Abstract
biomarcadores moleculares para determinar a eficácia de terapias-alvo no tratamento do câncer têm sido amplamente adotado no cancro colorectal (CRC), mas aqueles para prever a sensibilidade quimioterapia permanece mal definida. Testamos nossa hipótese de que KRAS mutação pode ser um preditor de sensibilidade oxaliplatin no CRC. KRAS foi knocked-down em células CRC KRAS-mutante (DLD-1
G13D e SW480
G12V) por pequenos RNAs de interferência (siRNA) e sobre-expressos em KRAS do tipo selvagem células CRC (Colo320DM) por KRAS-mutante vetores para gerar emparelhado células CRC. Estas células de CRC emparelhados foram testados por oxaliplatina, irinotecano e 5-FU para determinar a alteração na sensibilidade ao fármaco pelo ensaio de MTT e citometria de fluxo. Razões para a alteração da sensibilidade foram ainda determinados por Western blot e em tempo real quantitativa reacção inversa de cadeia de polimerase transcriptase (qRT-PCR). Em células CRC do tipo KRAS selvagem (Colo320DM), KRAS superexpressão por vetores mutantes causados reparo de excisão grupo de acesso a complementação 1 downregulation (ERCC1) em proteínas e níveis de mRNA e sensibilidade oxaliplatin reforçada. Em contraste, em células CRC KRAS-mutante (DLD-1
G13D e SW480
G12V), KRAS knocked-down por KRAS-siRNA levou a regulação positiva ERCC1 e aumento da resistência oxaliplatina. A sensibilidade do irinotecan e 5-FU não havia mudado nas células CRC emparelhados. Para validar ERCC1 como um preditor de sensibilidade para oxaliplatina, ERCC1 foi knocked-down por siRNA em células CRC-wild-tipo KRAS, que restaurou a sensibilidade oxaliplatin. Em contraste, ERCC1 foi sobre-expresso por vectores que expressam ERCC1 em células de CRC KRAS-mutante, e causou resistência oxaliplatina. No geral, nossos resultados sugerem que KRAS mutação é um preditor de sensibilidade oxaliplatin em células cancerígenas do cólon pelo mecanismo de regulação baixa ERCC1
Citation:. Lin YL, JY Liau, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH , et ai. (2012) KRAS mutação é um preditor de oxaliplatina Sensibilidade em células de cancro do cólon. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10.1371 /journal.pone.0050701
editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de maio de 2012; Aceite: 25 de outubro de 2012; Publicado: November 28, 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma concessão do Departamento de Saúde, Yuan Executivo (DOH100-TD-C-111-001), Taipei, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
biomarcadores para determinar a eficácia do tratamento foram investigados na era quimioterapia tradicional, mas apenas um número limitado de biomarcadores foi encontrada até agora. Exemplos são a reparação de excisão grupo trans-complementação uma expressão (ERCC1) para prever a resistência de oxaliplatina [1], e de expressão da timidilato-sintase (TS) para determinar a sensibilidade de 5-FU [2]. Este conceito evoluiu e tornou-se mais relevante enquanto que o tratamento tem avançado a era molecular-alvo. A maioria dos agentes moleculares-alvo têm metas predefinidas, que facilitam a prever a eficácia do tratamento ou prognóstico de doenças. Bons exemplos são o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutação para prever a eficácia dos inibidores da tirosina-cinase EGFR (TKI) no adenocarcinoma de pulmão [3], assim como a mutação KRAS para prever a ausência de resposta de anticorpo monoclonal de EGFR em cancro colorrectal (CRC) [ ,,,0],4]. Apesar de extensos estudos têm sido realizados para identificar novos preditores de vias de sinalização conhecidos ou estudos baseados microarray [5], [6], biomarcadores para prever a sensibilidade quimioterapia continuam a ser mal definido.
(A) bateu-KRAS-down DLD-1
G13D células eram mais resistentes a oxaliplatina, mas tem a mesma sensibilidade a irinotecano, 5-FU, doxorubicina e que DLD-1
G13D células parentais, como demonstrado pelo ensaio de MTT. (B) O nível de proteína de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi regulada positivamente após DLD-1
células G13D foram knocked-down por KRAS siRNA. (C) O nível de mRNA de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi regulada positivamente após DLD-1
células G13D foram knocked-down por KRAS siRNA. ***:
p Art 0,001
Várias análises post hoc de ensaios clínicos aleatórios recentes no CRC sugeriu que o estado KRAS mutação genética pode prever a eficácia da quimioterapia citotóxica, especialmente. para regimes baseados em oxaliplatina. OPUS [7] e PRIME [8] estudos, que foram ambos concebidos para os doentes a receber de primeira linha oxaliplatina /5FU /leucovorin com /sem anticorpos monoclonais EGFR, são bons exemplos. Principalmente focando o grupo só por quimioterapia nestes 2 estudos mostram que em primeira linha de sobrevivência livre de progressão (SLP) no grupo KRAS mutante durou mais tempo do que no grupo de tipo selvagem, com 8,6 contra 7,2 meses no estudo OPUS, e 8,8 contra 8,0 meses no estudo PRIME. Em contrapartida, em estudo CRYSTAL [9], que foi projetado para pacientes que recebem de primeira linha irinotecan /5-FU /leucovorin com /sem anticorpo monoclonal EGFR, não foi observado um fenômeno semelhante. O primeiro-line PFS mediana em pacientes KRAS-mutante e de tipo selvagem foi de 7,7 e 8,4 meses, respectivamente.
De acordo com estas observações, a hipótese de que KRAS mutação pode ser um preditor de sensibilidade oxaliplatin no CRC. Em primeiro lugar, KRAS foi knocked-down em células CRC KRAS-mutante e sobre-expressos em células CRC-wild-tipo KRAS. Estas células de CRC emparelhados foram testados por oxaliplatina, irinotecano e 5-FU para avaliar a alteração na sensibilidade ao fármaco. Razões para a alteração da sensibilidade foram ainda determinados por Western blot e em tempo real quantitativa reacção inversa de cadeia de polimerase transcriptase (qRT-PCR). Finalmente, o alvo responsável pela alteração de sensibilidade foi validado por bater-down e superexpressão o alvo.
(A) KRAS-knocked-down SW480
células G12V foram mais resistentes à oxaliplatina, mas têm a mesma sensibilidade para irinotecano, 5FU, e doxorrubicina do que SW480
células G12V parentais, como demonstrado pelo ensaio de MTT. (B) O nível de proteína de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi regulada positivamente após SW480
células G12V foram knocked-down por KRAS siRNA. (C) O nível de mRNA de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi regulada positivamente após SW480
células G12V foram knocked-down por KRAS siRNA. ***:.
p Art 0,001
Materiais e Métodos
Cultura de Células e reagentes
linhas celulares de CRC Humano Colo320DM (KRAS -type -wild), DLD-1
G13D (KRAS G13D mutação) e SW480
G12V (KRAS G12V mutação) foram todos obtidos de American Type Culture Collection. As células foram todas mantidas em meio RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10%, 2 mmol /L de L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), e PSA (10.000 unidades /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina , e 25 ug /ml de anfotericina B; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) e cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2. A oxaliplatina (Eloxatin injecção de 5 mg /ml) foi obtida a partir de Sanofi-Aventis Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Irinotecano, 5FU, e doxorrubicina foram todos adquiridos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os anticorpos de coelho para Western blot contra ERCC1 e KRAS foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EUA). Os anticorpos de ratinho contra TS, topoisomerase I (Topo I), e β-actina foram obtidos de Millipore (Bedford, MA, EUA), BD Biosciences (San José, CA, EUA) e Biolabs celular, Inc. (San Diego, CA, EUA), respectivamente.
(células
G13D-DDK-myc-Colo320DM a) KRAS foram mais sensíveis à oxaliplatina, mas têm a mesma sensibilidade para irinotecano, 5FU, e doxorrubicina do que as células Colo320DM parentais, como demonstrado pelo ensaio de MTT. (B) O nível de proteína de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi reprimidos após células Colo320DM foram transfectadas pela KRAS
G13D mutante vetor. (C) O nível de mRNA de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi reprimidos após células Colo320DM foram transfectadas pela KRAS
G13D mutante vetor. **:.
p Art 0,01
Batendo-down de KRAS e ERCC1
Dois tipos de ambos KRAS e ERCC1 pequenos RNAs de interferência (siRNA) e mexidos inespecífica (controlo negativo) ARNsi foram adquiridos a Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, EUA). Para silenciamento de genes KRAS, DLD-1
G13D e SW480
células G12V foram primeiro transfectados com KRAS- ou mexidos siRNAs durante 1 dia, utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante . As células transfectadas foram então tratados com oxaliplatina, irinotecano, 5FU e de doxorubicina com várias concentrações para as 72 horas seguintes. O ligado de proteínas e mRNA de pais e KRAS knockdown DLD-1
SW480
células G12V G13D e foram coletadas em 24, 48, 72 e 96 horas após a transfecção para avaliação do KRAS magnitude knockdown por western blot. Para silenciamento de genes ERCC1, Colo320DM células transfectadas com dois ERCC1- diferente ou siRNAs mexidos foram tratados com a oxaliplatina durante 72 horas. O ligado de proteínas e mRNA de células Colo320DM parentais e ERCC-knocked-down foram coletadas em 24, 48, 72 e 96 horas pós-transfecção para avaliar o efeito ERCC1 knockdown por western blot e qRT-PCR.
( a) KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM foram mais sensíveis a oxaliplatina, mas tem a mesma sensibilidade a irinotecano, 5FU, e doxorrubicina do que as células parentais Colo320DM, como demonstrado pelo ensaio de MTT. (B) O nível de proteína de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi reprimidos após células Colo320DM foram transfectadas pela KRAS
G12V mutante vetor. (C) O nível de mRNA de ERCC1, mas não os de TOPO1 ou TS, foi reprimidos após células Colo320DM foram transfectadas pela KRAS
G12V mutante vetor. **:
p Art 0,01. (D) A percentagem de apoptose aumentou de 22,5% ± 0,2% e 39,1% ± 0,2% da apoptose (P 0,001), foi demonstrado quando
células KRAS WT-DDK-myc-Colo320DM, foram comparados com KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM, em que, ambos foram tratados com a mesma concentração de oxaliplatina de 5 uM. *:
p Art 0,001
A superexpressão de KRAS e ERCC1
O vector-KRAS pCMV6-Myc-DDK-marcado foi comprado de OriGene Technologies (. Rockville, MD, EUA). -ADN-sequência que codifica a mutação KRAS e G12V G13D foram gerados por mutagénese dirigida ao local e clonado no vector pCMV6-Myc-DDK-marcaram-KRAS. As sequências de KRAS e G12V mutação G13D foram como se segue: 5′-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 ‘; reverso: 5’-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 ‘e para a frente: 5′-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3′; reverso: 5’-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 ‘, respectivamente. Para KRAS superexpressão, as células Colo320DM foram transitoriamente transfectadas com o pCMV6-Myc-DDK-marcado-KRAS, vetores -KRAS
G12V e -KRAS
G13D. Após 24 horas da transfecção, as células foram tratadas com oxaliplatina, irinotecano, 5-FU, doxorubicina e com várias concentrações para as 72 horas seguintes. O ligado de proteínas e mRNA de células Colo320DM transfectadas pelo pCMV6-Myc-DDK-marcado-KRAS, -KRAS
G12V e -KRAS
vetores G13D foram coletadas em 24, 48, 72 e 96 horas para avaliação de KRAS superexpressão magnitude por western blot. Para a sobre-expressão ERCC1, SW480
G12V células foram transfectadas pelo vector pCMV6-ERCC1-GFP (OriGene Technologies, Rockville, MD, EUA) durante 24 horas, e tratou-se com oxaliplatina durante 72 horas. O lisado de proteínas de SW480
G12V células transfectadas pelo vector de ERCC1-GFP foi recolhido a 24, 48, 72, e 96 horas para avaliação de grandeza ERCC1 sobre-expressão por western blot.
(A) ERCC1- células Colo320DM knocked-down foram mais sensíveis à oxaliplatina do que as células Colo320DM parentais, como demonstrado pelo ensaio de MTT. (B) de proteínas e níveis de mRNA de ERCC1 foram reprimidos quando as células foram Colo320DM knocked-down por ERCC1 siRNA. *:
p Art 0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480
células G12V foram mais resistentes à oxaliplatina do que SW480
células G12V parentais. (D) ERCC1 ectópica foi regulada positivamente após SW480
células G12V foram transfectadas pelo vector de expressão ERCC1-GFP.
viabilidade celular e Análises apoptóticos
A viabilidade celular foi avaliada pelo uso o 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT; Tokyo Chemical Industry Inc., Tóquio, Japão) em ensaio de 6 réplicas. Inicialmente, Colo320DM, SW480
G12V, e DLD-1
G13D células foram semeadas a 3500, 4500 e 3000 culas por po em placas de 96 poços de fundo plano, respectivamente. Após 24 horas de incubação, as células G13D SW480
G12V e DLD-1
foram transfectadas por KRAS- e siRNAs mexidos, e as células foram transfectadas Colo320DM pela KRAS pCMV6-Myc-DDK-marcado, -KRAS
G12V e -KRAS
vetores G13D, como descrito. Após KRAS-siRNAs foram transfectadas a DLD-1
G13D /SW480
células G12V e vectores KRAS-mutante para Colo320DM células durante 24 horas, as células foram tratadas com oxaliplatina, irinotecano, 5FU, e doxorrubicina a várias concentrações em 10 % de FBS suplementado com meio RPMI-1640 durante 72 horas. As células de controlo foram misturados com DMSO a uma concentração igual à que nas células tratadas com a droga. A viabilidade celular destas células tratadas foi medida por adição de 200 ul de 0,5 mg /MTT ml solubilizados em DMSO a cada poço, e as células foram incubadas no CO
2 incubadora a 37 ° C durante 2 horas após a remoção do meio. A absorvância foi determinada a 570 nm. As concentrações de compostos que inibiram a viabilidade em 50% (IC
50) foram determinados usando o método de efeito médio, empregando software CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, EUA).
(A) A expressão da proteína de ERCC1 em células DLD-1 (KRAS
mutação G13D) é regulado para cima depois de 5′-azacitidina (agente de-metilação) tratamento por 96 horas, o que implicava que a regulação negativa da ERCC1 em células CRC KRAS-mutante pode ser, em parte, através de hipermetilação ERCC1. (B) regulação negativa do ERCC1 em Colo320DM (KRAS tipo selvagem) células transfectadas por KRAS
G13D-mutante-vector para 24 e 96 horas não só podem ser restaurados por 5′-azacitidina em 10? M, mas também causou para cima regulação de DNMT3B.
A fracção de células apoptóticas, após KRAS sobre-expresso em células Colo320DM, e tratou-se por oxaliplatina, foi avaliada por citometria de fluxo com Anexina V-FITC. Colo320DM células foram semeadas a 2,5 x 10
5 células /por cavidade para mexidos e KRAS
transfecção G12V-mutante-vector em placas de 6 poços. Passadas 6 horas da transfecção, o meio de transfecção foi substituído por meio normal. Oxaliplatina com a concentração de 5 uM foi dado a células em Colo320DM transfectadas no dia seguinte. células Colo320DM transfectadas foram então tripsinizadas e recolhidas para análise após 48 horas de tratamento oxaliplatina. As células foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos à temperatura ambiente, e a suspensão de células foi corada com Anexina V-FITC (Anexina V kit de ensaio, BD Biosciences Pharmingen) e iodeto de propídio, à temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos no escuro. As células foram então analisadas por citómetro de fluxo FACScan e celular programa Quest. A proporção de células em apoptose foi a proporção de células coradas com anexina V-FITC.
Análise Western Blot
Colo320DM overexpressed-KRAS e KRAS-knocked-down SW480
G12V e DLD- 1
células G13D tratados com várias concentrações de oxaliplatina, irinotecano, e 5-FU durante 72 horas em 6 cm pratos (1 × 10
5 células por placa) foram recolhidas e lisadas com um tampão de lise RIPA [50 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol /L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS] (Sigma Cat. No. R0278). As concentrações de proteína de lisado foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteínas Pierce BCA (Scientific térmica, Odessa, Texas, EUA). quantidades equivalentes de proteína de cada lisado foram sujeitos a SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose para imunoblotting. As membranas transblotted foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0,1% de Tween 20 (TBST). Após o bloqueio com TBST contendo 5% de leite desnatado durante 40 minutos, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário apropriado em TBST contendo 1% de leite desnatado a 4 ° C durante a noite. Todos os anticorpos primários foram diluídos em uma concentração adequada de 1% TBST contendo leite magro. Após o tratamento com o anticorpo primário, as membranas foram lavadas duas vezes com TBST, durante 20 minutos, seguido de anticorpo de cabra anti-coelho ou um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de IgG anti-ratinho de rábano (diluído 1:3000) durante 1 hora à temperatura ambiente e lavada 3 vezes com TBST durante 1 hora. As membranas foram reveladas utilizando um substrato de peroxidase de rábano quimioluminescência aumentada (Millipore, Bedford, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
quantitativa em tempo real da Transcriptase Reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)
Colo320DM overexpressed-KRAS, KRAS-knocked-down SW480
G12V e DLD-1
células G13D tratados com várias concentrações de oxaliplatina, irinotecan e 5-FU por 24, 48 e 72 horas, respectivamente, foram coletadas e lisadas num reagente de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e armazenou-se a -20 ° C. O RNA destas células foi extraído de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs foram sintetizados a partir de ARN total (1 ug) utilizando o Applied Biosystems alta capacidade kit de cDNA Archive de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc a partir de ARN total de 50 ng foram quantificados utilizando TaqMan Universal ou SYBR Verde PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) em um ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). As sequências dos iniciadores de ERCC1 (ABI Taqman ensaio ID: Hs01012158_ml), TOPO I (ABI Taqman ensaio ID: Hs00243257_ml), TS (ABI Taqman ensaio ID: Hs00426586_ml), e do gene β-actina (ABI Taqman ensaio ID: Hs99999903_ml) como um controle endógeno foram todos adquiridos da Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA). As condições para PCR foram 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, e 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos (desnaturação) e 60 ° C durante 1 minuto (emparelhamento /extensão). A quantidade de ARNm relativa do /controlo do gene endógeno do gene alvo (β-actina) foi calculada usando o método ΔCt (ciclo limite), como se segue: expressão relativa = 2-ΔCt, onde ΔCt = Ct (gene alvo) – Ct (β actina).
Análise estatística
para estudos de linha celular, todos os dados foram repetidos por pelo menos 3 experiências independentes. Os dados quantitativos são representados como média ± SD. As comparações entre os dados dentro dos mesmos experimentos foram analisados utilizando
t
teste de Student. A
p
-valor de . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
Batendo-down KRAS em células CRC KRAS-mutante aumenta a resistência oxaliplatina e em causa ERCC1 superexpressão
Batendo-down KRAS em DLD-1
células G13D resultou em células mais resistentes a oxaliplatina, mas não para o irinotecan e 5-FU, agentes quimioterápicos padrão para CRC, e não à doxorrubicina, largo agente espectro quimioterápico para outros principais tipos de câncer. Dois KRAS-siRNAs diferentes foram transfectadas para DLD-1
células G13D. O IC
50 dos primeiros-pareado (1) -DLD-1
células G13D parental DLD-1
G13D /KRAS do siRNA tratados com oxaliplatina por 72 horas foi de 3,97 /33,07 M. Os (2) -DLD-1
células segunda-emparelhado parental DLD-1
G13D /KRAS do siRNA G13D foi 3,97 /13,49 M. O IC
50 de DLD-1
KRAS-siRNA-DLD-1
células G13D emparelhados parentais G13D /tratados com irinotecano, 5-FU e doxorrubicina permaneceu inalterada (Figura 1A). ERCC1, topo I e TS, que foram pensados para ser biomarcadores para prever a sensibilidade de oxaliplatina [1], irinotecano [10] e 5-FU [2], respectivamente, foram ainda verificados por western blot e de qRT-PCR (Figuras 1B, and1C ) para explorar os mecanismos por trás de nossas descobertas. Apenas expressão ERCC1 foi regulada positivamente após KRAS knockdown; Em contraste, a topo I e TS permaneceu constante, tanto nos níveis de ARNm e proteína. KRAS eficiência knockdown foi avaliada por western blot, que apresentaram diminuído de expressão KRAS após 72 horas de bater para baixo o gene KRAS (Figura 1B).
Para consolidar ainda mais nossa observação, usamos outra célula CRC, SW480 , que abrigava outro subtipo KRAS mutante, G12V, a repetir os mesmos procedimentos experimentais. Em resumo, SW480 parental
células G12V foi, como esperado, mais sensíveis a oxaliplatina do que knocked-down SW480
células G12V KRAS. O IC
50 de SW480
KRAS-siRNA-SW480
células parentais G12V /G12V tratadas por oxaliplatina por 72 horas foi de 2,08 /13,53? M, mas a de pais SW480
G12V /KRAS-siRNA- SW480
células G12V tratados com irinotecan, 5FU, e doxorrubicina permaneceu inalterada (Figura 2A). ERCC1, topo I, e TS foram simultaneamente verificada por Western Blot e qRT-PCR (Figuras 2B e 2C), e novamente apenas ERCC1 foi regulada positivamente após KRAS knockdown, com níveis de topo I e TS permanecendo inalteradas nos níveis de ARNm e proteína. Da mesma forma, KRAS eficiência knockdown foi medida por western blot, que mostrou um declínio na expressão KRAS após 72 horas de bater para baixo o gene KRAS (Figura 2B).
superexpressão KRAS em KRAS do tipo selvagem Células CRC Leads a oxaliplatina Sensibilidade e ERCC1 Downregulation
a superexpressão de KRAS em células Colo320DM por KRAS-mutante vetores resultou em células mais sensíveis à oxaliplatina. O IC
50 de Colo320DM parental /células KRAS
G13D-DDK-myc-Colo320DM tratadas por oxaliplatina por 72 horas foi de 2,86 /0,26 M, mas o de Colo320DM parental /KRAS
G13D-DDK-myc- Colo320DM células tratadas com o irinotecano, o 5-FU, doxorubicina e permaneceu inalterado (Figura 3A). ERCC1, topo I, e TS foram verificadas por transferência de Western e qRT-PCR (Figuras 3B e 3C), que mostrou que apenas ERCC1 foi regulada negativamente sem qualquer alteração nos níveis de ARNm e proteína de topo I e TS após KRAS superexpressão. A expressão de KRAS KRAS e ectópicos endógeno foi medida por western blot, que demonstrou uma expressão robusta de KRAS ectópica, com uma constante de expressão endógenos KRAS após 24 horas a sobreexpressão do gene KRAS (Figura 3B).
os mesmos resultados também foram encontrados em células Colo320DM transfectadas com o KRAS
vector G12V-mutante. O IC
50 de Colo320DM parental /KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM tratados com oxaliplatina por 72 horas foi de 2,55 /0,25 mM, mas o de Colo320DM parental /KRAS
G12V-DDK-myc- Colo320DM células tratadas com o irinotecano, o 5-FU, doxorubicina e permaneceu inalterado (Figura 4A). Mais uma vez, apenas a ERCC1 foi regulada negativamente, sem qualquer mudança de topo I e TS em proteínas (Figura 4B) e os níveis de ARNm (Figura 4C) após KRAS superexpressão. A expressão de KRAS KRAS endógenos ectópicos e após 24 horas a sobreexpressão do gene KRAS é mostrado na Figura 4B. Para fortalecer ainda mais a constatação de que KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM foram mais sensíveis à oxaliplatina do que as células Colo320DM parentais, citometria de fluxo com anexina V-FITC foi realizada. Por conseguinte, o aumento da percentagem de apoptose, a partir de 22,5% ± 0,2% e 39,1% ± 0,2% da apoptose (P 0,001), foi encontrado quando as células Colo320DM parentais, transfectadas por KRAS
wt-DDK-myc-vector, eram em comparação com células transfectadas por Colo320DM, KRAS
G12V-DDK-myc-vector, em que, ambos foram tratados com a mesma concentração de oxaliplatina de 5 uM (Figura 4D).
Validar Expressão ERCC1 como o preditor de oxaliplatina sensibilidade
Batendo-down ERCC1 em células CRC KRAS tipo selvagem restaura a sensibilidade oxaliplatin.
Para confirmar ainda mais a relação entre a expressão ERCC1 e sensibilidade oxaliplatin, nós knocked-down do gene ERCC1 usando 2 diferente ERCC1-siRNAs em células-wild-tipo KRAS (Colo320DM). Descobrimos que o IC
50 do primeiro pareado Colo320DM parental /ERCC1-siRNA (1) células -COLO320DM tratados com oxaliplatina por 72 horas foi de 2,75 /0,91 mM (Figura 5A). Os (2) células -COLO320DM segunda-emparelhado parentais Colo320DM /ERCC1-siARN foi de 2,75 /0,83 uM (Figura 5A). As proteínas e mRNA níveis de ERCC1 expressão foram reprimidos após ERCC1 foi knocked-down por ERCC1-siRNA em células Colo320DM (Figura 5B).
superexpressão ERCC1 em células CRC KRAS-mutante provoca resistência oxaliplatina.
a superexpressão de ERCC1 em SW480
células G12V pelo vector ERCC1-superexpressão causada SW480
células G12V para se tornar mais resistente a oxaliplatina. O IC
50 de SW480
G12V /ERCC1-GFP-SW480
células G12V parentais tratados com oxaliplatina por 72 horas foi de 1,87 /11,03 m (Figura 5C). Western blot foi utilizada para determinar o nível de sobre-expressão ERCC1-GFP após transfecção (Figura 5D).
Discussão
Nosso estudo mostra que KRAS mutação é um preditor de sensibilidade oxaliplatin em células cancerígenas do cólon por ERCC1 downregulation. Isso pode fornecer um passo importante para a quimioterapia personalizado no câncer de cólon.
Na era pré-terapia-alvo, Tournigand et al [11] publicou o artigo fundamental indicando que, quimioterapia de primeira linha tanto com irinotecan /5-FU /lecovorin (FOLFIRI) ou oxaliplatina /5FU /leucovorin (FOLFOX6) em “não-selecionada” pacientes com CCR metastático, sequencialmente, seguido de outro após a progressão, não influenciou a sobrevida global (oS). Seu artigo também indicou que ambos os regimes pode ser recomendada como um tratamento de primeira linha para CRC avançado. Na era moderna da terapia-alvo, o tratamento atual tem sido avançado para terapia personalizada após o gene KRAS do tipo selvagem foi identificado como um preditor para o anticorpo monoclonal EGFR. KRAS tem sido recomendado para ser rotineiramente verificada na prática oncológica diária. Para identificar melhores preditores na quimioterapia atual ou alvos de tratamento mais recentes para pacientes CRC KRAS-mutante é garantido. Nosso estudo foi iniciado para encontrar melhores preditores na quimioterapia atual, para o qual a hipótese foi gerada a partir de análises de subgrupos de ensaios clínicos prospectivos randomizados, PRIME [8] e OPUS [7], contra CRYSTAL [9]. De acordo com nossos resultados, os pacientes CRC KRAS-mutante pode beneficiar mais de recebimento de primeira linha regimes baseados em oxaliplatina do que os pacientes-wild-tipo KRAS. Este fenómeno merece mais uma confirmação por grandes ensaios clínicos prospectivos.
Os nossos dados demonstram que a mutação KRAS em células CRC causada ERCC1 downregulation. Esta descoberta significativa poderia implicar que alguns outros alvos druggable ainda desconhecidas podem ser responsáveis para o tratamento CRC KRAS-mutante para além da via /ERK tradicional RAS /RAF /MEK. Para explorar esses alvos desconhecidos, estudos projetados do ponto de vista epigenética e /ou genética pode ser útil. Do ponto de vista epigenética, hipermetilação provoca o silenciamento do gene é bem conhecido [12], [13]. Em nosso estudo, descobrimos que a expressão da proteína de ERCC1 em DLD-1 (KRAS
mutação G13D) células é regulado para cima depois (agente de-metilação) de tratamento 5′-azacitidina durante 96 horas (Figura 6A), que indicou que a regulação negativa da ERCC1 em células CRC KRAS-mutante pode ser, em parte, através de hipermetilação ERCC1. Descobrimos também que a regulação negativa da expressão da proteína de ERCC1 em Colo320DM (KRAS tipo selvagem) células transfectadas por KRAS-mutante-vector para 24 e 96 horas pode ser restaurado por 5′-azacitidina (Figura 6B). Esta nova implícito que a regulação negativa da expressão em células de ERCC1 CRC não é apenas parcialmente através da hipermetilação, mas também determinada pelas alterações de expressão em células KRAS CRC. Porque downregulation de ERCC1 em células Colo320DM, transfectadas por KRAS
G13D-mutante-vector, pode ser causado por hipermetilação do ERCC1, verificamos ainda DNMT3B (DNA metiltransferase 3B), cujo principal papel é o de prosseguir o processo de metilação. Descobrimos que DNMT3B foi regulada quando ERCC1 foi dowenregulated em células Colo320DM, transfectadas por KRAS
G13D-mutante-vector (Figura 6B). DNMT3B pode voltar a suprimir por 5′-azacitidina, que mostrava que DNMT3B é provavelmente responsável pelo processo de metilação. Portanto, nossos dados mostraram que ERCC1 regulação baixa em células CRC KRAS-mutante pode ser através de hipermetilação ERCC1. Propusemos que as células CRC KRAS-mutante pode ter maior taxa de metilação em ilhas CpG da região promotora ERCC1 que KRAS-mutante células transfectadas por KRAS-siRNA. Esta hipótese pode ser validado por comparação dos possíveis diferenças de hipermetilação do promotor na região entre as células ERCC1 KRAS-mutante e células KRAS-mutante transfectadas pelo siARN KRAS-metilação por PCR e /ou análise de sequenciação de sódio bissulfito de [14] específico. Todo o conceito seria que KRAS mutação ativadora pode causar DNMT3B regulação positiva. Subsequentemente, DNMT3B pode ligar-se a região do promotor de ERCC1 para resultar em hipermetilação do gene ERCC1. Finalmente, a hipermetilação do gene ERCC1 de resultados na regulação negativa da expressão ERCC1. Em alternativa, a partir do ponto de vista genético, como KRAS mutação é uma mutação de activação, o qual tem sido amplamente aceite [15], [16], foi proposto que pode haver um factor desconhecido existido, o que pode ser inibida pela activação do gene KRAS ou os seus sinais a jusante. Este fator também tem de ser um fator de ativação para ativar gene ERCC1. Então, uma vez gene KRAS é mutado (ativada), este fator pode ser inibida, ea quantidade desse fator pode ser recusado. Subsequentemente, a expressão de ERCC1 pode ser suprimido, devido à ausência deste factor. Para realizar este tipo de estudos, construções de gene repórter utilizando promotor ERCC1, ensaio de actividade de luciferase e imunoprecipitação da cromatina pode ser, portanto, necessário [17].
Embora os mecanismos detalhados por trás destes resultados permanecem ainda desconhecidos, crosstalks entre o gene KRAS mutado e as vias de reparo de DNA máquinas, que também pode ser responsável pelo efeito do tratamento à base de oxaliplatina, têm sido investigadas [18], [19]. Além disso, várias novas gerações de tecnologias baseadas em microarranjos, comparando mesmas células dadas com /sem mutação KRAS batendo para baixo e sobre-expressam o gene KRAS em conformidade, pode ser uma outra maneira útil na definição de novas metas para o tratamento KRAS-mutante CRC [5], [6].
a sobre-expressão de ERCC1 está associada com a resistência à quimioterapia à base de platina [1], [20], [21], [22], [23], [24], que tem sido demonstrada em vários tipos de cancros, incluindo cânceres de esôfago [25], cancros do pulmão de células não-pequenas [26], e cancros da bexiga [27]. Estes resultados também são compatíveis com o presente estudo. Em nosso estudo, demonstramos que KRAS do tipo selvagem células (Colo320DM) CRC foram mais resistentes à oxaliplatina do que as mesmas células de dados (Colo320DM) transfectadas por KRAS-mutante vetores.