Abstract
Fundo
Cinquenta por cento dos pacientes com músculo-invasivo câncer de bexiga (MI-BC) morrem de sua doença e tratamento quimioterápico atual apenas marginalmente aumenta a sobrevida. Os novos tratamentos visando receptores tirosina-quinase ou oncogenes activados podem melhorar o resultado. Por isso, é necessário para estratificar pacientes com base em mutações em oncogenes relevantes. Os doentes com cancro da bexiga não-músculo invasivo (NMI-BC) têm excelente sobrevivência, no entanto, dois terços desenvolver recidivas. mutações específicas de tumor pode ser usado para detectar recorrências em análises de urina, apresentando um procedimento de diagnóstico mais paciente-friendly do que cistoscopia.
Metodologia /Principais Achados
Para resolver estas questões, foi desenvolvido um ensaio de mutação para a detecção simultânea de 19 mutações possíveis em
HRAS
,
KRAS
, e
ARN
genes. Com este ensaio e ensaios de mutação para o
FGFR3
e
PIK3CA
oncogenes, nós analisamos tumores de bexiga preliminares de 257 pacientes e 184 recorrências de 54 doentes. Além disso, em tumores primários expressão de p53 foi obtida por imuno-histoquímica. Dos tumores primários 64% eram mutante para
FGFR3
, 11% para
RAS
, 24% para o
PIK3CA
, e 26% para p53.
FGFR3
mutações eram mutuamente exclusivas com
RAS
mutações (p = 0,001) e co-ocorreu com
PIK3CA
mutações (p
=
0,016). P53 superexpressão foi mutuamente exclusivo com
PIK3CA
e
FGFR3
mutações (p≤0.029). Mutações no
RAS Comprar e
PIK3CA
genes não foram preditores para, a sobrevivência livre de progressão e específica da doença livre de recidiva. Em pacientes com NMI-aC grau 3 e IM-aC, 33 e 36% dos tumores primários foram mutante. Em pacientes com baixo grau NMI-BC, 88% dos tumores primários realizada uma mutação e 88% das recorrências foram mutante.
Conclusões /Significado
Os ensaios de mutação apresentar um companheiro de diagnóstico para definir pacientes para terapias direcionadas. Além disso, os ensaios são um biomarcador potencial de detectar recorrências durante a vigilância. Nós mostrou que 88% dos pacientes com baixo grau NMI-BC são elegíveis para um tal acompanhamento. Isso pode contribuir para uma redução no número de exames cystoscopical
Citation:. Kompier LC, lurkin I, van der Aa MNM, van Rhijn BWG, van der Kwast TH, Zwarthoff CE (2010)
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
ARN
e
PIK3CA
mutações no cancro da bexiga e do seu potencial como biomarcadores para a Vigilância e Terapia. PLoS ONE 5 (11): e13821. doi: 10.1371 /journal.pone.0013821
editor: Venugopalan Cheriyath, Cleveland Clinic, Estados Unidos da América
Recebido: 18 de julho de 2010; Aceito: 13 de outubro de 2010; Publicação: 03 de novembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Kompier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma Erasmus MC Breedtestrategie Grant (2002-2006) e da Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento (ZON-MW, 945-02-046) Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de bexiga é o quinto câncer mais comum no mundo ocidental [1]. Dos tumores da bexiga 15-20% apresenta como doenças músculo-invasiva (MI-BC), o grupo restante como tumores não-invasiva do músculo (NMI-BC). MI-BC é uma doença devastadora pois mais de 50% dos pacientes vão morrer de doença metastática. Recentemente, novos desenvolvimentos em terapias específicas que usam inibidores de tirosina quinase receptor em outros tipos de câncer de ter inspirado o possível tratamento de pacientes com MI-BC com agentes adjuvantes semelhantes [2]. Para os tumores da bexiga músculo-invasiva FGFR3 terapia-alvo está a ser considerado [3], [4], [5], [6] e, recentemente, um estudo de Fase II foi iniciado para investigar a eficácia de TKI258, um inibidor de FGFR3, em doentes com doença avançada câncer urotelial (www.ClinicalTrials.gov NCT00790426). Da mesma forma, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é frequentemente sobre-expressa no cancro da bexiga e poderia, portanto, ser um alvo terapêutico importante para a [7] MI-BC, [8], [9]. Atualmente, EGFR tratamento alvo está sendo investigado por cancro da bexiga em vários ensaios clínicos (CALBG-90102, NCT00088946, NCT00380029). No entanto, tornou-se recentemente claro que as terapias dirigidas tirosina-quinases de receptor pode não ser eficaz quando os tumores abrigar mutações no RAS-MAPK ou vias PIK3CA-AKT a jusante dos receptores [10], [11], [12], [13] , [14]. No entanto, os agentes que inibem a alvos a jusante em estas vias estão em ensaios clínicos. Isto sugere que a triagem tumores de bexiga para mutações em genes tais como
FGFR3
,
RAS Comprar e
PIK3CA
pode ser de importância para as decisões de terapia futuras. Um teste simples que pode ser implementada na clínica será, portanto, desejável.
Para não-invasiva do músculo-cancro da bexiga (NMI-aC), o principal problema é que, após a ressecção transuretral da bexiga inicial (RTB) , 50-70% dos pacientes desenvolvem múltiplas recorrências, com uma chance de 10-20% que estes irão progredir para MI-BC [15], [16], [17]. O risco de recorrência e risco de progressão necessitam de um longo da vida seguimento por cistoscopia. O padrão atual é realizar uma cistoscopia juntamente com citologia urinária cada 3-4 meses nos primeiros 2 anos e duas vezes por ano, posteriormente, [18]. Temos demonstrado recentemente que nos pacientes Holanda com NMI-BC submetidos, em média, 20 cistoscopias durante os primeiros 9 anos de follow-up [17], com uma recorrência detectado em apenas um dos sete desses momentos de acompanhamento. Para os EUA e Europa, com populações de 300 e 450 milhões, isto equivaleria a 1 e 1,5 milhões cistoscopias anuais. A redução do número de cistoscopias por, por exemplo, um teste com base em urina é um objectivo importante, a fim de melhorar a qualidade de vida [19], [20], [21]. Além disso, poderia conduzir a uma redução de custos. Atualmente, o câncer de bexiga é o tipo de câncer mais caro para o tratamento por paciente [22], [23]. No entanto, citologia e muitos dos biomarcadores de urina actualmente desenvolvidos têm sensibilidade limitada para a detecção de tumores de baixo estágio e grau que formam o grupo principal que se repetem (revisto em [24], [25], [26], [27], [28 ]). por conseguinte, existe uma necessidade de biomarcadores urinários mais sensíveis que podem ser implementadas em laboratórios de diagnóstico molecular.
NMI-aC e BC-MI são geneticamente diferentes [29], [30]. tumores NMI-BC são caracterizados por uma elevada frequência de mutações no
FGFR3
oncogene [31], [32] levando à ativação constitutiva da via RAS-MAPK [33], [34], [35] , [36], [37]. Em MI-BC, mutações no
gene TP53
prevalecer. Mutações no
FGFR3
e
TP53 Quais são, em grande parte mutuamente exclusivos sugerindo que NMI-BC e MI-BC desenvolver ao longo de diferentes percursos oncogenesis [38], [39]. No entanto, na fase pT1 tumores que invadem a camada de tecido conjuntivo subjacente ao urotélio, que muitas vezes ocorrem em conjunto [32], [38], [39]. Recentemente, as mutações somáticas no
PIK3CA
oncogene, que codifica a subunidade catalítica de p110α classe IA-PI3-cinase, foram descritas em 13-27% dos tumores da bexiga [40], [41]. Estas mutações muitas vezes coincidiu com
FGFR3
mutações. Mutações nos
RAS
oncogenes (
HRAS
,
KRAS
,
ARN
) também foram encontrados em 13% dos tumores de bexiga e ocorreu em todos estágios e graus [41], [42]. Eles eram mutuamente exclusivas com
FGFR3
mutações. No entanto, não existem dados sobre o valor prognóstico, em termos de sobrevivência específica da doença livre de recidiva, livre de progressão e,
RAS Comprar e
PIK3CA
mutações no cancro da bexiga isoladamente ou em combinação com outras alterações. Em alguns tipos de cancro
PIK3CA
mutações têm sido associadas com a invasividade e um prognóstico pior [11], [43], [44], [45], [46]. Por outro lado, há exemplos de mutações somáticas em lesões benignas da pele que não progridem [47], [48]. Quanto às alterações em RAS e prognóstico, nos estudos anteriores têm sido realizados sobre o valor prognóstico da expressão da proteína p21 RAS, porém os resultados não foram concordantes [49], [50], [51]. Um estudo recente sobre a expressão de
HRAS
em 48 tumores de bexiga PTA mostrou uma correlação inversa do valor da expressão com a recorrência ea progressão [52]. No entanto, não há informações sobre o valor prognóstico de mutações em três
RAS
genes em cancro da bexiga.
Temos recentemente mostrado que, com
FGFR3
análise de mutação na urina amostras de pacientes com cancro da bexiga, foi possível detectar tumores recorrentes [53], [54]. O desempenho técnico do
FGFR3
ensaio de mutação nesses estudos foi excelente. Sessenta e três por cento dos pacientes com NMI-BC são mutante para
FGFR3
. Um objetivo adicional do presente estudo foi investigar se a adição de
RAS Comprar e
PIK3CA
análise de mutação ao
FGFR3
detecção da mutação poderia, potencialmente, aumentar a percentagem de doentes que pode ser monitorizada utilizando ensaios baseados em urina para estas mutações. Além disso, estes ensaios podem ser de uso na clínica para definir os pacientes que podem se beneficiar de terapias direcionadas. portanto, temos desenvolvido um ensaio de mutação multiplex para a detecção da ocorrência mais frequente
HRAS
,
KRAS
, e
ARN
mutações no cancro da bexiga. Este ensaio baseia-se nos ensaios que anteriormente desenvolvidos [53], [55], [56]. Em nossa experiência, estes ensaios são sensíveis, fácil de executar e de interpretar, e requerem apenas alguns nanogramas de DNA. Os ensaios também são bem sucedidos no DNA de parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) tecidos ou urina [53], [54], [56].
A seguir, foi investigado o espectro de mutação do
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
ARN
e
PIK3CA
em uma grande série de tumores primários de 257 pacientes com NMI-BC e MI- BC. estado de mutação também foi comparada com a expressão de p53. A distribuição de alterações nestes seis genes em conjunto não tem sido investigada em tumores da bexiga antes. Nós rastreados ainda mais 184 recorrências de 54 pacientes para determinar se estado de mutação é consistente em recorrências, com a finalidade de examinar se é útil para iniciar um estudo longitudinal sobre a vigilância com esses ensaios de mutação para a detecção de câncer de bexiga recorrente em amostras de urina anulado de pacientes . A freqüência de mutações no
RAS Comprar e
PIK3CA
em um ajuste longitudinal que contém várias repetições do mesmo paciente também ainda não foi investigado antes.
Concluímos que a mutação ensaios de apresentar um companheiro de diagnóstico para estratificar pacientes com MI-BC para terapias direcionadas. Além disso, uma vez que 88% dos tumores primários de pacientes com baixo grau NMI-BC carregava uma mutação no
FGFR3
,
RAS
, e /ou
PIK3CA
genes e 88% das recidivas foram mutante, os ensaios são uma potencial ferramenta para detectar recorrências em DNA obtidas a partir de amostras de urina durante a vigilância, o que pode contribuir para uma redução no número de exames cystoscopical e vale a pena investigar.
Métodos
As características dos pacientes e da declaração
parafina fixadas em formalina incorporado (FFPE) amostras de tumores primários de um grupo não selecionada de 257 pacientes foram obtidos a partir de Erasmus MC e St Franciscus Gasthuis ética, Rotterdam, na Holanda. As amostras de tumores representam um subgrupo de 286 amostras que anteriormente descrito [32]. Nenhum tecido foi está mais disponível para as 29 amostras em falta. A média de idade desse grupo de pacientes no momento do diagnóstico foi de 65,7 anos e razão homem /mulher foi 3/1. Os tumores foram classificados de acordo com a classificação do tumor metástase, de 1997 [57] e as notas foram classificados de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde de 1973 [58]. Entre os tumores primários, havia 166 pta, 57 PT1, e 34 tumores pT2-4. A distribuição de grau foi de 84 grau 1, grau 2 117 e 56 grau 3 tumores. De 54 pacientes que foram tratados em Erasmus MC e tinha desenvolvido uma ou mais recorrências, tecido embebido parafina fixado em formalina foram coletados de 184 recorrências consecutivos. Os dados clínicos dos tumores foram obtidos a partir de história do caso do doente. Os dados foram analisados de forma anónima. amostras FFPE foram utilizados de acordo com os padrões apresentados em “O Código para uso secundário adequado de Tecidos Humanos nos Países Baixos” (https://www.federa.org/). O consentimento informado, por conseguinte, não foi necessário para ser obtido. Isto foi aprovado pelo nosso Conselho de Revisão Institucional. A recidiva foi definida como um tumor removido a ressecção transuretral que subsequentemente foi confirmada como sendo o tecido do tumor por um patologista. Tumores removidos no prazo de três meses após a ressecção transuretral não foram considerados uma recorrência. A progressão foi definida como uma progressão no palco e /ou para o grau 3. sobrevivência doença específica tem sido definida como o tempo desde o diagnóstico até a morte de câncer de bexiga. período de seguimento foi contado a partir da data do diagnóstico. Censura dos pacientes ocorreu em sua última visita à clínica ou quando um paciente morreu. Geralmente, os pacientes foram acompanhados e tratados de acordo com as diretrizes da Associação Europeia de Urologia [18]. A comissão médico-ético da Universidade Erasmus e do Hospital Universitário Rotterdam aprovou o estudo (METC 168,922 /1998/55).
isolamento de DNA e mutação análise
foram usadas Hematoxilina-eosina lâminas coradas para diagnóstico histológico e servido como modelos para o manual de micro dissecção a partir dos respectivos blocos de tecido. As amostras de tumores dissecados continha um mínimo de células de tumor de 70%. As amostras dos tumores foram extraídos a partir de tecido de tumor embebido em parafina fixado com formalina por de-depilação com xileno e etanol. O ADN foi isolado utilizando o kit de tecido DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com o protocolo. P53, MIB-1 e p27
KIP1 imunocoloração foi obtido a partir van Rhijn
et al.
[32].
Primers para o ensaio multiplex RAS-BC foram projetados de tal forma que as cadeias simples do produto de PCR continha como pouca estrutura secundária potencial quanto possível, a fim de facilitar o emparelhamento eficiente das sondas de detecção de mutações. desenho de primers foi ainda destinada a alcançar temperaturas de recozimento idênticos para permitir a amplificação simultânea dos exons relevantes dos três
RAS
genes em uma reação de PCR. Além disso, as regiões a ser amplificado foram inspeccionadas quanto à presença de polimorfismos no banco de dados do National Center for Biotechnology Information. Não se observaram quaisquer polimorfismos nestas regiões. sondas de detecção de mutação para a detecção multiplex de
HRAS
,
KRAS Comprar e
ARN
mutações foram concebidos para emparelhar tanto à frente ou a cadeia reversa diretamente adjacente ao potencial local de mutação . Com o ensaio, 19 mutações possíveis em 10 codões no 3
in RAS genes
pode ser detectada. Juntos, eles representam 96% de todo o somática
HRAS
,
KRAS Comprar e
ARN
mutações encontradas em carcinomas uroteliais pelo Instituto Sanger (www.sanger.ac.uk /genética /CGP /cósmica). Para permitir distinguir as sondas de tamanho, foram adicionados poli (dT) caudas de diferentes comprimentos. Todas as sondas foram concebidos para ter temperaturas de recozimento e semelhantes foram seleccionados para a ausência de estruturas secundárias e emparelhamento de bases com outras sondas. As sequências dos iniciadores e de sondas e concentrações para os três ensaios de mutação multiplex para
FGFR3, ARN, HRAS, KRAS Comprar e
PIK3CA
estão representados na Figura 1 e 2.
Cada reacção de PCR multiplex foi efectuada num volume total de 15 uL contendo dNTPs 0,17 mM (Roche, Basileia, Suíça), MgCl2 1,5 mM, glicerol a 5% (Fluka, Buchs SG, Suíça), 0,3-1,2 | iM de a combinação apropriada do iniciador (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 x tampão de PCR, e 0,5 unidades de ADN polimerase Taq Ir (Promega, Madison, WI), usando 5 ng de DNA genómico como molde. ciclos térmicos consistiu de uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a cada 95 ° C durante 45 seg, 55 ° C durante 45 seg, e 72 ° C durante 45 seg. A etapa de alongamento final foi de 72 ° C durante 10 min. iniciadores e desoxinucleótido-trifosfatos não incorporados foram removidos a partir de produtos de PCR por adição de 2 unidades de exonuclease I (ExoI) e 3 unidades de fosfatase alcalina de camarão (SAP, USB, Cleveland, Ohio, EUA).
produtos de PCR foram subsequentemente analisadas para mutações utilizando sondas para cada um dos possíveis locais de mutação e o Kit SNaPshot® Multiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA). As reacções de detecção de mutações foram realizadas num volume total de 10 uL contendo 2,5 uL de mistura de reacção SNaPshot Multiplex Pronto, 2 ul de tampão de sequenciação BigDye, 1 ul da mistura de sondas e 1 ul de SAP /ExoI tratada produto de PCR. reacções de extensão constituídos por 25 ciclos de desnaturação a 96 ° C durante 10 seg e emparelhamento /extensão a 58,5 ° C durante 40 seg, foram realizadas num termociclador. Após a extensão, o excesso de trifosfatos de didesoxinucleótidos marcados foi removido por tratamento com 1 unidade de fosfatase alcalina de camarão a 37 ° C durante 60 min e 72 ° C durante 15 min. escorvas prolongadas foram desnaturadas a 95 ° C durante 5 minutos e separadas através de electroforese capilar num sequenciador automático (ABI Prism Analyzer 3130 XL genética, Applied Biosystems, Foster City, CA), e a presença ou ausência de uma mutação foi indicado pela fluorescente etiqueta no nucleótido incorporado. Detalhes de cores dos picos mutantes e do tipo selvagem são apresentados na Figura 2. Os dados foram analisados por meio de Análise GeneScan Software versão 3.7 (Applied Biosystems) e GeneMarker Software versão 1.7 (SoftGenetics LLC, State College, EUA).
A análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS (versão 15.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, 2003). As diferenças foram consideradas significativas se p
0,05. As relações entre estado de mutação e variáveis patológicas e clínicas foram analisadas pelo teste t de Student, qui-quadrado e exato de Fisher de dois lados. livre de recidiva, livre de progressão e sobrevida específica da doença pelo estado mutacional foi analisada utilizando curvas de Kaplan-Meier. O teste de log-rank de dois lados foi realizado para comparar as curvas.
Resultados
O câncer de bexiga RAS-BC ensaio de mutação
mutações somáticas específicas no
HRAS
,
KRAS Comprar e
ARN
genes em cancro da bexiga afeta códons 12, 13 e 61. a fim de facilitar a detecção de
RAS
mutações temos desenvolvido um multiplex RAS-BC ensaio de mutação que as telas de 19 mutações em simultâneo, o que representa 96% de todas as possíveis mutações conhecidas nos 3
RAS
genes em cancro da bexiga (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). O ensaio requer apenas alguns nanogramas de ADN e funciona bem no DNA a partir de tecido fixado em formalina. A Figura 3 mostra exemplos de ensaio RAS-aC com o painel A representa a situação de tipo selvagem e com as mutações específicas representadas nos painéis B-D
Painel A:.-Tipo selvagem de exemplo, painéis B-D: amostras com mutações. Posição dos códons interrogados, nucleotídeos e genes é retratado na parte inferior.
As mutações em tumores primários
Com o RAS-BC ensaio e mutação ensaios para
FGFR3
e
PIK3CA
, nós analisamos tumores de bexiga preliminares de 257 pacientes para mutações (Figura 4A). No geral, 64% (164/257) dos tumores continham um
FGFR3
mutação, um total de 28 (11%) amostras foram mutante para um dos
RAS
genes e 61 (24 %) abrigava um
PIK3CA
mutação. A Tabela 1 mostra o tipo das mutações identificadas. O mais frequente
RAS
mutações foram
KRAS
G12D e
HRAS
Q61R.
KRAS Comprar e
HRAS
mutações ocorreram com igual frequência, enquanto que
ARN
mutações não eram frequentes no cancro da bexiga. Na
gene PIK3CA
, as mutações ocorreram principalmente nos códons de domínio helicoidais E545K e E542K. No geral, 18% (11/62) do
PIK3CA
mutações tinha ocorrido nos domínios quinase e 82% nos domínios helicoidais. Nós não detectar a alteração E545A indicativo para um polimorfismo no
PIK3CA
pseudogene cuja função é desconhecida [59]. Em três tumores primários, dois diferentes
FGFR3
mutações estavam presentes (S249C juntamente com A393E, G372C ou R248C). Um tumor primário continha dois
PIK3CA
mutações diferentes nos domínios helicoidais (E542K e E545K). Não houve co-ocorrência óbvia ou exclusividade mútua entre os diferentes tipos de
RAS Comprar e
PIK3CA
mutações.
As frequências em todos os tumores de bexiga preliminares (A) (n = 257) e em estágios específicos de tumor:. pTA /T1-G1 /G2 (B) (n = 194), pTA /T1G3 (C) (n = 29) e os tumores do músculo-invasiva (D) (n = 34)
Os tumores primários foram posteriormente estratificada em três subgrupos com base no estágio e grau; tumores de baixo grau NMI-BC (pTaG1-2 e pT1G2), de alto grau de NMI-BC (pTaG3 e pT1G3), e tumores músculo-invasivo (≥pT2). Na Figura 4B-D, as distribuições de
FGFR3
,
PIK3CA
e
RAS
mutações nestes subgrupos são ilustrados. No grupo PTA-T1G1-2 88% dos tumores primários abrigar uma mutação em pelo menos um dos cinco oncogenes investigados. Triagem para
PIK3CA
e os três
RAS
genes aumentou os tumores mutantes percentuais com 10%, quando comparado com
FGFR3
sozinho. Nos grupos de tumor de grau 3 e músculo-invasiva, a percentagem total de mutações nos oncogenes é muito menor com 33% e 36%, respectivamente. Em 3 tumores de grau, a proporção de
RAS
mutações é relativamente grande, enquanto que
PIK3CA
mutações são mais proeminentes nos tumores músculo-invasivo. A adição de
PIK3CA
e
RAS
ensaios resulta na detecção de 13% dos tumores primários mutantes adicionais no grupo de grau 3 e 15% no grupo de músculo-invasiva.
Co-ocorrência de mutações
dos 257 tumores primários, 26% tinha a sobre-expressão de p53, o que é indicativo de mutações missense. Quando combinamos as mutações de oncogenes com os do
TP53
gene supressor de tumor (Tabela 2), verifica-se que apenas 27 tumores (11%) eram do tipo selvagem para todos os genes analisados. Havia 9 tumores primários com a co-ocorrência de 3 alterações. Houve uma associação positiva do mutante
FGFR3
com
PIK3CA
mutações (p
=
0,016), com 77% da
PIK3CA
mutações co- ocorrendo com
FGFR3
(Figura 5).
FGFR3
mutações foram fortemente mutuamente exclusivo com
RAS
mutações (p
=
0,001). Apenas 3,5% dos tumores primários continha uma mutação em ambos os genes. Curiosamente, a exclusividade mútua de
FGFR3
e
RAS
mutações permaneceu significativa no subgrupo de 2 tumores PTA /T1 G1 /primários, enquanto que
PIK3CA
e
FGFR3
mutações são significativamente co-ocorrentes em 3 tumores de grau. Ambos
FGFR3
e
PIK3CA
mutações eram mutuamente exclusivas com presença da proteína p53 (p
0,001 e p
=
0,029, respectivamente).
RAS
mutações não eram mutuamente exclusivas com
PIK3CA Comprar e p53 mutações em toda a coorte, nem em diferentes subgrupos estágio do tumor e grau.
Correlações de mutações com estágio, grau
a seguir, foi investigada a relação entre estágio e grau e as diferentes mutações (Figura 6). Em tumores primários havia uma correlação significativa de
FGFR3
com baixa estágio e grau e uma correlação de proteína p53 com alta estágio e grau, conforme demonstrado anteriormente [39]. No entanto, não houve associação significativa entre a
RAS
estado de mutação e estágio ou grau. A distribuição de acordo com o estágio foi de 10% PTA (16 de 166), 18% pT1 (10 de 57), e 6% dos tumores músculo-invasivo (2 de 34). Em relação à
PIK3CA
, a prevalência de mutações foi maior em tumores de baixo grau: 30% de grau 1 (25 de 84), 23% de grau 2 (27 de 117), e 16% de grau 3 (9 de 56 ), porém esta associação não foi estatisticamente significativa (p = 0,061). Não houve correlação com o estágio.
A correlação dessas alterações em tumores de bexiga preliminares de 257 pacientes com estágio (A) ou grau (B) é indicada por valores de p (χ
2).
valor prognóstico
Cinquenta e nove por cento (154/257) dos pacientes em nosso estudo desenvolvido uma ou mais recorrências, 10% tiveram progressão no palco e /ou para o grau 3, 19% morreram de doença. Nenhuma das alterações investigadas em
FGFR3
,
RAS
,
PIK3CA Comprar e p53 no tumor primário foi um preditor para o desenvolvimento de uma recidiva (livre de recidiva sobrevivência p 0,05). frequência de mutação de
PIK3CA
em pacientes com recidiva foi semelhante em comparação com pacientes sem recorrência de 24% (37/154) versus 23% (24/103). Para
RAS
mutações, estas frequências foram de 12% e 10%. Também não houve relação entre o estado de mutação do
RAS Comprar e
PIK3CA
e recorrência taxa. Como mostramos anteriormente, os pacientes com um
FGFR3
tumor primário mutante têm um menor risco de progressão e uma melhor sobrevida específica da doença, enquanto os pacientes com superexpressão do p53 têm alto risco de progressão e baixa sobrevida específica da doença [32 ], [39]. No entanto,
PIK3CA
ou
RAS
mutações não foram significativamente associados com a progressão (p
=
0,129, p
=
0,694) ou a sobrevivência específica da doença (p
=
0,205, p
=
0,447) em toda a coorte, nem em diferentes subgrupos estágio do tumor e grau. Combinando
RAS Comprar e
PIK3CA
estado de mutação forneceu resultados similares. Além disso, a adição de
RAS
ou
PIK3CA
estado de mutação para
FGFR3
ou p53 não resultou em uma melhor previsão de, a sobrevivência livre de progressão ou específica da doença livre de recidiva em comparação com
FGFR3
ou p53 sozinho. Também não houve correlação significativa do indivíduo
RAS
isoformas e
PIK3CA
mutações nos domínios helicoidais ou quinase com palco, grau ou recurrence-, progressão e sobrevida específica da doença. Além disso, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre
RAS
ou
PIK3CA
mutações e alterado Ki-67 (p = 0,413, p = 0,227) ou p27
KIP1 (p = 0,126 e p = 0,580) expressão, marcadores indicativos de pior prognóstico no câncer de bexiga [60], [61].
Frequências de mutações em recorrências
de 54 pacientes que foram tratados em Erasmus MC e tinha desenvolvidas uma ou mais recorrências, o tecido estava disponível de 184 recorrências (incluindo recorrência multifocais). Aqui, nós quisemos investigar se estado de mutação persiste em múltiplas recorrências dos mesmos pacientes, com o objetivo de examinar se ele é valioso para iniciar um estudo longitudinal futuro em matéria de vigilância com os ensaios de mutação através da análise de amostras de urina. Nós só examinou estado de mutação dos genes para os quais temos desenvolvido o ensaio de mutação SNaPshot base (ou seja,
FGFR3
,
PIK3CA
e
RAS
). P53 superexpressão não foi determinada em recorrências. A frequência da proteína p53 também foi baixa (6/54) nos tumores primários deste grupo de pacientes que consistem principalmente de tumores NMI-BC. Uma visão detalhada do estágio, grau e estado de mutação destes tumores é apresentado na Figura 7. Em pacientes com um tumor primário do tipo selvagem, recorrências eram em sua maioria do tipo selvagem (49/54 recorrências), enquanto 5 abrigava um
FGFR3
mutação. Um tumor recorrente continha dois diferentes
PIK3CA
mutações (E542K e E545K). Curiosamente, nas recorrências
PIK3CA
mutações, além de um
FGFR3
mutação foi associada com grau superior em comparação com as recorrências abrigar um
FGFR3
mutação isoladamente (p = 0,012). Se estratificar para pacientes com um tumor primário mutante, 81% das recorrências também foram mutante e as freqüências individuais foram de 75% (98/130) para o
FGFR3
, 23% (30/130) para o
PIK3CA
, e 10% (13/130) para o
RAS
. Curiosamente, havia uma consistência de 100% no tipo de mutação para
RAS
e
PIK3CA
diferentes entre tumores do mesmo paciente. Nós anteriormente observado que algumas recorrências eram do tipo selvagem quando o tumor primário era mutante para
FGFR3
[17]. No presente estudo, houve 20 dos 130 recorrências (15%) no subgrupo de pacientes com um tumor primário mutante que tinham progredido para o grau 3, CIS ou câncer de bexiga músculo-invasivo (Figura 7). Destes, 90% (18/20) foram mutante e, portanto, pode ser detectada com o ensaio de mutação. As recorrências de tipo selvagem neste grupo de doentes não progridem mais frequentemente do que as recorrências mutantes; 8% (2/25) das recorrências de tipo selvagem tinham progredido para CIS e ao grau 3 (Figura 7), em comparação com 17% recorrências mutantes. Uma destas recorrências de tipo selvagem co-ocorreram em conjunto com dois tumores mutantes. Determinou-se ainda mais o ponto de tempo em que as recorrências do tipo selvagem ocorreu durante o follow-up. A maioria das recorrências de tipo selvagem (18 de 25) co-ocorreram em conjunto com uma recorrência mutante ou foram mais tarde, seguido de uma recorrência mutante, enquanto 7 ocorreu como de tipo selvagem sozinho no final do período de acompanhamento, quando não há mais dados estava disponível
A:. mutante tumores primários e suas recorrências; B: de tipo selvagem tumores primários e suas recorrências. A primeira coluna indica o tumor primário. As caixas de sucessivos indicam temporalmente recorrências sequenciais removidos em diferentes ressecções transuretral (indicado por um número de sequência no topo). tumores multifocais removidos ao mesmo ressecção transuretral estão posicionados por baixo uns dos outros. Estágio e grau dos tumores, estado de mutação (indicado por uma cor) e ID do paciente dos 54 pacientes é indicado.
Um dos propósitos deste estudo foi investigar se os ensaios de mutação são um potencial ferramenta para a detecção de recidivas, a fim de reduzir o número de exames cystoscopical e se é útil para iniciar um estudo longitudinal grande com estes ensaios de mutação para a detecção de tumores recorrentes da bexiga utilizando ADN extraído de células urinárias. Os pacientes que são elegíveis para tal um follow-up são aqueles que apresentam com um mutante pTaG1-2 ou tumor primário pT1G2. Para este subgrupo de pacientes a frequência de mutações no
FGFR3
,
PIK3CA
e
RAS
genes quando contadas por evento de recorrência (ou seja, em caso de múltiplos tumores removidos a transuretral ressecção, os dados de mutação foram combinadas) estão ilustrados na Figura 8. A figura mostra que, neste grupo de pacientes com uma mutação está presente em 88% dos acontecimentos de recorrência.