Abstract

Fundo

O câncer de boca, que é o quarto câncer masculino mais comum, está associada a agentes cancerígenos ambientais em Taiwan. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) -C, um factor angiogénico /linfática com níveis de expressão elevados em tecidos de tumor, desempenha um papel importante no desenvolvimento de várias malignidades. Este estudo foi projetado para examinar associações de cinco

polimorfismos do gene

com a suscetibilidade e características clinicopatológicas de carcinoma epidermóide oral C VEGF-.

Metodologia /Principais Achados

Five polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de

VEGF-C

foram analisados ​​por uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) em 470 pacientes do sexo masculino com câncer oral e 426 controles sem câncer. Neste estudo, verificou-se que o

VEGF-C

rs7664413 e polimorfismos rs2046463 foram associados com a susceptibilidade ao câncer oral, mas não com os parâmetros clínico-patológicos. O

GGACA

ou

GACTG

haplótipo de cinco

VEGF-C

SNPs (rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 e rs2046463), combinada também foi relacionado ao risco de via oral Câncer. Entre 611 fumantes do sexo masculino,

VEGF-C

portadores de polimorfismo que também mascavam betel quid foram encontrados para ter um risco 14,5-24,2 vezes de ter câncer oral em comparação com o

VEGF-C

wild- tipo de transportador que não mastigaram betel quid. Entre 461 chewers betel-quid do sexo masculino,

VEGF-C

portadores de polimorfismo que também fumavam tinham um risco 2,7-18,1 vezes de ter câncer oral em comparação com aqueles que realizaram o tipo selvagem, mas não fumava.

Conclusões

Nossos resultados sugerem que os dois SNPs de

VEGF-C

(rs7664413 e rs2046463) e qualquer um dos dois haplótipos de cinco SNPs combinados têm um significado preditivo potencial na carcinogênese oral. interações gene-ambiente entre

VEGF-C

polimorfismos, tabagismo e mascar betel-quid podem alterar sua susceptibilidade ao câncer bucal

Citation:. Chien MH, Liu YF, Hsin CH, Lin CH , Shih CH, Yang SF, et ai. (2013) Impacto da

VEGF-C

Gene polimorfismos e fatores ambientais sobre Oral Cancer Susceptibilidade em Taiwan. PLoS ONE 8 (4): e60283. doi: 10.1371 /journal.pone.0060283

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 11 Janeiro, 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2013; Publicação: 04 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chien et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela bolsa de investigação do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 100-2632-B-040-001-MY3) e uma subvenção de Taipei Medical University-Wan fang Hospital (não darão nenhuma. 101swf03 ao Dr. Chien e Dr. Yang) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas oral (CCEO), um cancro maligno comum na região da cabeça e pescoço, é o quarto câncer masculino mais comum e a sexta maior causa de morte por câncer em Taiwan [1]. O desenvolvimento de CEB é um processo de múltiplos passos que requer a acumulação de múltiplas alterações genéticas, afectado por predisposição genética de um paciente e por influências ambientais, incluindo o consumo de álcool e de tabaco, de mascar bétel-libras, inflamação crónica e infecção viral [1] – [6 ]. A expressão de um gene pode ser afectada por um polimorfismo de um único nucleótido-(SNP) localizado dentro da outras regiões reguladoras do gene promotor ou, e a produção ou a actividade da sua proteína traduzida é adicionalmente modulado. SNPs, que são o tipo mais comum de variação na sequência de ADN, ocorrer quando um único nucleótido na sequência partilhada de um gene diferente entre os membros de uma espécie ou cromossomas emparelhados num indivíduo, e pensa-se estar associada com o desenvolvimento de certas doenças [7]. SNPs relacionados com a genotipagem pode ser um método simples e valioso para predizer o risco de e prognóstico de câncer. Para elucidar o complexo processo de carcinogênese e melhorar a base científica para intervenções preventivas, identificando os principais genes relacionados com a suscetibilidade para CEB deve ser uma prioridade e eficazes métodos para executar.

Muitos estudos anteriores demonstraram que a angiogénese associada ao tumor e jogar lymphangiogenesis papéis cruciais na progressão tumoral, e as atividades angiogênicos e linfangiogênicas são frequentemente correlacionada com o crescimento de tumores, metástases do nó de linfa regional, metástase à distância, eo prognóstico de pacientes com neoplasias malignas [8] – [10]. A família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de proteínas modula várias funções celulares endoteliais, especialmente envolvendo vasculogénese e angiogénese [11]. O VEGF-A, o primeiro descrita membro da família VEGF, induz a angiogénese através da activação dos receptores de quinase de tirosina relacionada, o VEGF-R1 e VEGF-R2, em células endoteliais [11], [12]. Enquanto VEGF-A desempenha um papel fundamental na angiogénese tumoral, VEGF-C foi caracterizada como um fator essencial linfática que promove a metástase do câncer [13] – [15]. O VEGF-C é um ligando tanto para o VEGF-R3 e o VEGF-R2, mas tem uma maior afinidade para com VEGF-R3 [12]. VEGF-R3 é expresso principalmente pelas células endoteliais linfáticas. O VEGF-C provoca a fosforilação do VEGF-R3, levando a dependente de PI3K Akt e activação da proteína quinase C (PKC) dependente de activação da MAP quinase p42 /p44 (MAPK), protegendo assim as células endoteliais linfáticas e da apoptose estimular a proliferação e migração

in vitro

[16]. Além disso, foi recentemente demonstrado que o VEGF-R3 também pode conduzir a angiogénese [17], [18]. O sinal VEGF-R3 angiogénico é predominantemente activa na definição da invasão angiogénica de tecidos, tal como ocorre com tumores. VEGF-R3 potencia os efeitos do VEGF-R2 e pode sustentar a angiogénese, mesmo na presença de inibidores de VEGF-R2 [18]. Esses estudos realçaram o papel biológico significativo do eixo de VEGF-C /VEGF-R3 em células endoteliais vasculares

Numerosos estudos demonstraram que o VEGF-R3 também é expresso numa variedade de tumores malignos humanos [19] -. [22 ], e esse fenômeno foi relatado para ser um possível fator preditivo para determinar a abordagem clínica, pois está correlacionada com metástases do nó de linfa ou mau prognóstico em pacientes com câncer de próstata, carcinoma endometrial, CEB, e carcinoma do pulmão de não-pequenas células [ ,,,0],20], [23] – [25]. A função e o mecanismo molecular do eixo de VEGF-C /VEGF-R3 em células cancerosas, no entanto, ainda não estão bem compreendidos. Estudos anteriores demonstraram que a fosforilação de tirosina do VEGF-R3 em células cancerosas estimula a proliferação de células no sarcoma de Kaposi, mesotelioma maligno, leucemia, e cancro gástrico [22], [26] – [28]. Outros e nos mostraram que a activação de VEGF-C /VEGF-R3 sinalização em células de cancro aumenta a mobilidade celular e capacidade invasiva e contribui para a promoção de metástase de células do cancro [20], [27], [29]. Estes resultados, em conjunto, indicam a importância da sinalização de VEGF-C na progressão do tumor (crescimento, invasão e metástase), agindo diretamente sobre as células tumorais.

Impactos da

VEGF-A

polimorfismo na susceptibilidade câncer humano estão bem documentados [30] – [33], mas os papéis de

VEGF-C

SNPs genes e agentes cancerígenos ambientais na suscetibilidade ao câncer oral e características clínicas continuam a ser mal investigados. Nesta pesquisa, um estudo de caso-controle foi realizado em cinco SNPs, que estão localizados no intron ou a jusante do

VEGF-C

gene. Algumas destas SNPs foram relatados para ser correlacionado com o risco de pré-eclâmpsia [34], osteonecrose da cabeça femoral [35], ou a taxa de sobrevivência com o cancro do ovário [36]. Neste estudo, foram analisados ​​associações entre

VEGF-C

SNPs genes, fatores de risco ambiental e susceptibilidade ao câncer oral. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra claramente associações significativas de

VEGF-C

polimorfismos com a carcinogênese oral.

Materiais e Métodos

Sujeitos e Colheita

em 2007-2011, foram recrutados 470 pacientes do sexo masculino (idade média de 54,0 ± 11,3 anos) no Hospital Chung Shan Medical University, em Taichung, Changhua Hospital Christian e Show Hospital Memorial Chwan em Changhua, Taiwan como um grupo caso. Para o grupo controle, que escolheu aleatoriamente 426 indivíduos não-cancerosas (idade de 50,5 ± 13,9 anos) que visitaram esses mesmos hospitais e, portanto, eram de uma mesma área geográfica. Para ambos os casos e controles, foi utilizado um questionário para obter informações sobre a exposição de mascar betel-quid, uso de tabaco e consumo de álcool. A informação médica dos casos, incluindo o estadiamento clínico TNM, o tamanho do tumor primário, comprometimento de linfonodos e grau histológico, foi obtido a partir de seus registros médicos. pacientes Oral-cancerosas foram clinicamente classificados no momento do seu diagnóstico de acordo com o sistema TNM encenação da Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC). diferenciação do tumor foi examinado por um patologista de acordo com a classificação da AJCC. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Chung Shan Medical University Hospital de Revisão Institucional e informado consentimento por escrito para participar no estudo foi obtido a partir de cada indivíduo.

Seleção de VEGF-C Polimorfismos

Em dbSNP banco de dados, mais de 60 SNPs foi documentado no intron ou a jusante do

VEGF C-região do gene

. Para obter poder adequado para avaliar o potencial associação, investigamos rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 e rs2046463, aqueles com freqüências alélicas menores ≥ 5%. Além disso, esses SNPs de

gene VEGF-C

foram selecionados neste estudo uma vez que estes SNP foi encontrado nos pacientes com câncer.

Genomic DNA Extraction

O DNA genômico foi extraído usando DNA QIAamp kits Mini sangue (Qiagen, Valencia, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Dissolveu-se o ADN em tampão de TE (Tris 10 mM a pH 7,8 e EDTA 1 mM) e depois quantificado por isso a medição da densidade óptica a 260 nm. A preparação final foi armazenado a -20 ° C e usado para criar modelos para a reacção em cadeia da polimerase (PCR).

-PCR em tempo real

A discriminação alélica do rs3775194, rs11947611, rs1485766 , rs7664413 e rs2046463 polimorfismos do

gene VEGF-C

foi avaliada com a ABI StepOne ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e analisados ​​utilizando software v3.0 SDS (Applied Biosystems), com o ensaio TaqMan. Os FAM-iniciadores utilizados para a análise do rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 e rs2046463 genes polimorfismos foram concebidos como ATTTAGCACTATTAACTTCAAG FAM-5′; FAM-5′-TTACTTTTGAGAATGTCA; FAM-5′-CTTTTTGATTGCAGTGTTA; FAM-5′-CTTTACTATACTTTACTTGG e TTTAGCACACGGTTTAGT FAM-5′, respectivamente. O volume final para cada reacção foi de 5 mL, contendo 2,5 mL TaqMan Genotipagem Master Mix, 0,125 mL TaqMan mistura de sonda, e 10 ng de ADN genómico. O PCR em tempo real incluído um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min.

Análises Estatísticas

As diferenças entre os grupos foram considerados significativos se

p

valores foram 0,05. Hardy-Weinberg (HWE) foi avaliada utilizando um goodness-of-fit

Χ

2

-teste de marcadores bialélicos. O Mann-Whitney

U

-teste e exato de Fisher foram usados ​​para comparar diferenças nas distribuições características demográficas entre o grupo de controle saudável e pacientes de câncer oral. Os rácios ajustada odds (ORa) e intervalos de confiança de 95% (IC) da associação de freqüências genotípicas com o risco e características clínico-patológicos foram estimadas usando vários modelos de regressão logística após o controle de outras variáveis. Foram analisados ​​todos os dados com Estatística Analytic System (SAS Institute, Cary, NC, EUA), software (vers. 9.1, 2005) para Windows.

Resultados

A análise estatística das características demográficas é mostrado na Tabela 1. Não houve diferenças significativas nas distribuições de mascar betel-quid (

p Art 0,001), consumo de álcool (

p Art 0,001), e uso de tabaco (

p Art 0,001) entre indivíduos controle e pacientes com tumores masculinos. Para diminuir a possível interferência de fatores ambientais, ORa com IC de 95% foram estimadas por vários modelos de regressão logística após o controle de outras variáveis ​​em cada comparação.

No nosso grupo de controle recrutados, as frequências de

VEGF-C

rs3775194 (

p

= 0,844, χ

2 valor: 0,039), rs11947611 (

p

= 0,148, χ

2 valor: 2.090) , rs1485766 (

p

= 0,566, χ

2 valor: 0,329), rs7664413 (

p

= 0,115, χ

2 valor: 2.478) e rs2046463 (

p

= 0,115, χ

2 valor: 2.478) estavam em Hardy-Weinberg, respectivamente. A trama reconstruído de desequilíbrio de ligação (LD) dos cinco SNPs é mostrado na Figura 1. Determinou-se uma haploblock observada em qual rs7664413 e rs2046463 mostrou 100% de desequilíbrio de ligação no nosso estudo. distribuições genotípicas e associações entre o câncer oral e

-VEGF C

polimorfismos do gene são apresentados na Tabela 2. Os alelos com a maior frequência de distribuição para rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 e rs2046463 genes de

VEGF-C

em ambos os nossos pacientes com câncer oral, sexo masculino recrutados e controle saudável, respectivamente, eram homozigotos para G /G, heterozigotos para a /G, heterozigotos para C /a, homozigotos para C /C, e homozigotos para a /a. Após o ajuste para diversas variáveis, não houve diferença significativa em ter câncer oral em indivíduos com rs3775194, rs11947611 e polimorfismos rs1485766 do

VEGF-C

gene em comparação ao tipo selvagem indivíduos (WT). No entanto, indivíduos com o

VEGF-C

rs7664413 polimórfica genótipos TT apresentaram significativamente (

p Art 0,05) maiores riscos de 2.541- (IC 95% = 1.071~6.027), de ter CCEO em comparação com os seus correspondentes homozigotos WT. Além disso, um resultado semelhante também foi observado em indivíduos com o

VEGF-C

polimórfica rs2046463 (Tabela 2).

O observada haploblock, ea medida pares LD D ‘.

efeitos de interação entre fatores de risco ambientais e polimorfismos genéticos de

VEGF-C

são mostrados nas Tabelas 3 e 4. entre 611 fumantes, os indivíduos com pelo menos um alelo C do rs3775194, um alelo G de rs11947611, um alelo a rs1485766, ou um alelo T do rs7664413, e que o hábito de betel-nut-mastigação tinha respectivos riscos de 14,501 vezes (IC 95%: 6.899~30.479), 19.030- (IC 95% : 9.239~39.197), 15.676- (IC 95%: 7.413~33.150) e 24.220- (IC 95%: 11.601~50.566) de ter câncer oral. Indivíduos com tanto pelo menos um alelo C do rs3775194, um alelo G de rs11947611, um alelo A rs1485766 ou um alelo T do rs7664413 ou que mastigou noz de betel teve respectivos riscos de 11.688- (IC 95%: 6.534~20.907), 2.827 – (IC 95%: 1.491~5.360), 2.670- (IC 95%: 1.302~5.473) e 7.241 vezes (IC 95%: 3.981~13.172) de ter câncer oral em comparação com indivíduos com homozigotos WT que não mastigam noz de betel (Tabela 3). Do mesmo modo, entre 461 consumidores de betel-quid, indivíduos com

VEGF-C

rs3775194 polimórfica, rs11947611 ou rs7664413, genes e que fumavam tinham correspondentes riscos de 2.695- (IC 95%: 1.270~10.750), 8.066- ( IC 95%: 2.250~28.913) e 18.100 vezes (IC 95%: 5.427~60.369) de ter câncer oral em comparação com chewers betel-quid com o gene WT que não fumam (Tabela 4). À luz dos resultados acima, sugerimos que

VEGF-C

polimorfismos do gene têm um forte impacto na susceptibilidade ao câncer oral em betel-nut e /ou consumidores fumadores.

Nós exploramos ainda mais os haplótipos para avaliar o efeito combinado dos cinco polimorfismos de susceptibilidade ao câncer oral. As frequências de distribuição de

VEGF-C

rs3775194, rs11947611, rs1485766, foram analisados ​​haplótipos rs7664413 e rs2046463 em nossos indivíduos recrutados. Havia cinco haplótipos com frequências de 5% entre todos os casos, o haplótipo mais comum no controle foi GACCA (35,2%), e foi, por conseguinte, escolhido como referência. Em comparação com a referência, dois

VEGF-C

haplótipos, GGACA e GACTG, significativamente (

p Art 0,001) aumentou os riscos para CCEO pela CI 1.568- (95%: 1.201~2.046 ) e 1.819 vezes (IC 95%:. 1.352~2.448), respectivamente (Tabela 5)

Para esclarecer o papel da

VEGF-C polimorfismos do gene

na oral- estatuto clínico-patológico de câncer, como o estadiamento clínico TNM, tamanho do tumor primário, a participação do nó de linfa, e grau histológico, a frequência de distribuição do estado clínico e

freqüências genotípicas em pacientes de câncer bucal C VEGF-foram estimados. Nenhuma associação significativa entre polimorfismos do gene rs7664413 e o estado clínico-patológico foram observadas (Tabela 6).

Discussão

O consumo de álcool, tabagismo, e mascar betel-quid são a principal etiológico conhecido fatores para o cancro oral. Neste estudo, foram observadas proporções mais elevadas de indivíduos que tinha mastigado betel quid e consumidos álcool e tabaco no grupo de pacientes com tumores (78,9%, 62,8% e 87,0%, respectivamente) do que os indivíduos controle (21,1%, 43,4%, e 47,4%, respectivamente), o que indica que o álcool e tabaco de mascar e betel-quid são altamente associado com aumento do risco de câncer oral. É bem documentado que o tabaco a longo prazo e consumo de betel-quid contribui para o câncer oral [3], [4]. constituintes bétele-libras pode aumentar os níveis da proteína de c-fos e c-jun proto-oncogenes [37]. O consumo de tabaco também aumenta significativamente a expressão do factor indutível por hipoxia (HIF) -1 [38] e VEGF-C [39] em cancros orais e cervicais, respectivamente. A exposição ao agente cancerígeno ambiental pode envolver parcialmente a formação ou a patogênese do câncer oral, mas aumentando as evidências indicam que alterações genômicas alteram progressivamente fenótipos celulares e pode levar mais significativamente células para evoluir desde a fase de pré-neoplásicas em câncer [40]. Foi relatado que a mucosa oral de indivíduos com o

murino duplo minuto 2 (MDM2)

SNP 309 genótipo GG é mais suscetível a exposição cancerígena ambiental e resulta em início mais precoce da formação de tumores [41]. Um polimorfismo mais alelos do dinucleótido GT no

heme oxigenase (HO) -1

promotor e um polimorfismo funcional no

fator nuclear kappa B1 (NFKB1)

promotor estão ambos relacionados com o risco dos relacionados betel-quid-CCEO [42], [43]. Polimorfismos de vários genes foram identificados como sendo associado com o risco de câncer oral [44], [45]. É claro que os componentes genéticos podem desempenhar um papel central na carcinogénese.

o VEGF-C é frequentemente identificado em tecidos tumorais dentro de cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço, e a ampla expressão do VEGF-C /VEGFR-3 eixo em carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço sugere envolvimento em lymphangiogenesis tumor e angiogênese, promovendo o crescimento do tumor, e propagação das células cancerosas [46]. Os dados da Tabela 2 mostram que indivíduos com a

VEGF-C

polimórfica rs7664413 TT ou GG rs2046463 genótipo têm riscos mais elevados para CEB em comparação com o genótipo WT. Embora a importância funcional destes dois SNPs não foi testado experimentalmente, uma associação com o risco de cancro oral é proposta com base nas localizações das variantes analisadas. No entanto, em determinados genes, um SNP resultantes da codificação, promotor ou região reguladora pode ter consequências funcionais.

O SNP rs7664413 foi localizado no intrão 5 a região flanqueadora (-33 nt a montante) do

VEGF-C

gene. Muitos elementos regulados por cis splicing alternativo estão localizados nesta região [47]. Descobrimos ainda que o SNP rs7664413 estava localizado numa sequência de um silenciador de splicing exônico putativo (PESS, [TAAGGTATA]). PESSs são elementos cis-regulatórias que inibem o uso de locais de splicing adjacentes, agindo através de interações com os membros da ribonucleoprote�a nuclear família heterogénea (RNPhn) e muitas vezes contribuem para o splicing alternativo (AS). PESSs regular como por fatores que interferem directamente com a maquinaria de emenda [48] recrutamento. Por exemplo, RNPhn I /PTB liga muitos silenciadores de splicing exônico e parece bloquear o acesso à máquina splicing através multimerização proteína [49]. Outra evidência apoia esta observação sobre duas variantes de splicing (ENST00000280193 e ENST00000507638) relatou no banco de dados Ensemble (vers. GRCh37). Um codifica para a proteína funcional de VEGF-C (NM_005429, 420 aminoácidos), mas os outros processos única transcritos (CF128431, sem a produção de proteína, EST proveniente de linhas de células de condrossarcoma de metástases pulmonares). Estes dados sugerem que o SNP rs7664413 pode afectar

VEGF-C

splicing do mRNA. No entanto, estudos mais especificamente desenhados são necessários para verificar os efeitos e mecanismo subjacente da rs7664413 polimórfica na pré-RNA mensageiro splicing.

O SNP rs2046463 foi localizado a jusante do

VEGF-C

gene, mas rs7664413 próxima (a jusante 5008 nt). Como mostra a Figura 1, determinou-se um haploblock LD constituído de rs7664413 e rs2046463, que provavelmente representam os sinais genéticos que afectam dependentes do risco de CEB, enquanto que outras estão fora do SNP haploblock. No entanto, o mecanismo subjacente detalhada precisa ser verificada por meio de uma outra experiência bem concebido.

As interpretações deste estudo são limitados porque a informação sobre certos fatores de risco do câncer bucal, como a maconha (cannabis) tabagismo, uso de nicotina medicinal e hereditariedade e os riscos familiares, não estavam disponíveis para os espécimes recrutados, e esta limitação pode restringir o ajuste desses fatores possivelmente confusão. Neste estudo, no entanto, os principais fatores de risco para câncer oral, de álcool e tabaco e mascar betel-quid, foram ajustados para, a fim de estimar os efeitos de polimorfismos do gene no desenvolvimento clínico-patológico de CCEO. Em um estudo futuro, aumentando o número de amostras e tomar mais fatores de risco CCEO em conta na análise pode validar precisamente esses achados.

Em resumo, o

VEGF-C

TT rs7664413 polimórfica ou rs2046463 genótipo GG pode aumentar o risco para a CEB. O

GGACA

ou

GACTG

haplótipo dos cinco

VEGF-C

SNPs (rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 e rs2046463), combinada também mostraram uma associação de alto risco com CEB. Nossos resultados sugerem que o

VEGF-C

rs7664413 e rs2046463 genótipos polimórficos e haplótipo

GGACA

ou

GACTG

dos cinco

VEGF-C

SNPs descritos acima pode contribuir para prever a susceptibilidade a CEB.