Abstract
Fundo
miRNAs pode ser biomarcadores potencialmente úteis para predição de resposta a agentes quimioterápicos, radioterapia e sobrevivência . O objetivo deste estudo retrospectivo foi validar preditores de resposta de miRNA em uma coorte de pacientes com câncer gastroesofágico, a fim de prever a sobrevida global (SG) e sobrevida específica da doença (DSS).
Material e Métodos
A população do estudo abrangeu 53 pacientes tratados com curativo pretende para o câncer gastroesofágico loco-regional. expressão miRNA foi quantificada a partir de pré-terapêuticos e de diagnóstico, embebidos em parafina espécimes tumorais fixados em formol usando Affymetrix GeneChip miRNA 1,0 Matriz. Com base na inibição do crescimento do painel de NCI60 na presença de cisplatina, epirrubicina e capecitabina, um preditor de resposta com base miARN foi desenvolvido. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi aplicado para avaliar as correlações da preditor de resposta com OS e DSS.
Resultados
A análise univariada demonstrou uma melhoria estatisticamente significativa de OS para os pacientes que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica com dezenas de previsão acima da pontuação previsão mediana (RH: CI 0,41 (95%:. 0,17-0,96) Ajustar para a cirurgia e estágio, este indicador foi identificado-se independentemente associados com ambos oS (HR: CI 0,37 (95%: 0.16- 0,87)) e DSS (HR:. 0,32 (0,12-0,87))
Conclusão
O preditivo perfil miRNA de sensibilidade à cisplatina, epirrubicina e capecitabina mostrou-se independentemente associados com OS e DSS em pacientes com câncer gastroesofágico
Citation:.. Winther M, Knudsen S, Dahlgaard J, Jensen T, Hansen a, Jensen PB, et al (2016) Impacto clínico de um romance MicroRNA Chemo-Sensibilidade Predictor em . gastroesofágico Cancer PLoS ONE 11 (2):. e0148070 doi: 10.1371 /journal.pone.0148070
editor: Soheil S. Dadras, da Universidade de Connecticut Health Center, United States |
recebidas: 08 de outubro de 2015; Aceito: 12 de janeiro de 2016; Publicação: 17 de fevereiro de 2016
Direitos de autor: © 2016 Winther et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos os microRNA arquivos de dados estão disponíveis no banco de dados Omnibus Gene Expression. O DOI para localizar estes dados serão postadas nos comentários para este trabalho
Financiamento: O estudo foi apoiado financeiramente pela Danish Cancer Society, cirro – A Fundação Centro Lundbeck para Interventional Research in Radiation Oncology e o dinamarquês. Conselho para a Investigação Estratégica, Karen A. Tolstrups Fond, a Fundação AP Moeller para o avanço da ciência médica e Dansk Kraeftforsknings Fond
interesses concorrentes:. os autores leram a política da revista e têm os seguintes interesses concorrentes: SK , PBJ, JD, TJ e AH declarar passado ou presente de emprego primária ou propriedade sobre Medical Institute Prognosis que tem um potencial de beneficiar a partir destes resultados. Medical Prognosis Instituto detém um pedido de patente sobre o assunto (WO2011135459: métodos e dispositivos para identificação de biomarcadores de resposta ao tratamento e à sua utilização para prever Tratamento Eficácia). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
quimioterapia e radioterapia são estratégias terapêuticas essenciais para o tratamento do câncer. No entanto, devido à resistência intrínseca ou adquirida tratamento, quimioterapia e radioterapia não conseguem eliminar todas as células tumorais [1]. Além disso, as respostas ao mesmo tratamento são muitas vezes em contraste em pacientes com cancros aparentemente idênticos e para pacientes que não respondem ao tratamento, o tempo perdido pode ser prejudicial irrecuperavelmente.
medicina precisão é uma abordagem promissora para a melhoria da resposta terapêutica e as taxas de sobrevivência, tendo em conta a variação genética em adição à variação na expressão do gene. Assim, a identificação de biomarcadores preditivos de resposta a agentes quimioterápicos e radioterapia é de grande valor clínico. No câncer de investigação clínica, microRNAs (miRNAs) são biomarcadores com potencial significativo devido a ambos os tecidos-especificidade e expressão aberrante em células tumorais [2]. miARNs são pequenas, endógeno, RNAs não-codificantes que actuam como reguladores de pós-transcricional, de segmentação para a degradação de ARNm ou de translação repressão [3]. Eles estão envolvidos na regulação de numerosos processos biológicos incluindo a génese tumoral, funcionando como supressores de tumores ou oncogenes [3,4]
Além disso., MiARN perfil de expressão foi mostrada para ser associada com a progressão do tumor e a resposta terapia, sugerindo sua utilização como biomarcadores prognósticos e preditivos, bem como o seu papel importante na regulação da sensibilidade de drogas [5,6]. Identificação de miRNAs preditivo de resposta ao tratamento oferece uma oportunidade altamente promissora para direcionar decisões clínicas para a escolha do tratamento e melhorar o resultado da doença.
Neste estudo retrospectivo de pacientes com câncer gastroesofágico, foi aplicada uma nova abordagem bioinformática . Com base na inibição do crescimento de 60 linhas celulares de cancro humano (NCI60), submetido a cisplatina, epirrubicina e capecitabina, além de, miARN expressão da linha de base das linhas de células de 60, um preditor de resposta baseado em miARN para os três agentes quimioterapêuticos foi desenvolvido. O objetivo deste estudo foi validar o preditor de resposta em pacientes com câncer gastroesofágico loco-regional tratados com intenção curativa, a fim de prever o resultado em termos de sobrevida global ea sobrevida específica da doença.
Materiais e Métodos
Os pacientes
A população do estudo consistiu de 53 pacientes diagnosticados com câncer gastroesofágico loco-regional (câncer da junção gastro-esofágico (JGE) ou câncer gástrico (GC)) com disponíveis pré-terapêutica e de diagnóstico, formalina -Fixed, embebidos em parafina espécimes (FFPE) tumorais com material suficiente para análise microarray miRNA (pelo menos 400 ng de RNA total). Todos os pacientes foram diagnosticados com câncer gastroesofágico loco-regional no período 2009-2012 e tratados com intenção curativa no Departamento de Oncologia do Hospital Universitário Aarhus, na Dinamarca. parâmetros clínico-patológicos foram obtidas de registros médicos e relatórios de patologia. Somente TNM-estágios estavam disponíveis a partir dos registros médicos e, portanto, os pacientes foram retrospectivamente encenado pelos autores de acordo com as quinta-sétima edições das orientações de estadiamento AJCC /UICC. O estudo foi aprovado pelas comissões Região Dinamarca Central de Saúde de Ética em Pesquisa e da Agência de Protecção de Dados dinamarquesa e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia. Dispensa de obtenção de consentimento informado dos pacientes na população do estudo foi dada pelas comissões Região Dinamarca Central de Saúde Ética em Pesquisa como o estudo não induz qualquer risco para a saúde ou seria qualquer encargo para os participantes. As informações do paciente foi anónimos e de-identificados antes da análise.
Todos os pacientes tinham sido tratados com quimioterapia perioperatório com a cisplatina, epirrubicina e capecitabina. Nem todos os pacientes receberam quimioterapia de dose completa. Um perfil preditor miARN, correlacionada com a sensibilidade do tratamento em NCI60 dos três agentes quimioterapêuticos, foi desenvolvido. paciente e da linha de base de tumor características estão listadas na Tabela 1.
Isolamento de ARN e quantificação de miARN
O ARN total foi extraído a partir de cinco lâminas consecutivas de secções tumorais FFPE pré-tratamento de 12 um utilizando o RECOVERALL
™ kit de isolamento total de ácido nucleico para FFPE (Ambion, Inc. 2130 Woodward St. Austin, TX) de acordo com o protocolo do fabricante. Verificação de carcinoma invasivo em hematoxilina e eosina lâminas FFPE foi realizada por um patologista experimentado (TT). A fracção média de área do tumor (definida como a área de carcinoma invasivo) foi estimada em 57% (intervalo: 5-100). Quantificação de RNA total foi realizado utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Tecnologia, Wilmington, Delaware). miRNA foi rotulado usando FlashTag
™ HSR Biotina RNA Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) e hibridizadas para a versão GeneChip miRNA 1.0 microarrays (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acordo com detalhes do manufactorer. As matrizes foram lavadas e coradas com um Affymetrix Fluídica Estação 450X e digitalizado em um scanner Affymetrix G7 de acordo com as instruções do fabricante. Normalização de dados microarray miRNA foi realizado em R usando Robust Multi-gama média (RMA). Todos os miRNAs foram mensuráveis em todas as amostras de tumores de pacientes 53.
desenvolvimento Predictor baseado em ensaio in vitro
Para avaliar a correlação entre a expressão de miRNA e sensibilidade de drogas, inibição do crescimento (GI50) vetores de 60 células linhas sujeitas a cisplatina, epirrubicina e capecitabina foram baixadas no site da DTP. Correlação entre miRNA expressão e de drogas sensibilidade foi calculada para cada combinação de miRNA-drogas. MicroRNAs com uma correlação acima de 0,25 (positivamente correlacionada miARNs) ou abaixo -0,25 (negativamente correlacionada miARNs) foram seleccionadas para cada tratamento (S1 Tabela), e, em seguida, combinada, a fim de prever a resposta ao tratamento de combinação. Assim, um perfil de resposta miARN foi desenvolvido no qual os níveis de expressão foram correlacionados com a sensibilidade de cisplatina, epirrubicina e capecitabina.
Predição de quimio-sensibilidade em amostras clínicas
A expressão normalizada de cada miARN num perfil de resposta foi utilizada para prever a sensibilidade rodando os níveis de expressão de miARN num único escore de predição. Assim, para cada paciente, a sensibilidade à estratégia de tratamento recebido foi calculada como a diferença entre a média dos miRNAs positivamente correlacionados ea média dos miRNAs correlacionados negativamente: Previsão pontuação = média (positivamente correlacionada miRNAs) -mean (correlação negativa miRNAs). Cada miRNA no perfil foi dado o mesmo peso. Em seguida, o escore de predição foi normalizado para uma escala de 0 a 100 por uma transformação linear do escore de predição de todas as amostras de doentes; uma pontuação de zero significava menos sensível e uma pontuação de 100 significou mais sensível ao tratamento dado. Para cada paciente, foi calculada uma pontuação de sensibilidade prevista para a estratégia de tratamento recebido.
Estatísticas
Um plano de análise estatística, com critérios pré-especificados de sucesso, foi realizada antes do início do estudo. Os escores de sensibilidade tratamento para cada paciente foi previsto antes de desocultação dos dados clínicos. O desfecho primário foi a sobrevida global (OS), definido como o intervalo de tempo entre o diagnóstico de câncer gastroesofágico à morte por qualquer causa ou último follow-up (11 de agosto
th 2014) e para a sobrevivência específica da doença resultado secundário, definido como o tempo desde o diagnóstico até a morte a partir de ou com câncer gastroesoophageal ou último dia de follow-up (11 de agosto
th 2014).
análises de sobrevivência foram realizadas por dicotomizando as pontuações de previsão usando a pontuação mediana como uma cortada. Os pacientes foram previstos acima sensível cortado e resistente inferior ou igual a cortar. estimativas de sobrevivência foram calculadas de acordo com o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo univariada Cox modelo de riscos proporcionais para avaliar as associações entre os escores de predição e OS ou DSS. A assunção de riscos proporcionais foi verificada com parcelas log-menos-log e resíduos de Schoenfeld. multivariadas foram realizadas para ajustar fatores de importância prognóstica presumido. taxas de risco (HR) para ambas as análises uni e multivariada são apresentados em 3 anos, com intervalo de confiança de 95% (CI). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Stata versão 12 (StataCorp, College Station, TX, EUA).
Resultados
Resultado análise
O tempo médio de acompanhamento para todos pacientes foi de 23 meses (intervalo: 4-54 meses) e a taxa de oS de 1 ano foi de 79% (IC 95%: 66-88) ea taxa oS 3 anos 44% (IC 95%: 30-58). No momento da avaliação, 30 pacientes (57%) morreram, dos quais 24 pacientes morreram de câncer primário. Resposta radiográfica foi observada em 30 pacientes (60%) entre os 50 pacientes com avaliação do tratamento tomografias disponíveis. Nenhum paciente obtido resposta patológica completa (definida como nenhuma evidência de células tumorais residuais vitais remanescentes na amostra ressecados após quimioterapia neoadjuvante). paciente linha de base e de tumor características estão listadas na Tabela 1.
Associação entre a sensibilidade previu e sobrevivência
Usando o painel linha de células do NCI60, sensibilidade para com cisplatina, epirrubicina e capecitabina foi correlacionado com o miRNA linha de base expressão de 1756 miRNAs humanos e outros RNAs nucleolares pequenas nas mesmas linhas celulares. Ambos os miARNs ser correlacionada positivamente e negativamente correlacionada com cada um dos três agentes quimioterapêuticos foram identificados. Em S1 Mesa, miRNAs utilizados para prever a resposta são listados. Através da utilização de amostras tumorais FFPE de diagnóstico e terapêuticos a partir de pré-estudo na população, os níveis de expressão de miARN foram medidos. A fim de prever a sensibilidade, níveis de resposta o perfil de expressão de miARN foi transformado em uma pontuação predição único numa escala de zero a 100, como descrito anteriormente. A pontuação de zero representaram baixa sensibilidade e uma pontuação de 100 de alta sensibilidade
Quando estratificados pelo escore de predição mediana, tendências de aumento do OS (HR: 0,53 (95% CI: 0,25-1,14)). E DSS ( HR: 0,57 (95% CI: 0,24-1,34)) foram mostrados para pacientes com contagens de previsão acima da mediana. A cirurgia é a pedra angular desta estratégia de tratamento e análise adicional de somente aqueles pacientes que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica (N = 49) mostrou uma melhoria significativa de OS (HR: CI 0,41 (95%: 0,17-0,96)) e uma significativa limítrofe reforçada DSS (HR: CI 0,40 (95%: 0,15-1,08)). para pacientes com contagens de previsão acima mediana, Fig 1.
escores de predição são dicotomizados pela pontuação média
em uma análise multivariada, o escore de predição foi identificado como sendo um marcador independente de prognóstico para ambos oS (HR: CI 0,37 (95%: 0,16-0,87)) e DSS (HR: 0,32 (0,12-0,87)) após ajuste para a cirurgia e palco, Tabela 2.
Discussão
gastroesofágico cancros são doenças malignas com taxas de má resposta aos regimes de tratamento padrão, resultando em uma taxa de sobrevida global em 5 anos de apenas 15-25% [ ,,,0],7,8]. miARN pode ser biomarcadores potencialmente úteis para a previsão da resposta a agentes quimioterapêuticos. Neste estudo, um perfil de miARN preditivo para a sensibilidade ao cisplatino, epirrubicina e capecitabina foi desenvolvido em 53 pacientes com cancro gastro-esofágico. A análise univariada incluindo apenas os pacientes que tinham sido submetidos a ressecção cirúrgica mostrou uma melhoria estatisticamente significativa de OS para pacientes com contagens de previsão acima cortada. Além disso, uma análise multivariada identificou o escore de predição de forma tão independente correlacionada com ambos OS e DSS. Esse resultado promissor é encorajador e uma nova maior estudo prospectivo é necessário para validar a utilidade clínica potencial do preditor.
O desenvolvimento dos perfis de previsão de miRNA foram baseados em uma nova abordagem bioinformática, publicado anteriormente em difuso de grandes linfoma de culas B (DLBCL) [9]. Utilizando o painel de NCI60, desenvolveram-se dois perfis de miARN ao qual os níveis de expressão correlacionados com sensibilidade para os tratamentos de combinação de CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona) e CHOEP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, etoposido e prednisona). Nesse estudo, os perfis de miARN previram com êxito a resposta ao tratamento em doentes com DLBCL.
Capecitabina é um pró-fármaco que é enzimaticamente convertida em 5-f luorouracilo no corpo. O
in vitro
perfis de resposta derivadas para as duas drogas têm sobreposições e diferenças. Neste estudo, foi utilizado o respectivo
in vitro perfil
para o respectivo medicamento usado na clínica.
Previsão da resposta à terapia de combinação foi realizada através da combinação de preditores de drogas individuais. Para a previsão de sucesso de resposta, perfis para a cisplatina, epirrubicina e capecitabina foram combinadas. Ao analisar os preditores individuais em uma análise multivariada, os cisplatina e epirrubicina preditores mais contribuiu, enquanto o indicador capecitabina contribuiu menos (dados não mostrados).
falha terapêutica é amplamente observado na prática clínica devido a qualquer intrínseca ou adquiriu resistência à quimioterapia ou radioterapia. miARNs ter sido demonstrado que desempenham papéis importantes na regulação de drogas e radiação sensibilidade no cancro gastro-esofágico. No cancro esofágico, Hamano et al relatou que a sobre-expressão de miR-200c foi significativamente correlacionada com má resposta à quimioterapia baseada em cisplatina, potencialmente através de up-regulação da Akt-via (PPP2R1B) [10] e Tanaka et al mostraram que a alta pre Os níveis de expressão -Tratamento de miR-200c no soro foram significativamente associados com resposta inadequada a quimioterapia à base de cisplatina [11]. Em células de cancro gástrico, no entanto, a sobre-expressão de miR-200c tem sido correlacionada com o crescimento do tumor reduzido e migração [12], para além da sensibilidade cisplatina reforçada [13]. Esses resultados conflitantes indicam as diversas implicações de miR-200c em diferentes tipos de câncer. Neste estudo, o miR-200c foi incluído como preditor em resposta a epirrubicina (negativamente correlacionados). MiARNs
Em comum com o perfil de resposta de miARN do presente estudo, vários outros estudos identificaram a ser associada com a eficácia quimioterapêutica no câncer gastroesofágico. Por exemplo, HSA-deixou-7c tem sido mostrado para ser associado com prognóstico e ser um marcador de sensibilidade ao cisplatino através da regulação da via de IL-6 /STAT3 em pacientes com cancro esofágico [14] e miR-141 tem sido encontrado para exercer efeitos anti-apoptóticos que confere resistência a cisplatina em linhas celulares de cancro esofágico, possivelmente através da regulação negativa de YAP1 [15]. No presente estudo, tem-deixou-7c foi negativamente correlacionada com a capecitabina e miR-141 foi negativamente correlacionada com epirrubicina. Em outro estudo, o pré-tratamento miR-505 estrelas e miR-99b mostraram-se significativamente correlacionada com a resposta patológica em pacientes com adenocarcinoma esofágico [16]. No presente estudo, miR-505-estrelas foi negativamente correlacionada com a capecitabina e miR-99b correlacionada negativamente com capecitabina e epirrubicina.
Em conclusão, a previsão perfil miRNA de sensibilidade à cisplatina, epirrubicina e capecitabina foi mostrado para se independentemente associados com o OS e DSS em pacientes com câncer gastroesofágico. Esse resultado promissor é encorajador e uma nova maior estudo prospectivo se justifica a fim de validar a utilidade clínica potencial do preditor.
Informações de Apoio
Tabela S1. Listas de microRNAs para todos os preditores de drogas e combinações utilizadas.
Para cada tratamento a lista de conjuntos de sondas Affymetrix na matriz miRNA versão 1.0 são mostrados com a sua ID Affymetrix. Sondas mostradas na roman são positivamente correlacionados, sondas em itálico são negativamente correlacionados. Para tratamentos combinados, perfis individuais são combinados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0148070.s001
(DOCX)
Agradecimentos
Os autores agradecem Mogens Jons Johannsen para excelente assistência técnica. O estudo foi apoiado financeiramente pela Danish Cancer Society, cirro-A Fundação Centro Lundbeck para Interventional Research in Radiation Oncology e do Conselho Dinamarquês para a Investigação Estratégica, Karen A. Tolstrups Fond, a Fundação AP Moeller para o avanço da ciência médica e Dansk Kraeftforsknings Fond.