Abstract
Fundo
A detecção de mutações do gene do cancro críticos em amostras tumorais clínicos podem prever os resultados dos pacientes e informar as opções de tratamento; no entanto, de alto rendimento mutação profiling continua subdesenvolvida como uma abordagem de diagnóstico. Relatamos a implementação de um algoritmo de genotipagem e validação que permite mutação tumor robusta de perfis no ambiente clínico.
Metodologia
Nós desenvolveu e implementou uma mutação otimizado profiling plataforma ( “OncoMap”) para interrogar -400 mutações em 33 oncogenes conhecidos e supressores tumorais, muitos dos quais são conhecidos para prever a resposta ou resistência a terapias específicas. O desempenho de OncoMap foi analisada utilizando ADN derivada de ambos congelado e material clínico FFPE em um conjunto diversificado de tipos de cancro. Uma análise posterior em profundidade foi realizado em histologicamente e gliomas pediátricos clinicamente anotados. A sensibilidade e especificidade do OncoMap foram 93,8% e 100% no tecido fresco congelado; e 89,3% e 99,4% em ADN derivado de FFPE. Detectamos mutações conhecidas em frequências esperadas em cânceres comuns, bem como novas mutações em adultos e cancros pediátricos que são susceptíveis de prever a resposta aumentada ou resistência a terapias contra o câncer existentes ou desenvolvimento. OncoMap perfis também apoiar uma nova estratificação molecular dos gliomas pediátricos de baixo grau com base em
BRAF
mutações que podem ter impacto clínico imediato.
Conclusões
Nossos resultados demonstram a viabilidade clínica de high-throughput mutação profiling para consultar um grande painel de mutações do gene do cancro “acionáveis”. No futuro, este tipo de abordagem pode ser incorporado em ambos os estudos epidemiológicos de câncer e tomada de decisão clínica para especificar o uso de muitos agentes anticâncer direcionados
Citation:. MacConaill LE, Campbell CD, Kehoe SM, Baixo AJ, Hatton C, Niu L, et ai. (2009) Profiling críticos Câncer Gene Mutações em amostras de tumor clínicos. PLoS ONE 4 (11): e7887. doi: 10.1371 /journal.pone.0007887
editor: Chris Jones, do Instituto de Pesquisa do Câncer, Reino Unido
Recebido: 25 de agosto de 2009; Aceito: 20 de outubro de 2009; Publicação: 18 de novembro de 2009
Direitos de autor: © 2009 MacConaill et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer (R21CA126674) para LAG, (K08CA134931) para AJB, e do Instituto de Câncer Dana-Farber. A.J.B. foi apoiado pelo Programa de Formação de Investigador Principal Harvard. Financiamento para análise de tumores gastrointestinais foi fornecido pela Sociedade Americana de Oncologia Clínica, Amigos do Instituto de Câncer Dana-Farber e do H.T. Fundação Berry. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Em termos de divulgações financeiras, Levi Garraway é consultor da e /ou recebe patrocinado pesquisa da Novartis, Inc. Nenhuma dessas relações constitui um conflito de interesse por este trabalho. Isto não altera a sua adesão a todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais.
Introdução
Muitos tumores contêm mutações da indicação dentro oncogenes ou supressor de tumor (TS) genes que podem conferir uma susceptibilidade elevada a terapias anticâncer direcionados. exemplos bem estabelecidos incluem
KIT
mutações em tumores estromais gastrointestinais (GIST) que predizem resposta a imatinib ou nilotinib e câncer de pulmão não pequenas células com
EGFR
mutações que são sensíveis ao erlotinib [ ,,,0],1], [2], [3]. A presença de outras mutações prevê a ausência de resposta à terapia alvo. Por exemplo, pulmão e colorretal que abrigam mutações no
KRAS
oncogene não respondem ao tratamento com anti-
EGFR
agentes [4], e inativação de
PTEN
mutações ( ou perda de proteína) em glioblastomas prever a resistência ao erlotinib [5]. Assim, tomada de decisão clínica baseada em informação genética do tumor será cada vez mais informado pelo estado mutacional de múltiplos genes do cancro. No entanto, gerando um perfil abrangente de mutações no DNA do tumor alvo-poder ou de outra forma “acionável” na arena clínica continua sendo um desafio.
Os recentes avanços tecnológicos torná-lo viável, em princípio, para rastrear uma biópsia do tumor para muitos tipos de alterações genômicas . No entanto, a incorporação de tais informações para tomada de decisão clínica exige perfil genômico confiável de DNA tumoral congelado, derivados de parafina, e de arquivo. Neste contexto, os ácidos nucleicos são frequentemente sujeitos a degradação e /ou modificação química, e a disponibilidade de tecido de tumor pode ser limitante.
anteriormente relatada a adaptação de uma abordagem de genotipagem de alto rendimento para interrogar mutações chave na um painel de 17 oncogenes conhecidos. Vamos agora demonstrar a viabilidade clínica da base de perfis de mutação genética do câncer por espectrometria de massa para um grande painel de oncogenes e de genes TS mutações. Para conseguir isso, geramos uma abordagem denominada OncoMap, que emprega uma coleção ampliada de 460 ensaios interrogar mutações conhecidas em 33 genes do cancro. Usando essa abordagem perfil genômico acoplado a um algoritmo de chamada de mutação analítica e etapa de validação ortogonal, foram identificadas inúmeras mutações presentes no ADN genómico de tecido tumoral, tanto congelado e FFPE. Além disso, a aplicação de perfis de mutação sistemática para 120 pediátrica astrocitomas de baixo grau revela uma estratificação molecular clinicamente informativo não anteriormente reconhecido neste tipo de tumor. Essas informações, se tornou amplamente disponível, poderia informar tanto a tomada de decisão clínica e design ensaio clínico ideal para terapias direcionadas.
Métodos
Pacientes e Recolha de Tecido Tumoral
anónimos tumor espécimes foram obtidos a partir da Rede Cooperativa de Tecidos Humanos (CHTN), Surgical Oncology Universidade de Siena, Itália, e Dana-Farber Cancer Institute; amostras de glioma humano foram obtidos a partir dos arquivos clínicos dos departamentos de patologia do Hospital Infantil de Boston e Hospital Brigham and Women. (O conteúdo tumor necessário era 70%; necrose. 10%) Institutional Review Board (IRB) isenção foi obtida para todas as amostras do Dana-Farber /Escritório Cancer Care Partners para a Protecção dos sujeitos de pesquisa. extracção de ADN foi realizada como descrito em Métodos S1.
OncoMap Ensaio Concepção e genotipagem
Selecção de mutações do gene do cancro para ensaio de criação e genotipagem de espectrometria de massa foram realizados como previamente descrito [6] com modificações indicadas Métodos em S1. sequências de ensaio, de Iniciador e Sonda são indicados na Tabela S1.
Barcoding amostra e Sequenciamento
Primers flanqueando
KRAS
códon 12 foram usadas para amplificar por PCR DNA genômico de 91 fresco as amostras congeladas e 93 (FFPE sequências dos iniciadores indicados na Tabela S2). amplicões PCR foram analisados por sequenciação de Sanger. Alternativamente,
KRAS
codão 12 foi amplificado por PCR com os iniciadores com código de barras como descrito nos Métodos S1. amplicons de PCR foram reunidas e analisadas (Illumina Genome Analyzer II; pista simples). dados de sequência foi analisada como descrito nos Métodos S1.
Resultados
Características de amostras de tumores clínicos
Um total de 903 amostras tumorais clínicos derivados de 12 locais de tecidos diferentes foram avaliados para neste estudo (Tabela 1). A maioria das amostras eram adenocarcinomas (n = 625) a partir de tumores da mama, pulmão, próstata, e tracto GI. Uma colecção de GIST (n = 34) e gliomas (n = 155) foram também incluídos. Destes, 643 foram obtidas amostras a partir de tecido fresco congelado e 260 derivadas a partir de blocos de FFPE. conteúdo tumor estimado excedeu 70% em todas as amostras, conforme medido através de análise patológica (ver Métodos).
Desempenho do tumor Profiling Algorithm Mutation
Para facilitar o gene do câncer de perfis mutação em tumor clínica espécimes, desenvolvemos OncoMap, um painel de testes de genotipagem que avaliou 396 mutações únicas em 33 genes do cancro. O algoritmo mutação perfil completo (Figura 1A) envolvidos genotipagem por espectrometria de massa seguido de chamadas automatizadas e revisão manual para gerar uma lista de mutações candidatos. Estes candidatos foram submetidos a validação de genotipagem secundário (ver Métodos S1). Assumindo que todos os perfis e validação do ensaio reagentes primários estão no lugar, 7-10 dias são necessários para completar todo o OncoMap sequência.
A. Uma visão geral do processo OncoMap de tumor para o perfil de mutação. Veja o texto para mais detalhes. operador B. Receptor curvas características (ROCs) mostram a sensibilidade e especificidade para vários valores de corte na pontuação amostra das amostras de validação. ROCs são desenhadas para fresco congelado (esquerda) e FFPE derivado (à direita) DNAs, usando bidirecional
KRAS
ensaios e dados Illumina como um (ver Métodos S1) set-verdade.
OncoMap desempenho foi avaliado após a determinação do “ground-verdade” estado mutacional em
KRAS
códon 12 usando um código de barras de DNA e estratégia massivamente paralelo sequenciamento-by-síntese (ver Métodos S1) aplicado a 91 congelado e 93 FFPE DNAs tumorais -derived. Quando estes resultados de sequenciação profundas foram comparados com ensaios de genotipagem interrogar o mesmo
KRAS
codão, encontramos a sensibilidade e especificidade OncoMap para ser 93,8% e 100%, respectivamente, no ADN a partir de tecido fresco /congelado; e 89,3% e 99,4% em ADN derivado de FFPE (Figura 1B). Em contraste, a sensibilidade de Sanger de sequenciação convencional foi de 83,3% para o tecido congelado de fresco e 76,0% para o DNA FFPE-derivada, confirmando o desempenho elevado de perfis de mutação à base de genotipagem [7].
OncoMap desempenho foi avaliado mais extensivamente, testando 215 amostras de tumores congelados frescos abrangendo vários tipos de tumores em que o estado mutacional dos nucleótidos interrogados por 52 OncoMap ensaios tinham sido estabelecidos anteriormente. Por essa análise, a mutação profiling alcançou um semelhante alta especificidade de 99,8%. A sensibilidade do ensaio foi optimizada em tecidos tumorais, onde o conteúdo do tumor excedeu 50% (dados não mostrados). Embora os valores de sensibilidade individuais não pôde ser determinado para todas as mutações testadas, cálculos usando unidirecional
KRAS
ensaios (reflexivos da maioria dos ensaios OncoMap) produziu sensibilidade e especificidade valores quase idênticos (figura S1). Estes resultados sugerem que a mutação baseada em genotipagem profiling plataforma era adequado para muitas aplicações clínicas.
“acionáveis” câncer Gene Mutações em toda tipos de câncer Diversos
Das 903 amostras tumorais clínicos perfilados, 37% (n = 335) continham uma ou mais mutações. No total, foram identificadas 417 mutações, com 63 amostras que apresentam mutações co-ocorrência. Considerando 286 mutações foram encontradas por ensaios de interrogar oncogenes conhecidos ou candidatos, 131 mutações foram observadas em genes TS. Assim, a plataforma OncoMap forneceu mais extensa informação mutação do que os esforços anteriores de mutação de perfis que se concentrou exclusivamente em mutações de oncogenes. Como esperado, a distribuição de mutações reflectida padrões previamente observadas em tumores humanos, embora a frequência de mutações TS era mais baixa (um reflexo da cobertura reduzida de tais mutações por OncoMap). Exemplos incluem
PIK3CA
(26%) e
TP53
(13%) mutações no cancro da mama;
APC
(11%),
BRAF
(10%),
KRAS
(38%),
PIK3CA
(11%) e
TP53
(9%) mutações no cancro colorectal, e
EGFR
(12%),
KRAS
(23%) e
STK11
(8%) mutações no câncer de pulmão. As distribuições de mutação esperados foram observados em ambos os espécimes congelados e frescos FFPE, ressaltando a utilidade potencial de OncoMap no contexto clínico.
Mutações prever a resposta para terapias direcionadas
A tabela 2 indica um conjunto de ” “mutações do gene do cancro accionáveis aqui identificado. A plataforma OncoMap robustamente detectado mutações que constituem marcadores estabelecidos de resposta a terapias específicas. Por exemplo,
EGFR
mutações preditivos de resposta ao erlotinib e gefitinib foram identificadas com a frequência esperada (12%) no cancro do pulmão de células não pequenas, e
KIT
mutações ligadas à sensibilidade ao imatinib e nilotinibe foram detectados em 76% de GISTs. Curiosamente,
ERBB2
mutações foram detectadas em quatro adenocarcinomas gástricos, levantando a possibilidade de teste de um inibidor de HER-2, tais como trastuzumab, em doentes com cancro gástrico seleccionadas com base neste critério genética [8].
vários tumores nutria mutações que podem prever a resposta a agentes investigacionais. Por exemplo,
BRAF
V600E
mutações foram identificadas em colorretal (n = 16), do ovário (n = 1), tiróide (n = 4) e do endométrio (n = 1), os cancros, bem como gangliogliomas pediátricos (n = 22; veja abaixo). Tumores abrigando essas mutações podem responder a uma seletiva
BRAF
inibidor [6], [9]. Nós também identificou 96 amostras em sete tipos diferentes de câncer (mama n = 14, colo n = 24, endométrio n = 15, esôfago n = 4, gástricas n = 34, próstata n = 3, e astrocitoma pediátrica n = 2) mutações que abrigam em ambos os
PIK3CA
ou
PTEN.
Estas mutações poderia ser esperado para enriquecer para tumores sensíveis aos inibidores de PI3 quinase atualmente em desenvolvimento.
mutações predizer resistência a terapias específicas
Junto com mutações que conferem sensibilidade aumentada terapias-alvo, OncoMap robustamente detectado mutações associadas à resistência a vários agentes. Exemplos estabelecidos incluem
KRAS
mutações no cancro do pulmão de não pequenas células (23%) e cancro colorrectal (38%) que conferem resistência ao erlotinib, gefitinib (pulmão) ou cetuximab (colorrectal) [4], [10 ], [11]. Enquanto 94% de
KRAS
mutações identificadas localizada codões 12 ou 13, 6% ocorrido noutro local no gene (mais comumente no codão 61). Como a maioria dos estudos de
KRAS
resistência -associated têm focado exclusivamente códons 12 e 13 [3], [12], [13], OncoMap identificados adicional
KRAS
mutações que podem influenciar a sensibilidade para tratamento anti-EGFR. OncoMap também identificado um
HRAS
mutação em um adenocarcinoma de pulmão e um
ARN
mutação em um adenocarcinoma colorretal. Mutações envolvendo isoformas RAS alternativas são raras nestes tipos de câncer; concebivelmente, estes também pode conferir resistência à terapia anti-EGFR.
A mutação de perfis mutações também identificou que conferem resistência “secundário” para terapias específicas (por exemplo, alelos de resistência que possam surgir durante o curso da terapia-alvo). Nos tumores GIST, onde 31
KIT
mutações foram identificadas em 25 amostras; tanto primário (imatinib-responsivos) e secundária (resistentes ao imatinib)
KIT
mutações foram observadas, de acordo com estudos prévios de mutação de perfis [7]. Em particular, vários
KIT
mutações envolvendo exão 9 (
KIT
Y503_or F504insAY; 5 casos) foram detectados em tumores GIST não tratados. Estas mutações estão associadas com um aumento da necessidade de drogas para induzir uma resposta clínica [14], [15]. A previsão
PDGFRA
mutação (D842V) de resistência ao imatinib [15] também foi identificada em uma amostra GIST.
O
AKT1
E17K
mutação foi anteriormente relatado nos cancros da mama, colo-rectal e cancro do ovário. A plataforma OncoMap identificados rara
AKT1
mutações nestes tipos de tumores, bem como única
AKT1
E17K
casos em endometrial, esofágico escamosas, gástrico e câncer de próstata. Esta mutação pode prever a resistência à inibição PI3 quinase (e possivelmente receptor inibição da tirosina quinase) em alguns contextos [16].
cancros com co-ocorrência de mutações “acionáveis”
A presença de co- mutações que ocorrem envolvendo genes do cancro críticos podem modificar a resposta clínica ao single-agente de terapia-alvo. Aqui, 20 adenocarcinomas (10 colorectal, dois endometriais e 8 gástrico) apresentaram co-ocorrência de
PIK3CA Comprar e
KRAS
mutações. Enquanto mutações coincidentes nesses genes previamente têm sido relatados em cancros do intestino grosso [17],
PIK3CA
e
KRAS
mutações têm tipicamente exibiu um padrão mutuamente exclusivos de ocorrência no câncer de endométrio [18 ], [19]. Um adenocarcinoma de endométrio com co-ocorrendo
FGFR2
e
também foi identificada PTEN
mutações. Dois tumores coincidentes nutriam
BRAF
e
PTEN
mutações (um endométrio, um colorretal), e uma amostra colorectal adicional contida tanto um
PIK3CA
e uma
BRAF
mutação. Estes tumores podem-se esperar que apresentam uma resistência à inibição do receptor de tirosina quinase.
A classificação molecular of Pediatric tumores cerebrais por Câncer Gene Mutation Profiling
A capacidade de realizar perfis mutação robusta de tecido de tumor clínica e de arquivo pode promover a caracterização molecular sistemática de cânceres “órfãos”, incluindo alguns tumores pediátricos onde o tecido suficiente muitas vezes falta. Para explorar esta hipótese, OncoMap foi utilizada para consultar uma série de gliomas de baixo grau pediátricos (LGGs) cujo espectro de mutação não está completamente definida. Esta análise incluiu DNA genômico de 127 pediátrica e 28 gliomas adultos (para comparação) que medem cinco subtipos histológicos de astrocitoma pilocítico, ganglioglioma e astrocitoma difuso.
Candidato prognóstico ou alvos terapêuticos Pediátrica tumores cerebrais
Vários potencialmente genes do câncer “acionáveis” foram encontrados mutado em OPL pediátricos. Exemplos incluem
PDGFRA
(n = 1) e
PIK3CA
(n = 2), que pode prever a resposta aos medicamentos existentes (por exemplo, imatinib ou nilotinib) ou agentes de desenvolvimento (por exemplo, PI3 inibidores de cinase). Dois OPL pediátricos abrigavam mutações no
MYC
, um homólogo oncogene bem estabelecido de
nmyc
, que é amplificado e indicativo de mau prognóstico em neuroblastoma pediátrico [20], [21]. Assim, tumor mutação profiling pode refinar a estratificação dos pacientes e /ou prognóstico da doença em alguns cancros cerebrais pediátricos.
BRAF
As mutações V600E são comuns em Pediatric Gangliogliomas
Duplicação da
BRAF
lugar foi classificado como a aberração mais frequente em OPL pediátricos (66% [18]), enquanto ativando mutações pontuais no
BRAF
ocorrem menos frequentemente (4-6%) [22], [23 ]. Identificamos ativando
BRAF
V600E
mutações em 11% (10/88) dos OPL-a pediátricos percentual maior do que relatado anteriormente [22], [23]. Curiosamente, o
BRAF
V600E
mutação foi mais prevalente no subtipo de ganglioglioma OPL pediátricos (clássicos e não clássicos; 8/14 tumores, p = 0,00005), como mostrado na Fig. 2.
BRAF
V600E
mutações não foram identificados, em qualquer dos tumores adultos examinados, embora
TP53
mutações comumente ocorreu neste cenário (10/28 casos). Por outro lado, apenas 2 gliomas pediátricos nutria uma TP53
mutação; em ambos os casos, este coincidiu com outra mutação (
EGFR
e
FLNB
, respectivamente). Estes resultados sugerem que OncoMap pode facilitar a classificação dos astrocitomas de baixo grau e outros tipos de tumores raros com base em critérios genéticos
Abreviaturas:. PA – astrocitoma pilocítico, grau OMS I; LGG, nos – glioma de baixo grau, não especificada, grau OMS I ou II; GG – ganglioglioma; A2 – astrocitoma, a OMS grau II; HG – glioma de alto grau, a OMS grau III ou IV. Parênteses indicam o número total de amostras (no gráfico) ou número de amostras com mutação indicada (gráfico de fora).
Discussão
oncologia clínica é no meio da transição de um paradigma de tratamento ditada principalmente pela localização anatômica de origem do tumor para uma em que características genéticas e /ou moleculares desempenham um papel decisivo na orientação escolha da terapia. Além disso, a proliferação de agentes segmentados em desenvolvimento e a prática clínica exige uma aplicação concomitante de abordagens complementares de diagnóstico que enriquecem para subpopulações mais probabilidade de responder a uma droga. abordagens diagnósticas novas são, portanto, necessários ao perfil qualquer tumor por mutações genéticas cruciais em vários genes do cancro, simultaneamente, em contraste com a maioria dos testes existentes que se concentram em genes individuais (ou proteínas).
Neste estudo, nós adaptamos genotyping- profiling mutação base para a caracterização de ambas as amostras tumorais congelados e derivados de FFPE abrangendo 12 tipos de câncer. Nós robustamente detectado mutações do gene do cancro que o uso clínico directo e prever a resistência aos agentes existentes, tais como inibidores da tirosina quinase (por exemplo,
EGFR
e
mutações KRAS
). Foram também identificadas várias mutações que podem orientar a utilização de agentes emergentes. Finalmente, em uma investigação específica de astrocitomas de baixo grau pediátricos, demonstramos o valor especial esta plataforma pode ter para raros “órfãos” cancros por identificar mutações que possam informar a classificação molecular, bem como novos caminhos terapêuticos para crianças com estas doenças malignas.
intervenções de diagnóstico que introduzem com sucesso tumor mutação profiling para a prática clínica deve contornar vários obstáculos técnicos e logísticos. A principal delas é a realização de um desempenho robusto em amostras derivadas de FFPE e /ou material de arquivo tumor. Descobrimos que a plataforma OncoMap alcançado quase 100% de especificidade em ambos os ADN do tumor fresco /congelado e FFPE-derivada, indicando que falsas chamadas mutação positiva, são susceptíveis de ser relativamente rara, com esta abordagem. Deve-se notar, no entanto, que para alcançar esse nível de especificidade necessária a implementação de uma sequência analítica em que os dados de genotipagem em bruto é submetido a chamada base de automatizado seguido por revisão manual de mutações candidatos e validação de todos os candidatos usando químicas genotipagem alternativos. Assim, a aplicação clínica de OncoMap deve incorporar tanto a geração de dados genômica e bioinformática experiência analítica em uma patologia molecular ou definição de diagnóstico clínico.
A sensibilidade do OncoMap é influenciada por parâmetros tecnológicos inerentes, características de desempenho do ensaio de mutação individuais, bem como a qualidade e pureza do tecido tumoral. A sensibilidade do ensaio 89-94% observada neste estudo é suficiente para muitas aplicações clínicas e translacional; No entanto, existem circunstâncias onde as sensibilidades do curso de ensaio ainda maior será desejável. O enriquecimento de células tumorais utilizando dissecção agulha núcleo ou microdissecação laser de captura antes de perfilamento mutação pode oferecer uma avenida para aumentar a sensibilidade, especialmente em tumores do estroma ou onde o conteúdo inflamatório é alta. Ao mesmo tempo, a sensibilidade do OncoMap muito excede o de seqüenciamento Sanger, que continua a ser o padrão de ouro para muitas abordagens de diagnóstico genético. Além disso, a amplitude de genes do cancro e mutações específicas interrogados pelo OncoMap apoiado pela sensibilidade e especificidade rigorosos acima referidas determinações substancialmente excede o de perfil genômico baseado em espectrometria de massa comercial existente se aproxima [24].
terapias genomically guiadas pode desempenhar um papel especialmente importante em tumores raros em grandes ensaios randomizados são muitas vezes impraticável. Para testar a capacidade de o OncoMap para identificar tumores raros e /ou limitada de amostra que podem beneficiar de classes específicas de agentes terapêuticos, que um painel perfilado de gliomas de baixo grau pediátricos para mutações do gene do cancro comum. O conhecimento das anormalidades genéticas presentes em OPL pediátricos é limitada, embora estudos recentes identificaram
BRAF
translocações cromossómicas, duplicações, e mutações de base ocasionais em astrocitomas de baixo grau [18], [25], bem como diversa mecanismos de ativação da via ERK /MAPK em astrocitoma pilocítico [23]. Estes resultados sugerem que os inibidores de pequenas moléculas de
BRAF
já em ensaios com adultos podem também representar prometendo terapêutica para subconjuntos destes tumores. Nossos resultados indicam que a frequência de
BRAF
mutações pontuais no OPL pediátricos como um todo pode ser maior do que o relatado anteriormente, e, especificamente, que gangliogliomas possuem
BRAF
mutações V600E em freqüência muito alta . Esta observação pode também ajudar na identificação de diagnóstico desses tumores. Gangliogliomas, que tendem a ser tumores indolentes, pode, portanto, compartilham algumas propriedades, com nevos cutânea, cujos precursores de melanócitos também derivam do sistema nervoso (crista neural), apresentam crescimento indolente, e onde o
BRAF
V600E mutação também é altamente prevalente. Foram também identificadas várias mutações não reportados anteriormente na astrocitoma pediátrica, alguns dos quais (
EGFR
,
PIK3CA
,
PDGFRA
) representam alvos potencialmente viáveis. Em concordância com os relatórios anteriores [22], [26], [27] observamos que mutações em genes frequentemente observadas nos astrocitomas e /ou glioblastomas anaplásico adultos, tais como
TP53
ou
PTEN
, só raramente são encontrados em pilocíticos e baixo grau astrocitomas difusos pediátricos.
Embora os nossos resultados apoiam a viabilidade clínica de high-throughput mutação tumor profiling, reconhecemos que a abordagem de espectrometria de massa genotipagem tem certas limitações que podem impedir sua implementação como uma plataforma de diagnóstico de câncer definitiva. Estes incluem o número finito de mutações pontuais específicas que podem ser ensaiadas (designado
a priori
dentro de um subconjunto de genes do cancro), as dificuldades na concepção de ensaios de genotipagem que identificam pequenas inserções ou delecções ( “no-dels”) maior ~50bp do que no tamanho, uma incapacidade de detectar a maioria das mutações do gene TS (que pode ocorrer em qualquer lugar no interior do gene, não só “ponto de acesso”) ou regiões alterações genómicas adicionais, tais como amplificações de genes de alto nível ou deleções que também podem afectar os principais genes de cancro e a natureza um pouco de trabalho intensivo de revisão manual e validação do ensaio ortogonal. A longo prazo, a adaptação de novas tecnologias da genómica como segunda sequenciamento geração pode oferecer uma abordagem unificadora para abrangente profiling mutação tumor. No entanto, a plataforma OncoMap podem oferecer uma avenida imediato pelo qual profiling mutação sistemática pode ser iniciado para orientar desenho do ensaio clínico, bem como uso de agentes direcionados existente em muitos tipos de câncer.
Em resumo, este estudo representa a primeira aplicação em grande escala da plataforma OncoMap para perfilamento mutação tumor no ambiente clínico e de arquivo. Esses resultados, portanto, animar um quadro em que profiling tumor sistemática pode emergir como um meio amplamente viáveis para orientar a estratificação dos pacientes para cancro terapêutica racionais. Apesar da complexidade inerente de câncer, incorporando o crescente conhecimento da base molecular do câncer em ambos os estudos epidemiológicos moleculares em larga escala e, em última análise, tomada de decisão clínica deve finalmente acelerar o advento de terapias anticâncer mais eficazes.
Apoiando informações
Métodos S1.
Profiling mutações do gene do cancro críticos em amostras de tumor clínicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s001
(0.07 MB DOC)
Tabela S1.
OncoMap 3 principais iniciadores PCR e sonda extensão sequências
doi: 10.1371. /journal.pone.0007887.s002
(0.13 MB XLS)
Tabela S2.
KRAS
sequências iniciadoras G12 PCR utilizados para gerar produtos de amplificação para Sanger e Illumina seqüenciamento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s003
(0,03 MB XLS)
Figura S1.
Desempenho de OncoMap no DNA congelado e FFPE derivado fresco. operador receptor curvas características (ROCs) são desenhadas para congelados (painel esquerdo) fresco e FFPE derivado (painel direito) DNAs, contra ensaios OncoMap KRAS unidirecionais, usando dados Illumina como uma verdade-set (ver Métodos S1).
doi : 10.1371 /journal.pone.0007887.s004
(0.06 MB PPT)
Reconhecimentos
Agradecemos Nicholas Wyhs, Benjamin Ebert e Sewit Tekki de conhecimentos técnicos; Suely Marie para fornecer amostras de carcinoma. Seqüenciamento Sanger foi concluída no Agencourt Bioscience Corporation, seqüenciamento Illumina em Cofator Genomics.