Abstract

Fundo

O fato de que os receptores para o ligando indução de apoptose relacionado com TNF (TRAIL) são quase sempre expressos em câncer colorretal (CRC) representa a razão para o emprego de Trail-receptores destinados compostos para o tratamento de doentes afectados por este tumor. No entanto, os primeiros relatórios sobre o uso desses agentes bioactivos fornecida resultados decepcionantes. Por conseguinte, a hipótese de que a perda de ligada à membrana TRAIL-R pode ser uma característica de alguns CRC e que a avaliação da coloração da membrana, em vez do que a da expressão global de TRAIL-R pode prever a resposta a TRAIL-R segmentação compostos neste tumoral .

Objectivo e Métodos

Assim, avaliamos o padrão de imunofluorescência de Trail-receptores e e-caderina para avaliar a fração de Trail-receptores ligados à membrana em 231 pacientes selecionados com início de carreira CRC sofrer único tratamento cirúrgico. Além disso, investigamos se a coloração de membrana para TRAIL-receptores, bem como a presença de mutações KRAS ou de instabilidade de microssatélites (MSI) teve um efeito sobre a sobrevivência e, portanto, um efeito prognóstico.

Resultados

como esperado, quase todas as amostras coradas CRC positivo para TRAIL-R1 e 2. em vez disso, a coloração de membrana para estes receptores foi positiva em apenas 71% e 16% das amostras, respectivamente. Nenhuma correlação entre o estado de mutação KRAS ou MSI-fenótipo e prognóstico poderia ser detectado. TRAIL-R1 intensidade de coloração correlacionada com a sobrevivência na análise univariada, mas apenas a coloração das membranas de TRAIL-R1 e TRAIL-R2 em membranas celulares foi um preditor independente de análise multivariada a sobrevida (cox: TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12 -3,77]; TRAIL-R2:. p = 0,033, RR 3,63 [1,11-11,84])

Conclusões

Em contraste com as premissas atuais, perda de coloração da membrana para TRAIL-receptores é uma característica comum da CRC fase inicial, que substitui o significado prognóstico da sua intensidade de coloração. Incapacidade de alcançar efeitos terapêuticos em ensaios clínicos recentes usando Trail-receptores destinados compostos pode ser devido a selecção insuficiente de pacientes com tumores com TRAIL-receptores ligados à membrana

Citation:. Kriegl L, Jung A, Horst D, Um Rizzani, Jackstadt R, Hermeking H, et al. (2012) microssatélites Instabilidade, KRAS mutações e distribuição celular da TRAIL-Receptores in Early Stage cancro colorectal. PLoS ONE 7 (12): e51654. doi: 10.1371 /journal.pone.0051654

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kriegl et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) com a DFG subvenção para 605 /2-1 para EDT e pela Else Kröner-Fresenius Stiftung com a concessão 2011_A226 para EDT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal (CCR) é um tumor maligno comum respondendo por mais de 1 milhão de casos de tumores em todo o mundo e representa a quarta causa relacionada com o tumor da morte. Infelizmente, enquanto terapias cirúrgicas curativas são viáveis ​​em pacientes com tumores em estágio inicial, o prognóstico dos pacientes com doença avançada continua a ser decepcionante [1].

Nos últimos anos, os avanços na compreensão da biologia do CRC têm levou ao estabelecimento de várias terapias com base no mecanismo. Após o reconhecimento de e.g. o papel de EGF-R e VEGF-R na proliferação e angiogênese, vários compostos como cetuximab, panitumumab ou bevacizumab foram submetidos a investigação clínica e foram mostradas para afetar positivamente a sobrevida dos pacientes [2] – [4]. Espera-se que um inventário completo da contribuição dada por vias de sinalização individuais a carcinogênese permitirá o emprego de terapias sob medida para um número limitado de alvos moleculares individuais.

Outro exemplo recente de uma terapia baseada em mecanismo é representado pelo desenvolvimento de compostos que se dirigem aos receptores de “morte-” TRAIL-R1 e TRAIL-R2 para induzir selectivamente a apoptose em células cancerosas [5]. O desenvolvimento de tais agentes é baseado na lógica fornecida por estudos que demonstraram que batendo para fora de TRAIL ou TRAIL-bloqueio de receptores leva à formação de tumor e metástases reforçada

In vivo

[6] e que a perda de receptores de TRAIL- expressão em tecidos de câncer humanos correlaciona-se com mau prognóstico e recorrência tumoral (Avaliado por Walczak e colaboradores [7]). A este respeito, que recentemente poderia mostrar que a coloração de membrana para TRAIL-receptores determina o prognóstico dos pacientes acometidos por carcinoma hepatocelular [8] e que a expressão do OPG receptor chamariz solúvel de ligação de TRAIL correlaciona-se com o estágio do tumor e formação de metástases em pacientes afetados por carcinoma do cólon [9]. Nos apresentam várias Trail-receptores destinados compostos são submetidos a investigação clínica em diferentes entidades tumorais [5], [7].

estudos retrospectivos anteriores que mostram uma coloração quase invariável para TRAIL-receptores em amostras de câncer colorretal representou a lógica para o emprego de Trail-receptores agentes segmentação no tratamento deste tumor. Inesperadamente no entanto, a avaliação quantitativa da TRAIL-receptores intensidade de coloração foi associado a resultados diferentes prognósticos nesses estudos [10] – [13]. Além disso, os primeiros relatórios sobre os ensaios clínicos de fase precoce com TRAIL-receptores destinados compostos no CRC apresentaram resultados decepcionantes, solicitando uma investigação mais aprofundada sobre um possível papel dos receptores para TRAIL como alvo terapêutico neste tumor.

Para abordar esta problema investigamos uma coorte de pacientes com cancro do cólon fase precoce sem metástases nodais ou distantes submetidos a nenhum outro tratamento de cirurgia, e categorizadas amostras de tumor de acordo com a presença ou ausência de TRAIL-receptores na superfície das células tumorais, como uma alternativa para o sole avaliação semiquantitativa de Trail-receptores a coloração empregada em estudos anteriores. Descobrimos que cancros colo mostrar um padrão de expressão heterogênea de receptor-1 e -2 TRAIL no que diz respeito à sua ocorrência membranoso. As diferenças na expressão de TRAIL-receptores em diferentes compartimentos subcelulares, em vez da sua intensidade de coloração previu independentemente o prognóstico de pacientes com CCR, representando, assim, um marcador de identificação de um subconjunto de tumores que tenham perdido a sensibilidade à apoptose mediada pelo receptor.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

espécimes de câncer colorretal de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica com intenção curativa entre 1994 e 2004 na Universidade de Munique, foram recuperados dos arquivos do Instituto de Patologia nossa universidade. Recolha de amostras e das informações dos pacientes foi conduzida de forma anónimos de acordo com as orientações do comitê de ética da Universidade de Munique. Apenas colorectal adenocarcinomas com diferenciação moderado (G2 de acordo com a classificação da OMS), T-categorias T2 e T3 não tendo nem nodal (N0), nem metástases à distância (M0) no momento do diagnóstico, e, portanto, na fase I e II de acordo com a TNM classificação de cancro do cólon, foram considerados (T2 /T3N0M0 G2) [14]. Além disso, para minimizar uma possível influência da radioterapia ou quimio-terapia sobre o estado de TRAIL-receptores [15], [16] e no prognóstico dos pacientes, os pacientes que se submeteram à terapia neoadjuvante ou adjuvante, além de tratamento cirúrgico foram excluídos desta coorte. dados de sobrevivência foram recuperados a partir do registo tumor Munich (www.tumoregister-muenchen.de). Os casos foram censurados onde os pacientes foram perdidos para observação ou morreu devido a outros motivos que não o câncer colorretal. O estudo cumpriu as exigências do Comitê da Ludwig-Maximilian Universität de Munique Ética.

Construção de arrays de tecido

colorretais microarrays de tecido (TMA) foram construídos como descrito anteriormente [17]. Resumidamente 5 um com H E coradas secções de formalina fixo embebido em parafina (FFPE) amostras de tumores foram utilizados para definir áreas representativas do tecido do tumor viável. A partir dessas áreas de 1,0 mm de diâmetro agulha core-biópsias foram retiradas de áreas correspondentes sobre os blocos tumorais FFPE utilizando uma arrayer tecido (Beecher Instruments, Sun Prarie, WI, EUA). Os núcleos foram colocados em blocos de parafina receptor de matriz de coordenadas definidas. Para garantir que as peças representativos dos tumores foram investigados três núcleos de cada tumor foram tomadas. Para levar também a heterogeneidade do tumor em consideração, os núcleos foram retiradas de áreas centrais de tumor, bem como a partir da frente invasiva. Os núcleos no bloco de parafina foram incubadas durante 30 min a 37 ° C para melhorar a aderência entre os núcleos e parafina do bloco receptor.

A imuno-histoquímica

coloração imuno-histoquímica foi realizada em secções de 5 fiM de TMA blocos. Anti-TRAIL-R1 anticorpo monoclonal de cabra (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemanha N ° de Cat SC-6823), anti-TRAIL-R2 anticorpo monoclonal de coelho (Calbiochem, Califórnia, EUA N ° de Cat PC392), E- anticorpo monoclonal de ratinho caderina (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram aplicados como anticorpo primário. Coimmunofluorescence foi realizada utilizando o seguinte fluoresceína rotulados anticorpos secundários: para TRAIL-receptores conjugado com FITC IgG anti-cabra (Jackson Immuno laboratórios de pesquisa, West Grove, PA) e para CDH1 um Cy3 conjugado anti-IgG de ratinho (Jackson Immuno Research Laboratories, west Grove, PA). Estes anticorpos foram utilizados anteriormente e validado [8]. Antigénio de recuperação foi realizado por fervura das secções em Alvo Retrieval Solution (Dako, Hamburgo, Alemanha), utilizando um forno de microondas 2 vezes cada 15 minutos a 750 W. endógena da peroxidase foi bloqueada através da incubação em peróxido de hidrogénio a 7,5% durante 10 minutos. Vectastain ABC Elite Kit-Universal (Vector Laboratories, CA, EUA) em conjunto com AEC cromogénio (Zytomed Systems) foram utilizados para o desenvolvimento. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina (Vector).

Avaliação de TRAIL-R1 e TRAIL-R2 imunohistoquímica

TRAIL-R1 e TRAIL-R2 imunocoloração foi avaliada pela classificação da intensidade de coloração de acordo com a uma pontuação semiquantitativa variando de 0 a 2, respectivamente, para graus positivos negativos, fracas e fortes de imunorreactividade (Figura 1). De acordo com a lógica de que um pré-requisito para a actividade funcional de TRAIL-receptores é a expressão de superfície membranosa [18], uma segunda avaliação foi feita por categorizar amostras de tumor de acordo com a presença ou ausência de TRAIL-receptores que coram em membranas de células, independentemente do concomitante presença de coloração citoplasmática e a sua intensidade de coloração (Figura 2). Além da inspeção em microscopia de luz convencional, para discriminar mais sensível entre a membrana e marcação citoplasmática para TRAIL-receptores, o padrão de imunofluorescência de co-coloração de Trail-receptores e E-caderina foi realizada por meio de microscopia confocal (padrões de coloração de representação em A Figura 3). As imagens foram capturadas com um dispositivo de LSM 700 (Zeiss), utilizando um Plano Apochromat 20 × /0,8 objetivo M27 de 2009 software ZEN (Zeiss) e as seguintes configurações: Tamanho da Imagem 2048 × 2048 e 16 bits; pixels /pausa de 25,2 mS; pixel de tamanho 0,31 m; potência do laser de 2%; ganho de mestre 600-1000. Imagem Após capturar os arquivos LSM originais foram convertidos em arquivos TIFF. Para excluir amostras de variabilidade intra foram avaliados duas vezes por um observador que não tinha conhecimento prévio do prognóstico ou de outras variáveis ​​clínico-patológico. características exemplificativas de TRAIL-receptores de coloração em amostras de cancro ou em tecidos não tumorais do cólon são, respectivamente, mostrado na Figura 1, Figura 2, e na Figura S1.

(A) Percentagem de amostras que não coloração, ou fraco imunorreatividade forte. (B-D): Representante aparência microscópica típico de coloração TRAIL-R1 (B: Não. Coloração C: fraco e D: coloração forte). (D a F): coloração de TRAIL-R2 (E: Não. Coloração F: fraco e G: coloração forte). Os actuais secções são representativos de um câncer de cólon grau 2 no estágio II (T3N0M0) na ampliação de 630 ×.

(A) percentagem de amostras de tumores que apresentam coloração de membrana para TRAIL-R1 e TRAIL- R2. Representante aspecto microscópico típico de coloração TRAIL-R1 com citoplasmática predominante (B) ou coloração da membrana (C). padrão típico de coloração TRAIL-R2 com coloração predominante citoplasmática (D) ou coloração da membrana (E). Ampliação, × 800. Os actuais secções são representativos de um câncer de cólon grau 2 no estágio II (T3N0M0) na ampliação de 630 ×.

padrão Representante da co-coloração de TRAIL-R1 e E-caderina nas membranas celulares células de cancro colorectal por microscopia confocal mostrando (a) um padrão de coloração predominante vs membrana (B) coloração não membranoso. A coloração para TRAIL-R1 (verde, painel esquerdo), E-caderina (vermelho, painel do meio) e sobreposições destes coloração (painel direito).

As análises de mutações KRAS

para as análises de mutações no exon 2 do oncogene KRAS no códon 12/13, material foi deixado a partir de apenas 200 dos 231 pacientes (86,6%). Portanto, o DNA genómico foi extraído de microdissecação de áreas de tecido contendo tumor tal como previamente descrito [19]. Piro-sequenciação foi realizada utilizando o kit de piro-ouro (Qiagen, Alemanha) e Taq-polimerase HotStar (Qiagen, Alemanha). O iniciador PF2 foi utilizada para determinar as sequências anti-sentido. O dispositivo PyroMark Q24 (Qiagen, Alemanha) e o software PyroMark ™ Q24 foram utilizados para sequenciação e análise de sequência [20], [21].

instabilidade de microssatélites análise

Para determinar o status da estabilidade de microssatélites [estabilidade de microssatélites (MSS) ou instabilidade de microssatélites de alto grau (MSIH)], dois marcadores mononucleótido repetição BAT-25 e BAT-26 foram investigadas. O ADN foi amplificado num PCR duplex (kit Qiagen ADN Multiplex PCR, primers de 100 nM BAT25 e 100 nM BAT26 específicas– Tabela S3) aplicar o seguinte perfil de ciclo: desnaturação a 95 ° C durante 15 min, 34 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 57 ° C durante 90 seg e extensão a 72 ° C durante 60 segundos, com uma extensão final a 60 ° C durante 30 min, como descrito anteriormente [22], [23]. 1 uL do produto de PCR foi misturado com 18,5 ul de formamida desionizada altamente (Hidi formamida) e 0,5 ul de ADN de tamanho padrão LIZ 500 /(-250) (ambos da Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha). Esta mistura foi desnaturada durante 3 min a 94 ° C, imediatamente colocado em gelo, e separados utilizando um ABI 3130 Genetic Analyzer. Os resultados foram analisados ​​usando GeneMapper Software (Applied Biosystems).

A análise da expressão do KRAS4A formas de splicing e KRAS4B

Para esta investigação material suficiente foi deixado por apenas 128 de 231 amostras de tumores (55,4 %). Portanto, o RNA total foi isolado a partir de áreas tumorais microdissecadas usando kits RNeasy (Qiagen; 74404) como descrito anteriormente [24]. As concentrações de RNA foram medidos por fotometria UV. 200-1000 ng de isolados de ARN foram transcritas inversa na presença de 100 uM iniciadores hexâmeros aleatórios e de 200 U de Transcriptase Reversa RevertAid (tanto por Fermentas, St. Leon, Alemanha; SO142, EP0441). 2 uL do produto em bruto da reacção de RT-se utilizado como molde em RT-qPCRs empregando luz Cycler 480 Sondas mestre (Roche; 04902343001) com pares de iniciadores específicos e universais ProbeLibrary Probes (Roche – Tabela S3). Cp (ponto crítico) valores de RT-qPCRs específicos para

KRAS4A, KRAS4B

eo gene de referência

HPRT

(

hipo-xanthin phosphoribosyl- transferase

) foram determinados empregando uma LightCycler 480 dispositivo (Roche). Todas as concentrações de

KRAS4A, KRAS4B

RNAs espec�icos foram normalizados na expressão do

HPRT

gene (ΔCp). As experiências foram efectuadas em duplicado e repetidos pelo menos duas vezes. Para validar o sistema experimental, as quantidades relativas das duas variantes de processamento e KRAS4A KRAS4B foram avaliados em linhas celulares SW948 e HCT15 como tinha sido descrito que SW948 expressar mais do que KRAS4A variante HCT15 células [25]. Este resultado foi reprodutível (Figura S3) validando o conjunto experimental. Além disso, o nosso sistema de leitura demonstrada de alta robustez, curvas de calibração utilizando quantidades definidas de DNA modelo mostrou linearidade, pelo menos, ao longo de quatro log escalas até 100 cópias do tipo específico de RNA (Figura S3).

A análise estatística

As tabulações cruzadas foram calculadas pelo teste exato de Fisher. A análise de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a sobrevida específica por câncer. Significado da estatística de Kaplan-Meier foi testado aplicando o teste de log-rank. A análise multivariada foi feito usando o modelo de regressão de Cox multivariada. As estatísticas foram calculadas usando SPSS versão 15.0 (SPSS Inc.). p-valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

Pacientes e amostras

O rastreio de amostras de cancro foi realizado em pacientes submetidos à ressecção cirúrgica com intenção curativa. entre 1994 e 2004 em nossa instituição. A selecção das amostras foi limitado a adenocarcinomas colorrectais com diferenciação moderado (G2), t-categorias T2 e T3 em pacientes que não tivessem nodal (N0) nem metástases distantes (M0) no momento do diagnóstico, e limitado a pacientes que receberam apenas tratamento cirúrgico . Isto resultou numa recolha de 231 pacientes para a análise. A coleção consistiu em 55% do sexo masculino e do sexo feminino 45%. 64% dos pacientes tinham mais de 65 anos (idade média de 56 ± 8,1 anos), enquanto os restantes 36% dos doentes tinham uma idade média de 75 ± 6,9 anos. 85% dos doentes foram diagnosticados com um tumor na fase T3, enquanto 15% dos pacientes foram afectados por um tumor no estádio T2. Os dados de sobrevivência foi censurado como o caso do acompanhamento foi interrompido ou pacientes morreram por outras razões do que o cancro colorectal. As características desta população de pacientes estão resumidos na Tabela 1.

TRAIL-R1 e TRAIL-R2 coloração em amostras de câncer colorretal

Para avaliar a coloração de Trail-receptores em amostras de tumor em primeiro lugar, executada uma análise semi-quantitativa com base na classificação de amostras de acordo com a ausência de coloração, ou a presença de uma intensidade de coloração forte ou fraca para os respectivos receptores. De acordo com este critério, 87 (38%) de amostras de cancro de cólon mostraram uma forte coloração positiva, 129 (56%) mostraram uma coloração fraca, enquanto que 15 (6%) amostras coradas completamente negativa para TRAIL-R1 (Figura 1). Como TRAIL-R2 em amostras de tumores foi examinada, uma coloração forte foi observada em 110 (48%) dos casos, uma coloração fraca em 116 (50%), enquanto que apenas 5 (2%) das amostras coradas negativo para TRAIL-R2 (Figura 1). Em uma análise subsequente foi possível determinar a distribuição celular de TRAIL-R1 e TRAIL-R2, classificando as amostras de tumor de acordo com a presença ou ausência de coloração para os respectivos TRAIL-receptores nas membranas celulares. Tal como avaliado por coloração imuno-histoquímica e o padrão de fluorescência sobreposição de TRAIL-receptores e de E-caderina, coloração da membrana para TRAIL-R1 pode ser detectada em 163 (71%) casos, ao passo que a coloração negativa ou exclusivamente coloração citoplasmática foi encontrada em 68 (29 %) casos. Para a coloração de membrana TRAIL-R2 foi observada em 36 casos (16%); coloração citoplasmática ou negativa foi observada em 195 casos (84%).

Assim, enquanto a maioria das amostras de tumor coradas completamente positivo para TRAIL-receptor 1 e 2, a fracção de amostras de tumor que mostram a coloração de membrana para estes receptores, era consideravelmente mais baixo. Quando a intensidade de expressão e a distribuição celular do Trail-receptores em amostras de tumor foram analisados ​​em relação a diferentes variáveis ​​clínico-patológicas, incluindo KRAS-mutação ea presença de instabilidade de microssatélites, nenhuma correlação pode ser detectado como julgado pelo teste exato de Fisher (Tabelas S1 e S2).

significado prognóstico da expressão do receptor de TRAIL e localização celular no cancro colorectal

Quando a expressão de TRAIL-receptores foi considerado em relação à sobrevivência de pacientes com câncer colorretal, TRAIL -R1 intensidade de coloração (alta expressão vs. baixa /nenhuma expressão) foi associado a um significativamente melhor prognóstico: a sobrevida de pacientes com tumores com global superior TRAIL-R1 expressão 5 anos foi de 70% vs. 56% dos pacientes com baixa ou completamente sem coloração para TRAIL-R1; a sobrevivência de 10 anos para estes pacientes foi de, respectivamente, 31% vs. 25% (p = 0,008; Figura 4A). Além disso, quando as amostras de tumor foram categorizados de acordo com a presença ou ausência de coloração da membrana para TRAIL-receptores, os pacientes com tumores que exibem coloração TRAIL-R1, sobre a superfície das membranas celulares foram mostrados para ter um melhor prognóstico versus pacientes com ou sem coloração citoplasmática (com 5 anos de sobrevida de 65% vs. 44%; a sobrevivência de 10 anos: 30% vs. 22%, p = 0,003 – Figura 4B)

(A) enredo sobrevivência dos pacientes acometidos por acc câncer colorretal. . para TRAIL-R1 intensidade de coloração. Neste e nos gráficos seguintes casos censurados são indicados por uma cruz. curvas (B) de sobrevivência da população mesmos dos pacientes classificados de acordo com a coloração TRAIL-R1 na membrana celular. (C) Survival parcela de pacientes de acordo com a intensidade da coloração para TRAIL-R2 (forte vs. fraca expressão). plot (D) a sobrevivência da população no mesmo paciente categorizados de acordo com distribuição celular TRAIL-R2. (E) A sobrevida dos pacientes de acordo com o status de coloração da membrana de ambos os Trail-receptores. As curvas de Kaplan-Meier representar sobrevida global relacionada com a coloração da membrana do receptor de TRAIL 1 e 2 pacientes com tumores vs coloração negativa para ambos os receptores de TRAIL.

Quando coloração TRAIL-R2 foi considerado, a sua intensidade de expressão não se correlacionou significativamente com a sobrevivência (p = 0,17; Figura 4C). No entanto, se os pacientes foram estratificados de acordo com a presença ou a ausência de coloração em membranas de células, coloração da membrana para TRAIL-R2 em amostras de tumor correlacionados com uma significativamente melhor sobrevivência do paciente (5 anos de sobrevivência: 83% vs 57%; 10- sobrevida em um ano: 38% vs. 26% p = 0,015; Figura 4D). Quando a sobrevida dos pacientes foi analisada de acordo com a positividade duplo para TRAIL-receptores, ou seja, quando a sobrevida de pacientes com coloração da membrana simultânea para TRAIL-R1 e TRAIL-R2 foi comparada com a de pacientes que exibem nenhuma mancha ou coloração citoplasmática única, a sobrevivência de pacientes com coloração da membrana para ambos os receptores de TRAIL-aumentou para 92% vs 44% dos pacientes com nenhuma coloração membranosa (p = 0,012, Figura 4E). Uma análise mais aprofundada considerando a, possivelmente, que, conforme relatado anteriormente, as mutações KRAS, uma menor quantidade do KRAS4A variante de splicing em relação ao KRAS4B variante de splicing ou um MSI-fenótipo podem influenciar a sobrevivência de pacientes de cancro colorrectal [26] – [28] , não mostrou qualquer efeito prognóstico significativo na coorte dos nossos pacientes (Figura S2).

Finalmente, para avaliar a influência específica de Trail-receptores de coloração sobre a sobrevivência, uma análise de regressão de Cox incluindo simultaneamente a distribuição celular de TRAIL receptores, foi realizada a sua intensidade de coloração e outras variáveis ​​clínico-patológicas relevantes. Isso mostrou que a coloração de membrana para TRAIL-R1 e para TRAIL-R2 individualmente e independentemente prediz a sobrevivência dos nossos pacientes com câncer colorretal coletiva (TRAIL-R1: p = 0,019, RR 2,06 [1,12-3,77]; TRAIL-R2: p = 0,033 , RR 3,63 [1,11-11,84]). Por outro lado, apesar da associação significativa encontrada no teste de longa grau, a intensidade da coloração /expressão de TRAIL-receptores não pode ser confirmado como fator de risco independente para a recorrência (Tabela 2).

discussão

TRAIL-receptores na fisiopatologia e terapêutica de câncer colorretal

foi mostrado a perda de Trail-receptores para jogar um papel importante no desenvolvimento do câncer. Em particular, vários estudos apoiar a noção de que TRAIL sinalização peças

in vivo

uma função importante na prevenção da formação de metástases [29] – [32]. Recentemente, foi também mostrado que a expressão de TRAIL-receptores correlaciona-se com o de diversos marcadores de apoptose, proporcionando assim uma ligação entre o papel funcional destes receptores e o seu significado prognóstico [33].

Os anteriores relatórios sobre a quase expressão ubíqua de Trail-receptores no CRC representada a justificativa para o uso de Trail-receptores de agentes de direccionamento para o tratamento deste tumor. Surpreendentemente porém, enquanto a perda frequente de Trail-receptores relatado por várias entidades de tumor pode representar um obstáculo à eficácia clínica desses compostos [8], [10], [34], [35] nenhuma avaliação sistemática da coloração da membrana de TRAIL receptores em amostras de CRC está disponível. Além disso, os primeiros relatórios sobre os ensaios clínicos de fase precoce com TRAIL-receptores destinados anticorpos agonistas no CRC não conseguiu mostrar sinais claros de eficácia [36] solicitando uma investigação mais aprofundada sobre Trail-receptores como alvo terapêutico no tratamento deste tumor. Para abordar esta questão, baseando-se em nossas recentes descobertas no carcinoma hepatocelular [8] adotamos a avaliação da distribuição celular da TRAIL-receptores como critério para avaliar o seu significado prognóstico. Além disso, para reduzir os fatores de polarização potenciais, decidimos analisar um coletivo paciente homogéneo com tumores em estágio inicial com nenhuma cirurgia metástase submetidos somente.

relevância prognóstico do TRAIL-receptores intensidade de coloração

De acordo com estudos anteriores [10], [12], [13], em nossa coorte a grande maioria das amostras apresentaram coloração positiva para TRAIL-R1 e TRAIL-R2, cerca de metade das amostras mostram uma forte coloração (Figura 1). Como avaliamos o significado prognóstico da TRAIL-receptores de coloração, TRAIL-R1 graus de marcação intensidade (forte vs. baixo /não-coloração) mostrou uma correlação significativa com a sobrevivência no teste de longa-rank, maior intensidade de coloração TRAIL-R1 sendo associado com melhor sobrevida (p = 0,008, Figura 4A); em contraste, TRAIL-R2 intensidade de coloração, KRAS status, a quantidade relativa do KRAS4A variante de processamento ou MSI-fenótipo não mostrou correlação com a sobrevivência (Figura 4C, figura S2). Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que relataram uma correlação positiva entre a sobrevivência dos pacientes e expressão de TRAIL-R1 [10], [33]. Por razões desconhecidas, também foram relatados nenhum efeito [13] ou mesmo uma correlação negativa para TRAIL-R1, mas correlação positiva na moda para TRAIL-R2 com a sobrevivência [12].

relevância prognóstico da distribuição celular da TRAIL- receptores como alternativa à intensidade de coloração

na tentativa de esclarecer melhor esta questão, posteriormente avaliado se a presença ou ausência de coloração da membrana de Trail-receptores poderia melhor se correlacionam com a sobrevivência, em seguida, a única avaliação da sua intensidade de coloração. Em contraste com a coloração quase ubíquo para TRAIL-receptores, uma fracção considerável de amostras apresentaram coloração da membrana negativo para TRAIL-R1 e TRAIL-R2 (Figura 2). Ao adoptar este critério, sobrevivência de cinco anos em pacientes com tumores exibindo TRAIL-R1 ou coloração TRAIL-R2 em membranas celulares foi maior do que os pacientes que não apresentam manchas ou coloração citoplasmática única (Figura 4). Os pacientes portadores de tumores com coloração da membrana de duplo positivo para ambos os Trail-receptores sobreviveram significativamente mais tempo em comparação com pacientes que apresentam coloração da membrana dupla negativa (Figura 4E). O facto de a análise multivariada compreendendo o efeito da distribuição celular de TRAIL-receptores, bem como a da sua intensidade de coloração, este último pode não ser confirmado como factor de prognóstico independente sugere que a detecção de TRAIL-receptores de coloração sobre a membrana celular é o principal determinante da sobrevivência: isto é consistente com os dados disponíveis para pacientes afetados por carcinoma hepatocelular [8], com a recente

in vitro

evidências sobre o papel dos receptores TRAIL internalização na resistência à TRAIL [18] , e com a noção de que TRAIL-receptores ligados à membrana são expostos ao efeito de TRAIL circulante. Estudos anteriores tinham mostrado nenhum significado prognóstico para TRAIL-R2, ou apenas uma tendência para uma correlação positiva entre a expressão deste receptor e sobrevivência [12]; Nossa hipótese é que falha em reconhecer o papel de TRAIL-R2 na determinação da sobrevida dos pacientes em estudos anteriores reflete o significado prognóstico mais elevada da distribuição celular da TRAIL-receptores versus a da sua intensidade de coloração.

consequências clínicas da o significado funcional do Trail-receptores de coloração em membranas celulares

a perda de expressão de TRAIL-receptores tem consequências potenciais sobre o emprego de anticorpos agonistas segmentação Trail-receptores neste momento sob investigação clínica como terapia contra o câncer: embora pudéssemos confirmar que a grande maioria dos tumores manchado positivo para TRAIL-receptores, descobrimos que a perda de Trail-receptores na membrana celular é uma característica freqüente de CRC com significado prognóstico predominante; ele deve ser, portanto, considerada, se a não mostrar sinais de eficácia em ensaios clínicos recentes usando Trail-receptores de anticorpos agonistas [36] pode ser atribuído à selecção insuficiente de pacientes com tumores com TRAIL-receptores ligados à membrana. Por outro lado, devido ao somatório dos efeitos prognósticos de TRAIL-R1 e TRAIL-R2, os pacientes que apresentam coloração da membrana para ambos os receptores pode lucrar com a administração combinada de anticorpos dirigidos contra ambos os receptores ou pela administração de TRAIL recombinante [37] .

o facto de, independentemente de sua localização celular, quase todas as amostras de tumor mostrou algum grau de coloração para TRAIL-receptores está de acordo com a noção de que a perda genética ou mutação do Trail-receptores é um evento raro em células de câncer [34], [38]. As diferenças na distribuição celular destes receptores em vez sugere que a deficiência de TRAIL-receptores de tráfico para a membrana celular exterior ou de mecanismos de internalização desempenhar um papel na determinação da perda funcional de TRAIL-receptores. Para este propósito, a endocitose mediada por clatrina foi recentemente descrito como causa de resistência à TRAIL em células de cancro da mama [18] e vários compostos foram mostrados para aumentar a expressão de TRAIL-receptores, bem como sua localização sobre as membranas celulares [39], [ ,,,0],40].