Abstract

Fundo

células-tronco cancerosas (CSC) são pensados ​​para ser responsável pela manutenção do tumor e heterogeneidade. Bona fide CSC purificada a partir de biópsias de tumores são limitados em oferta e isso dificulta estudo da CSC biologia. Além disso, purificados estaminais-como subpopulações CSC de linhas de tumores existentes são instáveis ​​em cultura. Encontrar um meio para superar esses desafios técnicos seria um objetivo útil. Em um primeiro esforço nesse sentido, examinamos se uma sonda química que promove a sobrevivência de células-tronco embrionárias de murino sem fatores exógenos adicionados podem alterar as características funcionais em linhas de tumores existentes de uma forma consistente com um fenótipo CSC.

Metodologia /as principais conclusões

as sete linhas de tumor do cólon subpainel NCI60 foram expostos a SC-1 (pluripotin), uma quinase e GTPase inibidor duplo que promove a auto-renovação, e depois examinados para tumorigenicidade em condições de diluição limitante e clonogênica actividade em agar mole. Observou-se um aumento estatisticamente significativo na formação de tumores seguinte SC-1 de tratamento (p 0,04). Clonagem eficiência e expressão de antígenos de superfície putativos CSC (CD133 e CD44) também foram aumentadas. SC-1 de tratamento conduziu a esfera formação em algumas linhas de tumores do cólon. Finalmente, SC-1 inibiu da actividade quinase in vitro de rsk2, e outro inibidor rsk2 aumento da formação de colónias implicando um papel para esta quinase em provocar um fenótipo CSC.

Conclusões /Significado

Esses achados validam uma prova de exposição ao estudo do conceito de linhas de tumor existentes para uma pequena molécula pode fornecer uma tratável modelo in vitro para a compreensão CSC biologia

Citation:. Mertins SD, Scudiero dA, Hollingshead MG, Divelbiss RD Jr, Alley MC, Um monks, et al. (2013) uma molécula pequena (Pluripotin) como uma ferramenta para o estudo Cancer Stem Cell Biology: Prova de Conceito. PLoS ONE 8 (2): e57099. doi: 10.1371 /journal.pone.0057099

editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, China

Recebido: 30 Janeiro, 2012; Aceito: 22 de janeiro de 2013; Publicação: 21 de fevereiro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Divisão para o cancro Diagnóstico e Tratamento e Centro de Pesquisa do Câncer do Instituto Nacional do Câncer e parcialmente financiado pelo Contrato NCI HHSN261200800001E. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Dominic A. Scudiero, Anne Monges, e Karen M. Hite são afiliadas à SAIC -Frederick, um contratado do governo NCI-Frederick. Não há patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

células-tronco cancerosas (CSC) é um área de grande interesse para os biólogos cancerosas e que se pensa ser responsável pela manutenção a longo prazo e a expansão de ambos os tumores sólidos e hematológicos [1], [2]. Sob a hipótese de células-tronco do câncer, CSC pode explicar a heterogeneidade do tumor observado que é uma reminiscência do desenvolvimento normal do órgão e a resistência do câncer para terapias padrão [3]. Vias de sinalização, tais como aqueles modulados por Wnt, Hedgehog, e Notch estão implicados na caracterização bioquímica de CSC mas não estão consistentemente encontrada em todos os tipos de tumores. Além disso, os papéis do microambiente do tumor na regulação CSC continuará a ser uma área de intenso estudo [4].

Vários ensaios funcionais são entendidos para representar os auto-renovação, proliferação e diferenciação capacidades esperadas de CSC. Em primeiro lugar, limitando ensaios de diluição de tumorigenicidade representam um método padrão para a identificação de CSC. Este modelo in vivo utiliza ratinhos imunodeficientes inoculados com sub-populações de células de tumor que foram seleccionadas para a expressão de antigénios de superfície de células estaminais de tecidos normais [5] – [7]. Utilizando o mesmo modelo, xenoenxertos secundárias pode ser estabelecida e reexaminados para a transmissão da heterogeneidade do tumor original, confirmando assim ainda mais a presença de CFC. Um segundo ensaio utiliza formação esfera selecionar para CSC expressando marcadores de células tronco e tumorigenicidade [8]. Em terceiro lugar, a actividade clonogénicas, em agar mole foi utilizado para definir CSC [9]. Outros ensaios disponíveis para a caracterização de fenótipos CSC se concentrar em medidas de resistência aos medicamentos, quietude, e resistência à apoptose [10].

Em alguns tipos de tumor, CSC são esperados para ser uma rara subpopulação e os meios para mantê-las em cultura não existe no presente. Um fator complicador relatados por Gupta et al. demonstra que, após enriquecedor para e cultura de uma subpopulação CSC-como em uma linha de tumor de mama, um equilíbrio fenotípica contendo mistos subpopulações retornos [11]. genótipos expressos, no entanto, pode ser utilizado para prever as vias de transdução de sinal operacional, que estabelecem um fenótipo CSC. Modulação desses caminhos relevantes por sondas químicas oferece um meio para entender melhor CSC biologia. Com base neste raciocínio, nós examinamos se a uma molécula pequena, SC-1 (pluripotin), poderia modificar e /ou induzir características consistentes com o fenótipo CSC nas sete linhas de tumor do cólon da linha de tumor NCI60 Painel.

SC-1 foi descoberto numa tela de alto rendimento com base em células que avaliou se uma molécula pequena pode manter a auto-renovação das células estaminais embrionárias de murídeo normais na ausência de factores exogenamente tais como o factor inibidor da leucemia ou células de alimentação [12] adicionada. A estrutura química é baseado num andaime pirimidina 3,4-di-hidropirimido (4,5-d), e foi optimizado por meio de estudos de estrutura /actividade. cromatografia de afinidade estabelecido que alvos moleculares para SC-1 incluem RasGAP e ERK1 /2, e sua inibição é pensado para promover a auto-renovação e inibir a diferenciação.

Neste relatório, oferecemos uma prova de conceito estudo para determinar se populações de células em massa SC-1 tratados das linhas de tumor de cólon NCI60 possuem características consistentes com um fenótipo CSC. Nossos resultados fornecem a base para a prossecução de novas estudos que comprovem a presença de CSC em um tratável modelo in vitro, promover a compreensão das vias bioquímicas que sustentam fenótipos CSC, e determinar se SC-1 é uma ferramenta útil para manter tumor biópsia derivado CSC na cultura.

Resultados

SC-1 Aumento da formação de tumores

Nós pré-tratados populações em massa das sete linhas de tumor do cólon do painel de NCI60 com 0,1 mM SC-1 ( para a estrutura química ver Figura S1), uma pequena molécula mostrado anteriormente para promover a auto-renovação das células estaminais embrionárias de murídeo [12]. Depois de cinco dias de tratamento, foram conduzidos estudos de tumorigenicidade de diluição limitantes utilizando injecções subcutâneas, sem qualquer apoio proteína (Tabela 1). Avaliando todas as linhas de tumor de um único subpainel do NCI60 ajudará a determinar se qualquer efeito devido ao SC-1 é universal ou tumor line-dependente. Cinco das sete linhas de tumor de cólon exibiu um tumor maior índice de pega para linhas SC-1 tratados em relação ao controle no inóculo 10.000 celular, com COLO linha 205 tumor demonstrando a maior diferença na taxa de adesão (controle: 1 de 5 vs. SC-1 tratadas: 4 de 5) seguido por linhas de tumor HT29 HCT-116 e. É também importante notar que, com tão pouco quanto 100 células, os tumores formados em 2 de cinco ratinhos injectados com células SC-1 HT29 tratados em comparação com 0 de 5 para células de controlo tratadas. Houve um aumento estatisticamente significativo na formação de tumores no inoculo 1000 células HT29 para células tratadas bem (Tabela 1). Em contraste, nenhum tumor desenvolvido com a linha de tumor HCT-15, a qualquer diluição (Tabela 1), apesar de os tumores formados em 16 dias, com um tamanho de rotina inoculação (1,5 × 10

6 células por inoculo).

Porque combinando a taxa de absorção do tumor (no inoculo 10.000 células) pode assemelhar-se um estudo clínico com a heterogeneidade do tumor do paciente, a análise estatística foi realizada para avaliar o efeito de SC-1 no tumor tomar taxa da linha de tumor do cólon subpainel. Uma diferença significativa foi encontrada (n = 7, Cochran Mantel-Haenzel odds ratio comuns, tumor controle tomar Classificação: 10 de 35 ratos; SC-1 tratados taxa de absorção 19 de 35 ratos, p = 0,04). Além disso, estes mesmos resultados são traçadas novamente em forma gráfica na Figura S2. A frequência de células tumorais iniciando também foi calculada e apresentada para todas as linhas de tumores e de maioria-1 SC linhas de células sensíveis na Figura S3.

Os dados mostrando aumento tumor tomar taxa foram complementadas pelo aparecimento acelerado de tumores mensuráveis para os SC-1 linhas tratados tumor do cólon, quando calculados a partir de plotagem peso médio do tumor (até 2.000 mg) em função do tempo para cada grupo de tratamento (intervalo de r para linhas de embutidos: 0.73-0.90). Extrapolação foi usada para determinar o dia em que um tumor mg 1000 seria esperada (Tabela 2). Os resultados dos cálculos subsequentes descobriram que 1000 mg tumores, em média, formado após pré-tratamento com SC-1 em menos de metade do tempo do grupo de controlo tratado (n = 5, teste t emparelhado de Student, média ± SEM, SC-1 tratadas : controle dia 83 ± 19 vs. tratados: dia 211 ± 79). Embora esta diferença não foi estatisticamente significativa (p = 0,16), é notável que, para estas 5 linhas tumorais, a tendência foi a mesma:. Anteriormente tempo para 1000 mg aparência tumor de células SC-1 tratados controles vs.

não é provável que a SC-1 observado induzida acelerada

in vivo

taxa de crescimento do tumor poderia explicar o aumento do tumor tomar taxa de SC-1 linhas de tumor tratados porque uma diminuição estatisticamente significativa na célula número depois

foi observada in vitro

SC-1 tratamento. (N = 6, emparelhado teste t de Student, p = 0,02, Tabela S1). Além disso, a média GI

50 para as linhas celulares do cólon, quando avaliada na tela NCI Anticancer (exposição de 2 dias), foi de 0,091 ± 0,07 uM (média ± SEM, n = 7; GI

50 (concentração à que o composto inibe 50% do crescimento das células de controlo)), sugerindo um uniforme

in vitro

inibição de crescimento entre as linhas de tumor. Finalmente, numa proporção de 1 SC-representativo linha de tumor sensível (HCT-116), não houve diferença na distribuição da população de células SC-1 tratada ao longo do ciclo celular em comparação com células de controlo tratadas (Figura S4).

para explorar a falta de um efeito carcinogênico para SC-1 de células HCT-15 tratadas, o ensaio de diluição tumorigenicidade limitante foi repetido com a adição de Matrigel para as células injectadas (10, 100, 1000 e 10000 células por injecção). Um suporte de proteínas tais como Matrigel pode fornecer ancoragem, um substrato para a angiogénese, e factores de crescimento. Neste caso, como visto anteriormente [7], tão poucos como 10 células foram necessários para formar tumores (índice de pega 2 de 5 ratinhos) quando HCT-15 as células de controlo foram co-injectados com Matrigel. Para SC-1 células tratadas co-injectados com Matrigel, 5 de 5 ratinhos tinham a formação de tumores durante o período de observação de 99 dias no inoculo de 10 células (Figura 1). No inóculos de células remanescente (100, 1000 e 10000 células por injecção com Matrigel), os tumores formados em todos os ratinhos, independentemente do tratamento experimental.

ensaio de diluição limitante tumorigenicidade foi realizada com injecção simultânea de Matrigel. A. Controlo tratado HCT-15 linha de tumor. B. SC-1 HCT-15 tratadas linha de tumor. O peso do tumor para cada rato é retratado. a formação de tumores foi aumentada em células SC-1 tratadas quando 10 células /rato foram injectadas (SC-1 tratado: 5 de 5 tumores formados, controlo tratado: 2 de 5 tumores formados). Na maior inóculos de células, todos os ratinhos formado tumores independentes de tratamento. Cada linha em ambos os gráficos representa um crescimento de um tumor por rato (A. A-E, B. F-J).

eficiência de clonagem foi aumentada após SC-1 Tratamento de linhas de tumor de cólon

Devido capacidade aumentada clonogénicas, em agar mole tem sido associada a CSC derivados de tumores do SNC do paciente e da próstata [9], [13], era de grande interesse para avaliar se SC-1 linhas de tumor de cólon tratadas foram afectados de modo semelhante. As linhas 3 de tumor com a maior formação de tumor induzido SC-1 (COLO 205, HCT-116 e HT29) apresentaram aumentos significativos na eficiência de clonagem (Figura 2A, n = 3, teste t emparelhado de Student, p = 0,001 (COLO 205, HCT-116) e P = 0,01 (HT29)), assim como o HCC-2998 e tumorais KM12 linhas. É de notar que todas as linhas de tumor tinha aumentado eficiência de clonagem seguinte SC-1 de tratamento se o ensaio foi realizado utilizando Matrigel em vez de agar mole (dados não mostrados). Assim, SC-1 é encontrado para melhorar a formação de colónias

In vitro

.

O cólon linhas de tumor foram tratados durante cinco dias com 0,1 uM SC-1, colhida e depois analisadas quanto à sua capacidade de formam colónias em agar mole, para alterar a expressão de marcadores de superfície CSC putativos, e para formar esferas. A. A eficiência de clonagem das linhas de tumor de cólon foi determinado após o tratamento com SC-1. Em 5/7 linhas tumorais, SC-1 células tratadas tiveram aumentos estatisticamente significativos na colónia cumulativa unidade (CFU) que formam massa em comparação com células de controlo tratadas (*** p 0,001, ** p 0,1 * p 0,05, n = 3). Em um exemplo (# p 0,05), SC-1 tratamento reduziu a eficiência de clonagem. B. A CD133 subpopulação positivo foi aumentada de 2,5 vezes em SC-1 A linha de tumor do cólon HT29 tratados (p = 0,03, n = 3). A subpopulação CD44 + CD24- foi aumentada após tratamento SC-1 na linha de tumor do cólon HCT-116 (* p 0,05, n = 3). O CD44 + subpopulação foi significativamente aumentada a seguir SC-1 * tratamentos (P 0,05, n = 3) em SW-620 A linha de tumor do cólon. C. Três linhas de tumor (COLO 205, HCT-116, HT-29) formado esferas não aderentes, na presença de 0,1 uM SC-1 em cultura em meios padrão contendo 5% de FBS. Estas observações também foram evidentes no dia 5 em cultura. Todas as imagens foram preparadas em 400 × ampliação.

A expressão de putativos CSC marcadores foram Aumento nas linhas de tumor do cólon seguinte SC-1 Tratamento

Os anticorpos monoclonais especificando antígenos de superfície em amostras de tumor recentemente isolados têm sido utilizados como ferramentas para isolar CSC. Por exemplo, O’Brien et al. [6] e Ricci-Vitiani et al. [14] CSC purificado a partir de tumores colo-rectais através do epitopo CD133 glicosilada. Outros marcadores incluem CD44 CSC (quer na presença ou na ausência de CD24), CD326, CD166 e [5], [9], [15] – [18]. Assim, a expressão destes marcadores foi examinada após cinco dias de tratamento SC-1.

Um aumento estatisticamente significativo no número de células que expressam o epitopo glicosilada CD133 foi encontrado para a linha de tumor HT29 seguinte SC-1 tratamento (Figura 2B, n = 3, emparelhados dois testes t de Student atado, p = 0,003, média ± SEM, tratados de controle: 11,6 ± 3,7% positiva, SC-1 tratados: 27,6 ± 3,6% positiva). Na linha de tumor SW-620, a subpopulação CD44 foi aumentada após o tratamento com SC-1 (Figura 2B, n = 3, teste t emparelhado de Student, p = 0,03, média ± SEM, controlo tratado: 39,6 ± 8,5% positiva, SC -1 tratados: 74,1 ± 13,4% positivo). Sem o aumento da expressão dos marcadores de CSC putativos foi evidente para a linha de tumor COLO 205 (uma linha de tumor sensível SC-1). Não houve mudanças nos CD326 e CD166 expressão na superfície foi observada para qualquer uma das linhas tumorais. Assim, a mudança na expressão de certos marcadores de superfície CSC ocorreu após SC-1 tratamento em linhas de tumor de cólon variadas com a linha de tumor.

Spheres formado na sequência SC-1 Tratamento

formação

Sphere é um CSC característica, quer derivado a partir de tumores de pacientes [18], ou linhas tumorais existentes do cérebro, da mama, da pele ou cultivadas sob condições isentas de soro [8]. linhas tumorais de cólon SC-1 tratadas foram examinadas para a formação de esfera utilizando densidades celulares previamente publicados [19], [20] e na presença de soro. Porque o soro é pensado para conter agentes diferenciadores [21], este ensaio pode ser considerado mais rigoroso do que os outros [22]. Nas linhas de tumor HCT-116 e HT29, esferas não aderentes uniformes com bordas bem definidas formada em 24 horas (Figura 2C), apesar da presença de soro. Além disso, a formação de esfera ocorreu em uma fracção da linha de tumor cultivadas COLO 205 (Figura 2C). Estas mesmas alterações na morfologia também estavam presentes no dia 5 após o tratamento (dados não mostrados). Nas linhas tumorais remanescentes, formação esfera foi encontrada em concentrações mais elevadas do que as que foram testadas aqui (dados não mostrados). O ensaio de formação de esfera foi repetido utilizando condições de soro livre e foram obtidos resultados semelhantes (Figura S5).

SC-1 Tratamento Diminuição Phospho-ERK1 /2 e aumento da expressão OCT4 Protein Níveis

A previous relatório [12] demonstraram que a SC-1 inibiu fosfo-ERK1 /2 níveis de proteína após 30 minutos de exposição em células-tronco embrionárias de murino, resultando na manutenção da auto-renovação

in vitro

sem fator inibidor de linfócitos ou células alimentadoras. Para determinar se a SC-1 atingiu o mesmo alvo nas linhas de tumor de cólon tratadas, mudanças na abundância de fosfo-ERK 1/2 (p-ERK) e total de proteína ERK1 /2 foi avaliada por imunotransf erência em pontos de tempo semelhantes aos estudados anteriormente (Figura 3A). Na linha de tumor tratado HT29, fosfo-ERK 1/2 níveis de proteína (em relação aos níveis totais de ERK1 /2 de proteína) foram reduzidos em 5 min (67 ± 0,06% do valor de controle), atingiu uma calha em 1 hora (46 ± 0,06 % do controlo), e permaneceram diminuiu durante o restante tempo do curso (4 horas, 68 ± 0,10% do valor de controle). Assim, é provável SC-1 está a atingir o seu alvo molecular cognato na linha de tumor HT29.

linhas de tumor de cólon foram tratadas com SC-1 (0,1? M), colhidas, lisadas, e sondadas para as proteínas de de juros após eletroforese em gel de SDS-PAGE nos pontos de tempo indicados. A. Na linha de tumor HT29 SC-1 tratado, fosfo-ERK1 /2 /os níveis totais de proteína ERK1 /2 foram diminuiu para 67 ± 0,06% de valor de controlo em 5 min, 56 ± 0,06% de valor de controlo aos 30 min, e 46 ± 0,06% do valor de controlo a 1 hora (n = 3, p 0,05). B. Aumento da expressão da proteína OCT4 devido ao SC-1 foi dependente da linha do tumor. experiências representativas são mostrados em Figura S4A-B (n = 2).

Os níveis aumentados de expressão de proteína em OCT4 SC 1-linhas tumorais tratadas cólon seria consistente com a identificação de SC-1 numa tela à base de células, que detectada a manutenção de um sinal de GFP mediada por OCT4 em células estaminais embrionárias de ratinho, sem crescimento factores exógenos ou de células de alimentação [12]. OCT4 é um factor de transcrição importante para o desenvolvimento embrionário e regula pluripotência [23]. Portanto, foram avaliadas as alterações nos níveis de proteína Oct4 após a exposição a SC-1. Em duas das linhas de tumor de cólon (7 HCC-2998 e HT29), a expressão da proteína OCT4 foi aumentada com SC-1 de tratamento (Figura 3B). Para as restantes linhas de tumor, a expressão da proteína OCT4-se inalterada ou decresceu. O efeito variável de SC-1 sobre a expressão de proteínas OCT4 não se correlacionou com a formação de tumores. Portanto, é improvável OCT4 desempenha um papel importante nos efeitos SC-1 observados.

SC-1 inibiu rsk2

In Vitro

e uma rsk2 Inhibitor aumento da formação Colony

uma análise bioinformática via de [24], [25] de genes que se correlacionou com a NCI60 GI

50 impressões digitais para SC-1 sugeriram um papel para rsk2 e sua actividade reguladora da via mTOR. Rsk2 (90 kD ribossomal S6 quinase), uma quinase com tanto um N- e domínios funcionais C-terminal, fosforila vários alvos e é fosforilada por ERK1 /2, uma outra SC-1 alvo. Como um efector a jusante, sinais rsk2 muitos comportamentos celulares, incluindo a sobrevivência celular, crescimento, proliferação, migração e [26]. Também é notável que um congénere de SC-1 foi co-cristalizado com Bcr-ABL1 quinase [27], sugerindo que SC-1 pode ter outros alvos moleculares. Examinamos se SC-1 poderia inibir a

in vitro

atividade da quinase de rsk2 e encontraram um EC

50 de 2,5 ± 1,8 mM (Figura 4A, CE

50, a concentração em que as inibe compostos 50% da actividade de controlo, n = 5). actividade inibidora potencial de SC-1 em uma selecção aleatória de outras cinases de proteína (de quinase Aurora B, CHK1, CHK2 e) foi também avaliada no mesmo ensaio e nenhum efeito foi observado (Figura 4A). Para determinar se a actividade de proteína-quinases relacionadas (a) rsk2 na família AGC quinase foi inibida por SC-1, estudos posteriores foram realizados (Tabela 3). Nenhum efeito inibidor sobre a actividade de cinase foi encontrado para Akt1, PKA, PKC e a ou abaixo da concentração máxima testada (10