) e os níveis de anticorpos foram quantificadas usando NanoDrop (Thermo Scientific). Ferro de coloração de células tratadas com IgG e anti-β2-M Ab foi realizada com um kit de coloração de ferro (Sigma). células cancerosas e LNCaP C4-2 foram usadas para detectar as proteínas de reparação de ADN em resposta ao anti-β2-M Ab. As células foram tratadas com anti-β2-M Ab (10 ug /ml) durante 24 h. Rato TRAMP (C1 e C2), células de cancro da próstata foram testadas com concentrações crescentes de anti-β2-M Ab (0-10 ug /ml) e a sua viabilidade celular foi examinada.

. sensibilidade à radiação de Arcap

E e Arcap

M células cancerosas da próstata através do teste de clongenic. (** P 0,01, *** p 0,001, teste t de Student). B. Arcap

células M são sensíveis à radiação na presença de anti-β2-M Ab usando ensaio clongenic. (* P 0,03, *** p 0,008, ANOVA). C. Efeito de anti-β2-M Ab (0,8 mg /kg) e de radiação (15 Gy) no crescimento do tumor em subcutânea

H Modelo de Xenoenxerto de ratinhos nus Arcap. (** P 0,01, teste t de Student)

A.. a coloração de ferro no controle e anti-β2-M Ab células tratadas utilizando o kit de coloração de ferro em Arcap

H próstata linhas celulares de cancro (5 ug /ml). B. mitocondrial níveis de superóxidos em resposta a um tratamento anti-β2-M Ab num tempo e modo dependente da dose em i. Arcap

M, ii. linhas

E de células de câncer de próstata Arcap (*** p 0,001, teste t de Student) e iii. p69 imortalizada células epiteliais da próstata utilizando MitoSOX corante. C. mitocondrial de superóxido em Arcap

M, KD

HFE1 e KD

HFE3 usando MitoSOX corante (* p 0,05, teste t de Student). D. Expressão de proteínas de resposta ao estresse e enzimas de reparo de DNA no controle C4-2B Neo e linhas de células knockdown β2-M. a expressão da proteína i.β2-H, II. HSP27 e HSP70 expressão da proteína e iii. a expressão da proteína NUDT1 e MPG. a expressão da proteína NUDT1 e MPG em resposta ao tratamento anti-β2-M Ab em células de cancro da próstata LNCaP e C4-2.

A. A viabilidade celular das células cancerosas da próstata TRAMP C1 e C2 TRAMP em resposta ao anti-β2-M Ab. (*** P 0,001, teste t de Student). B. Fundiu imagem de infravermelhos e de raio-X do abdômen de ratos TRAMP tratados com IgG controle e anti-β2-M Ab próximo (n = 4). ratinhos parental representativo, utilizado como controlo adicional (ratinhos C57BL /6). O tumorigenecity de controlo grupo de anticorpos IgG foi de 100% (n = 4) e o grupo tratado tumorigenecity de anti-β2-M Ab foi de 25% (n = 4). C. H E imagens de próstatas de ratos de controlo e de IgG anti-β2-M Ab ratinhos tratados (10X). D. células imunes (células T e B) o número de ratinhos de tipo selvagem, os murganhos de controlo de IgG e anti-β2-M Ab ratinhos tratados medidos por citometria de fluxo. pesos E. corporal de ratinhos TRAMP tratados com IgG ou anti-β2-M Ab

incidência de tumores em ratinhos tíbias foram analisados ​​a partir de H . imagens E e exames de raios-x. O tumorigenecity de grupo de controlo foi de 94% (n = 18 tíbias) e a tumorigenecity de irradiação anti-β2-M Ab + (IV) grupo tratado foi de 67% (n = 18 tíbias). A progressão tumoral A. no controle e tratamento de combinação (anti-β2-M Ab e irradiação) analisados ​​por meio de medições de PSA (ng /ml). (*** P 0,006, teste t de Student). coloração imuno-histoquímica de B. tíbias no grupo controle e tratamento de combinação coradas para H E, proteína β2-M, a coloração de ferro, p-CREB e p-histona H3 (10X)

A.. A viabilidade celular das células de controlo Neo e C4-2B KD

sub células β2-M, em resposta a: taxotere (0,3 ^ M), cisplatina (10 uM) e PS341 (1 uM). (*** P 0,001, teste t de Student) B. A viabilidade celular das células de cancro da próstata DU154 em resposta a combinação de anti-β2-M Ab (0,5 ug /ml) e cisplatina (100 uM) /doxorrubicina (100 uM) . (*** P 0,001, teste t de Student). C. A viabilidade celular de células PC-3 de cancro da próstata em resposta a combinação de anti-β2-M Ab (1 ug /ml) e cisplatina (100 uM). (*** P 0,001, teste t de Student)..

Em experiências com animais Vivo

Estudo subcutânea Xenoenxerto

ratinhos nu masculina Quatro semanas de idade ((NCRNU, Taconic) foram injectados por via subcutânea com 2 × 10

6 ARCAP

M células cancerosas da próstata com matrigel (01:01) no flanco. Quando o tumor atingiu 4 mm

3, os ratos foram tratados com IgG ou anti-β2-M Ab em gelform®. O gelform® foi imerso em anticorpo (0,8 mg /kg) e implantado cirurgicamente adjacentes aos tumores. Vinte e quatro horas mais tarde, os tumores foram irradiados com 15 Gy. Cada grupo tinha cinco murganhos . o volume do tumor foi medido semanalmente.

Tramp ratos Estudo.

ratinhos TRAMP foram obtidos a partir da instalação do núcleo do mouse Emory. Parental camundongos C57BL /6, também foram utilizados como controle. estudos anteriores demonstraram anti- β2-M Ab era tóxico para tramp células cancerosas da próstata

in vitro

. Mice 21-26 semanas de idade foram pareados idade-wise e separado em um grupo IgG controle e anti-β2-M Ab. a partir de 21 de /26 semanas a 32/37 semanas os ratinhos receberam IgG anti-Ab ou β2-M Ab (8 mg /kg) de três em três dias para um total de 11 semanas. Os pesos corporais foram medidos semanalmente. O desenvolvimento do tumor foi monitorizado utilizando o corante de infravermelho próximo (NIR) IR-783 15, utilizando uma máquina de MM estação de imagens Kodak 4000. imagens de raios-X foram tomadas simultaneamente e sobreposto para determinar a localização do tumor. Os ratos foram sacrificados em 33/38 semanas e próstatas foram removidas, fixadas, e seccionados, e H E foi realizada 4.

Intra-Tibial Estudo

Quatro semanas de idade nu masculino. ratinhos (NCRNU) (Taconic) foram injectados com células de cancro da próstata C4-2 (1 × 10

6 células) suspensas em 10 ul de PBS estéril em ambas as tíbias (n = 18). Uma semana após a injecção, anti-β2-M Ab (8 mg /kg) foi injectado intra-peritonially uma vez a cada 3 dias durante o resto do estudo. a progressão do tumor foi determinado duas vezes por semana, usando a detecção do marcador Antígeno Prostático Específico (PSA). PSA no soro foi medido por ELISA, utilizando microplacas de uma máquina de Abbott IMx (Abbott Park, IL). Nove semanas depois da injecção do tumor, as tíbias foram irradiados com 4 Gy em três dias consecutivos, de um total de 12 Gy. O tratamento anti-β2-M Ab foi dado antes do tratamento de irradiação em todos os três dias. O tratamento anti-β2-M Ab foi continuada a cada 3 dias após o tratamento por irradiação até à semana 11. Um esquema do protocolo de tratamento está incluído na Figura S2. Na semana 12, os ratinhos foram sacrificados e as tíbias foram enviados para a patologia. Tíbias foram colhidas e H E e a coloração de ferro (kit de manchas de ferro, Sigma) foi realizada. coloração imuno-histoquímica para β2-H (Santa Cruz Biotechnology), p-CREB (Cell Signaling Technology), e p-histona H3 (Millipore) foram realizados como previamente descrito 2.

estudo de células imunitárias: Os esplenócitos foram preparados por esmagando baços. As células foram lavadas e incubadas com anticorpos específicos como previamente descrito 16. Os anticorpos utilizados foram o PE-Cy5 anti-CD45R /B220 (RA3-6B2), CD3-APC, CD4 e CD8-PE-FITC obtidos a partir de eBiosciences. As análises foram realizadas em um laser duplo citômetro de fluxo (FACSCalibur) 16.

Espécies Estudos

reativas de oxigênio

superóxido mitocondrial foi detectada usando MitoSOX (Molecular Probes, Eugene, OR). As amostras foram incubadas durante um mínimo de 40 min a 37 ° C no escuro num agitador rotativo e a fluorescência foi medida.

Knockdown estável de β2-M e HFE da sub Arcap

M Células

Controlo e β2-H siARN foi transfectado em retroviralmente Arcap

células M. células knockdown Β2-M são indicados como KDI e KDII. Lentivirus transdução foi realizada para inibir HFE, conforme instruções (Sigma, St. Louis, MO). As células foram seleccionadas utilizando puromicina (4 ug /ml) tal como anteriormente relatado 4. células de controlo negativo que não recebeu a partículas virais morreram em 3-5 dias. células transduzidas HFE shRNA foram caracterizados por níveis HFE 7-10 dias após a transdução. células knockdown C4-2B (neo) de controlo e C4-2B β2-M (KD

β2-M) foram gerados anteriormente 2.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicado pelo menos duas vezes independentes. Os valores foram expressos em média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada utilizando Estudante de

t

-teste ou ANOVA. Os valores de p . 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Anti-β2-M Ab sensibiliza células cancerosas da próstata à radiação

In Vivo

estudos anteriores demonstraram que β2-H e HFE desempenhar um papel importante na progressão do cancro 4. Inibição da β2-M, utilizando anticorpos anti-β2-M Ab foi mostrado para induzir a morte celular em vários cancros, incluindo o cancro da próstata. Mais de 50% dos doentes com cancro submetidos a terapia de radiação, invariavelmente, durante o curso da progressão da doença. No entanto, o tratamento com radiação tem efeitos adversos. terapias direcionadas incluindo anticorpos terapêuticos potencialmente poderiam actuar como agentes radiosensíveis. Para testar a hipótese de que o tratamento com anti-β2-M Ab vai sensibilizar células de cancro da próstata à radiação, foi utilizado o modelo de cancro da próstata Arcap bem caracterizado que metastiza para o osso em modelos de xenoenxerto de ratinho. Arcap

linha de células E é epitelial-like e tem baixa propensão para metástase e também expressa baixos níveis do

linha de células Arcap M β2-M e, é mesenquimais-like e por outro lado, é altamente metastático para o osso e expressa níveis elevados de β2-H 4. A sensibilidade à radiação foi determinada utilizando um ensaio clonogénico. Nós demonstramos que Arcap

células M são mais resistentes à radiação em comparação com Arcap

células E (Figura 1A). Para determinar se β2-M está envolvido na resistência à radiação, geramos b2-M knockdown estáveis ​​Arcap

M células cancerosas da próstata (clones KDII e KDI). Realizou-se um ensaio clonogénico para determinar a sua sensibilidade à radiação. Ambos KDI e KDII foram mais sensíveis ao tratamento com radiação em comparação com Arcap

células de controlo m (Figura S3A). Além da abordagem genética, o uso do anti-β2-M Ab para inibir β2-H antes da terapia de radiação. O tratamento de combinação de anticorpos anti-β2-M Ab (3 ug /ml) e radiação teve um efeito sinérgico sobre a morte de células de cancro da próstata in vitro (Figura 1B). O sinergismo foi analisada por ANOVA, e anti-H-β2 AB e radiação teve um efeito sinérgico a 4 Gy e 6 doses Gy de radiação. Desde β2-M interage com HFE para mediar seus processos celulares 4, nós derrubado HFE em Arcap

M células cancerosas da próstata, utilizando partículas de lentivírus shRNA. expressão HFE foi diminuída em células HFE knockdown (clones KD

HFE1 e KD

HFE3) em relação ao controle Arcap

células M (Figura S3B). A inibição da expressão HFE também diminuiu β2-H, e, portanto, β2-M /complexos HFE. A resposta da radiação de KD

HFE1 e KD

células HFE3 foi determinada utilizando um ensaio clonogênica. KD

HFE1 e KD

células HFE3 foram mais sensíveis à radiação em relação ao controle Arcap

células cancerosas da próstata M.

Para determinar se anti-β2-M Ab e irradiação Synergize

in vivo, que injectado Arcap

M células subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus. Uma vez que os tumores atingiram um tamanho de 4 mm

3 os xenoenxertos foram cirurgicamente implantados com anti-β2-M Ab IgG (0,8 mg /kg) em gelform®. Vinte e quatro horas mais tarde, os tumores foram irradiados com 15 Gy. Cada grupo tinha cinco tumores e o volume do tumor foi medido semanalmente. Anti-β2-M Ab e radiação diminuiu somente parcialmente o crescimento do tumor. No entanto, no grupo de tratamento combinado, nenhum dos tumores cresceram nos ratinhos (Figura 1C). Estes resultados demonstram que o anti-β2-M Ab é um agente eficaz para o tratamento do cancro da próstata, e tratamento de combinação com anticorpos anti-β2-M Ab e da radiação é significativamente mais eficaz do que o anticorpo única ou radiação único tratamento.

Inibição de β2-M Aumenta sobrecarga de ferro, espécies reativas de oxigênio e diminui enzimas Dna reparação e proteínas de stress resposta

Os ratinhos transgénicos que carecem β2-M ou HFE têm aumentado a sobrecarga de ferro 11. β2-M form /HFE um complexo e interagir com o receptor de transferrina (TFRC1) 8,9. A /complexo HFE β2-M inibe a formação de complexos de transferrina-TFRC1. Assim, o ferro, que está ligado à transferrina é impedido de entrar na célula e, por conseguinte, os ratos que faltam β2-M de HFE aumentaram a sobrecarga de ferro. Testamos se anti-β2-M Ab poderia induzir sobrecarga de ferro e espécies reactivas de oxigénio (ROS) em células cancerosas da próstata. Arcap

células M foram tratados com conteúdo anti-β2-M Ab (5 ug /ml por 24 h) e ferro foi determinada utilizando a coloração de ferro azul da Prússia. Aumento escuro coloração azul negra de ferro foi observada em anti-b2-M Ab células tratadas em relação ao controle isotipo tratada Arcap

células cancerosas da próstata M (Figura 2A). Para determinar se o anti-β2-M Ab um aumento de espécies de oxigénio reactivas induzidas (ROS) como um resultado de aumento da sobrecarga de ferro, testou-se quanto aos níveis de superóxido mitocondrial usando MitoSOX. Duas células cancerosas da próstata (Arcap

M e Arcap

E) e p69 imortalizado células epiteliais da próstata normais foram utilizados para testar esta hipótese. Um aumento da superóxido mitocondrial, uma espécie reactiva de oxigénio, foi observado nas células de cancro da próstata e não nas células normais em uma dose e modo dependente do tempo em resposta ao anti-β2-M Ab (Figura 2B). Estudos anteriores demonstram que as células HFE knockdown têm aumento do ferro basal 4. Testamos se a inibição da HFE em células de câncer de próstata iria alterar os níveis de superóxido mitocondrial. O nível basal de superóxido mitocondrial foi medido utilizando MitoSOX e verificou-se que os níveis basais foram aumentados em clones knockdown HFE (Kd

HFE1 e KD

HFE3) em comparação com o controlo (Figura 2C). resistência à radiação é aumentada de enzimas de reparo de DNA elevados e proteínas de resposta ao estresse. Em seguida, buscou-se determinar alterações nas proteínas de resposta ao estresse em células de câncer de próstata knockdown β2-M. Usando células de câncer de próstata knockdown β2-M (KD

β2-M) de controle C4-2B e testamos os níveis de proteínas de resposta ao estresse, como proteína de choque térmico 27 ​​(HSP27) 17 e proteína de choque térmico 70 (HSP70) e 18 enzimas de reparo de DNA, tais como glicosilase N-metilpurina-DNA (MPG) 19 e nudix (nucleosídeo difosfato porção ligada X) motivo do tipo 1 (NUDT1) 20. Curiosamente, as proteínas de resposta ao estresse e choque térmico foram reprimidos em clones knockdown β2-M KD

β2-M (Figura 2D). Além disso, as células de cancro da próstata foram tratados com anti-β2-M Ab (10 ug /ml) durante 24 h e os níveis de proteína de enzimas de reparação de ADN e MPG NUDT1 foram examinados. Anti-β2-M Ab diminuiu moderadamente os níveis de proteínas e MPG NUDT1. Estes estudos demonstram que os anticorpos anti-M-Ab β2 induz vários efeitos citotóxicos tais como sobrecarga de ferro, um aumento dos níveis de radicais livres, enzimas de reparação do ADN diminuída e proteínas de resposta ao stress em células de cancro da próstata e assim sensibilizar células de cancro da próstata à radiação.

Anti-β2-M Ab impede o crescimento do tumor num espontânea imunocompetentes Transgénicos Adenocarcinoma de rato próstata (tramp) Ratos modelo

tRAMP C1 e C2 tRAMP células de câncer de próstata 21 são linhas celulares derivadas de rato modelo espontânea de adenocarcinoma. Foi realizada em estudos in vitro para testar o efeito de anti-β2-M Ab nas linhas de células TRAMP. Ambos TRAMP C1 e TRAMP C2 células de cancro da próstata de murideo sofrem morte celular com concentrações crescentes de anti-β2-M Ab (Figura 3A). Em seguida, testamos os efeitos do anticorpo

in vivo

. ratinhos TRAMP (em geral 21 a 26 semanas) foram emparelhados e tratados com uma IgG de controlo ou grupo de anti-β2-M Ab (n = 4). ratinhos parental (ratinhos C57BL /6) foram mantidas até ao final da experiência. A partir de 21/26 semanas, os ratinhos receberam 8 mg /kg de IgG Ab ou anti-β2-M Ab cada três dias até os ratinhos atingiram 32/37 semanas e foram sacrificados uma semana mais tarde. Os pesos corporais dos ratos foram determinados semanalmente. O desenvolvimento do tumor foi monitorizado usando corante perto de infravermelhos (IR-783) 15 bissemanal. A visualização foi realizada utilizando imagiologia de infravermelhos e imagiologia de raios-X, com uma máquina de imagem Kodak. Depois os ratinhos foram sacrificados as próstatas foram dissecados e corados com H E. Descobrimos que três em cada quatro ratos no grupo IgG controle desenvolveram tumores e um tinha hiperplasia, como confirmado pela H E e imageamento infravermelho (Figura 3B, 3C). Curiosamente, três de quatro ratinhos tinha nenhum tumor e um ratinhos desenvolveram hiperplasia no grupo tratado com anti-β2-M Ab, tal como foi confirmado por H E e de infra-vermelhos imagiologia (Figura 3B, 3C). Assim, o tumorigenecity do grupo controle foi de 100% e do anti-β2-M Ab foi de 25%. Desde β2-H é expresso pelas células do sistema imunitário, medimos a possível imunotoxicidade de tratamento contínuo com anti-β2-M Ab. Nós demonstramos que o tratamento com anti-β2-M Ab não afectou o número de células imunes (CD8 + e células T CD4 + e células B) e peso corporal dos ratinhos. os números de células T e B não foram afectados pelo tratamento anti-β2-M Ab em comparação com IgG ou ratinhos parental (Figura 3D). Os pesos corporais também não foram afectados quando o anti-β2-M Ab foi dada continuamente a cada três dias durante 11 semanas (Figura 3E). Estes estudos demonstram que o tratamento anti-β2-M Ab não comprometer o sistema imune e o peso corporal dos ratinhos e que impede o desenvolvimento do tumor em modelos de próstata espontâneo do rato de cancro da próstata.

Combinação Tratamento Com Anti β2-M Ab e irradiação reduz o crescimento do cancro da próstata no osso Microenvironment

o segundo local mais comum de metástase óssea câncer de próstata é o osso. Actualmente não existem bons tratamentos para o crescimento do câncer de próstata no osso. Portanto, testou-se a eficácia do anti-β2-M Ab e da irradiação sobre o crescimento do cancro da próstata no osso. Para testar isso, foi injetado andrógeno independente células cancerosas da próstata C4-2 intra-tibially em ratinhos nus. Uma semana após a inoculação do tumor no osso, os ratinhos foram administrados anti-P2-M Ab (8 mg /kg) (n = 9 ratos) intraperitonealmente a cada três dias durante 11 semanas ou salina tamponada com fosfato (n = 9 ratos). antigénio específico da próstata (PSA), os níveis no soro de ratinhos e o peso corporal dos ratos foram medidos quinzenalmente. Aos 9 semanas, o grupo de tratamento anti-β2-M Ab foi dada 4 Gy irradiação durante três dias consecutivos (12 Gy no total) (Figura S2). Antes de radiação, os ratinhos receberam uma dose de anti-β2-M Ab (8 mg /kg). Os ratinhos foram mantidas até 12 semanas após a injecção do tumor e sacrificaram-se. A presença de células tumorais foi determinada por H E de coloração. Anti-β2-M Ab impediu a formação de tumores em 33% das tíbias inoculados com as células tumorais. Os ratinhos de controlo tinham 94% a incidência de tumores e anti-β2-M Ab além de irradiação grupo tratado teve 67% a incidência de tumores. O tratamento com o desenvolvimento do tumor anti-β2-M Ab também retardada, a qual era evidente por uma diminuição nos níveis de PSA nestes ratinhos. A maioria (09/07) dos ratinhos de controlo teve PSA detectável às 3 semanas após a injecção intra-tibial, enquanto que o grupo tratado com anti-β2-M Ab tinha atrasado a formação de tumores e níveis de PSA menos detectáveis ​​(3/9 a 3 semanas depois a injecção do tumor). Aos 9 semanas depois da radiação, houve uma diminuição significativa no nível de PSA de ratinhos tratados com anticorpo em comparação com os murganhos de controlo (p 0,006) (Figura 4A). Utilizando imunohistoquímica demonstramos diminuiu β2-H coloração no grupo tratado irradiação anti-β2-M Ab + em comparação com o grupo de controlo (Figura 4B). Além disso, o anticorpo anti-M-Ab β2 e irradiação grupo tratado tinha aumentado significativamente a coloração de ferro no osso (42%) em comparação com ratinhos de controlo (6%) (Figura 4B), o que sugere a sobrecarga de ferro no grupo tratado com anticorpo. Também olhou para as vias a jusante alvo do anti-β2-M Ab e descobriu que há uma diminuição dos níveis desses alvos (p-CREB) na tíbia do anticorpo e os ratos de radiação tratados em comparação com o controlo 2. Além disso, anti-β2-M Ab e grupo tratado com radiação tinham diminuído a mitose, indicado pelo marcador mitótico, p-histona H3 (Figura 4B). O tratamento prolongado com anti-β2-M Ab não foi tóxico para os murganhos, como o peso corporal dos murganhos era estável (Figura S4). Tomados em conjunto, estes estudos demonstram que um anticorpo anti-M-Ab β2 e tratamento de combinação pode reduzir a irradiação tumorigenecity e significativamente retardar e /ou inibir o crescimento de células de cancro da próstata no osso.

Inibição da β2-H sensibiliza próstata As células cancerosas a agentes quimioterápicos

Uma vez que a inibição da β2-M resulta em sobrecarga de ferro, aumento de espécies reativas de oxigênio e diminuição do estresse proteínas de resposta

in vitro

, testamos se o tratamento com anti-β2 -M Ab poderia sensibilizar células cancerosas da próstata para agentes quimioterapêuticos utilizados clinicamente. Usando C4-2B e C4-2B β2-M células cancerosas da próstata knockdown (KD

β2-M) 2, testamos se as células knockdown β2-M foram mais sensíveis ao taxotere, cisplatina e PS341. β2-H expressão era baixo em KD

sub células β2-M em comparação com células de controlo (neo) (Figura 2D). A inibição da β2-H significativamente sensibilizados células de cancro da próstata para o taxotere (0,3 ^ M), cisplatina (10 uM) e PS341 (1 uM) (Figura 5A). Anti-β2-M Ab sensibilizados células DU145 a cisplatina e doxorrubicina (Figura 5B) e células PC-3 de cisplatina (Figura 5C). Usando a análise da independência bliss foi observada uma interação sinérgica em células DU145 tratados com anti-β2-M Ab e doxorrubicina e no PC-3 células tratadas com anti-β2-M Ab e cisplatina.

Estes estudos demonstram que o anti -β2 M-Ab é um agente promissor para a terapia de combinação com tratamentos geralmente utilizados no cancro tais como radiação e quimioterapia. Desde metástases ósseas de câncer de próstata é difícil de tratar, tratamentos de combinação com anti-β2 M Ab talvez mais eficaz na redução da carga tumoral.

Discussão

O câncer de próstata é a segunda principal causa de morte entre homens na América do Norte. expressão β2-H elevada está associada com a progressão do cancro da próstata humano 22, 23 cancro da mama, cancro renal 24, 25 cancro do pulmão, cancro do cólon 26 e um número de tumores líquidos, tais como mieloma múltiplo, linfoma e leucemia 3. β2-M medeia epitelial para mesenquimal, e metástases de cancro para o osso e de outros tecidos moles 4. níveis teciduais β2-M Portanto elevados indicam mau prognóstico. Assim, é importante para atingir β2-M em doentes com cancro da próstata para prevenir a metástase. Anteriormente, nós e outros demonstraram que o tratamento com Ab morte celular β2-M anti-câncer induzida em ambos os tumores sólidos e líquidos 3,6,27. Desde a inibição da β2-M leva à diminuição da resposta ao estresse, a hipótese de que um tratamento de combinação de anti-β2-M Ab com radioterapia ou quimioterapia pode melhorar a morte de células do cancro (radiossensibilização e quimiossensibilização). A inibição de qualquer β2-M ou HFE em células de cancro da próstata conduz à sua radiossensibilização (Figura 1B, Figura S3A, S3B). Usando o modelo de tumor de próstata espontâneo TRAMP do cancro, nós também demonstram que os anticorpos anti-M-Ab β2 sozinhos, impede ou atrasa o crescimento do tumor, sem efeitos secundários tóxicos (Figura 3). Usando um modelo de ratinho de xenoenxerto subcutâneo e um modelo de ratinho de osso intra-tibial foi demonstrado que o tratamento de combinação de anticorpos anti-β2-M Ab e a radiação é mais eficaz para o tratamento de tumores em comparação com o anticorpo ou de radiação único tratamento (Figura 1C, a Figura 4) . Assim, demonstramos que o anti-β2-M Ab em combinação com irradiação inibe significativamente o crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

e em imuno-deficiente e em ratos imuno-competentes. Os tratamentos atuais não seja específica para as células cancerosas no microambiente ósseo. Assim, propomos que o anti-β2-M Ab é um agente promissor em pacientes metastáticos próstata agressivo câncer ósseo e, portanto, o tratamento combinado com o anticorpo e radiação irá reduzir a carga tumoral em tais pacientes.

β2-M tem sido anteriormente mostrado activar várias vias em células cancerosas, tais como a proteína quinase a 28, factor de crescimento endotelial vascular 29, o receptor de androgénio 7, ácido gordo sintase 7 e jangada lipídica vias de sinalização 3. neste estudo foi demonstrado que β2-H regula o equilíbrio celular de ferro e espécies reactivas de oxigénio (Figura 2, 4b). Além disso, β2-H também regula a expressão de proteínas de resposta ao stress, tais como HSP27 e HSP70 e enzimas de reparação do ADN e NUDT1 MPG (Figura 2). Assim, proteínas de resposta ao estresse diminuiu tornar as células de cancro susceptíveis ao dano celular.