da arte abstracta
Durante a última década, vários estudos têm amplamente relatado que activado (NK) assassinas naturais pode matar as células dendríticas imaturas autólogos (DCs) in vitro, enquanto poupam DCs totalmente ativados. Isto levou à proposta de que as células NK activadas pode seleccionar um subconjunto mais imunogénica de DCs durante uma resposta imunitária protectora. No entanto, não há nenhuma demonstração de que autólogo assassinato DC por células NK é um evento que ocorre
in vivo
e, consequentemente, a relevância funcional deste assassinato permanece indefinida. Aqui nós relatamos que uma diminuição significativa de CD11c
+ DCs foi observada em linfonodos drenantes de camundongos inoculados com células MHC-desprovidos como alvos células NK capazes de induzir a activação de células NK. Este
in vivo
DC edição por células NK foi dependente de perforina e foi funcionalmente relevante, uma vez linfáticos residual DCs nó exibido uma capacidade melhorada para induzir a proliferação de células T. Além disso, num modelo de vacinação anti-cancro, a administração de células de MHC-desprovidas em conjunto com células de tumor aumentou o número de CTL específicos de tumores e resultou em um aumento significativo na sobrevivência de ratinhos após provocação com uma dose letal de células tumorais . A depleção de células NK ou a utilização de ratinhos knockout perforina diminuiu fortemente a expansão de CTL específicos de tumor e o seu papel de protecção contra o desafio de células de tumor. Como um todo, os nossos dados suportam a hipótese de que células NK mediada por morte DC ocorre
in vivo
e é capaz de promover a expansão dos CTLs específicos de câncer. Nossos resultados também indicam que vacinas contra o câncer pode ser melhorada por meio de estratégias destinadas à ativação de células NK
Citation:. Morandi B, Mortara L, Chiossone L, Accolla RS, Mingari MC, Moretta L, et al. (2012) Edição de células dendríticas por ativados Natural Killer células resulta na mais Cancer-Specific Protective resposta imune. PLoS ONE 7 (6): e39170. doi: 10.1371 /journal.pone.0039170
editor: Francesco Dieli, Universidade de Palermo, Itália |
Recebido: 19 Março, 2012; Aceito: 16 de maio de 2012; Publicação: 19 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Morandi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiada pela Associazione Italiana Ricerca sul Cancro https://www.airc.it) IG5624 e IG11650 para GF e IG 8862 a RSA; por Ministero Italiano della Salute – Programa Strategico Ricerca Oncologica (https://www.ministerosalute.it/) para GF; pela Fundação Cariplo 2008-2230 (www.fondazionecariplo.it) e Ministero Italiano dell ‘Istruzione, Universita’, Ricerca, – Progetto Rilevanza Nazionale (https://prin.miur.it/) 2008-WXF7KK a RSA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Assassinas Naturais (NK), as quais foram originalmente identificadas como células linfóides capaz de lisar um número de linhas de células tumorais na ausência de estimulação prévia
in vivo
ou
in vitro
[1] – [3], são agora apreciado como células imunitárias inatas multifuncionais [4] – [6]. Sua activação é guiado por um equilíbrio dos sinais emitidos pelos diferentes grupos de activação de [7] e receptores inibitórios [8] -. [11], o último reconhece moléculas MHC classe I em células alvo
Recentemente, a tecla papel para um diálogo de cooperação entre as células assassinas naturais (NK) e DCs no desencadeamento da resposta imune emergiu [12] – [17]. Tem sido demonstrado que a sua interacção resulta numa activação bidireccional e no desenvolvimento de uma resposta Th1 e CTL mediada [18] – [21]. Nos seres humanos, pelo menos,
In vitro
, esta diafonia também resulta na lise das DCs imaturos, enquanto DCs maduras são protegidos [13], [15]. O receptor de activação e NKp30 DNAM-1 são receptores importantes para a lise DC, enquanto que a resistência à lise é mediada por sobre-regulação de MHC de classe I de moléculas durante a maturação DC [15], [22] – [24].
Com base nestes resultados in vitro, tem sido proposto que a morte de DCs imaturas por células NK deve promover a sobrevivência das DCs mais imunogénicos (isto é amadurecer DCs), favorecendo a iniciação de uma resposta imune eficiente e protectora [25] -. [27]
In vivo
, DC /interacções de células NK pode ocorrer nos órgãos linfóides, bem como em tecidos linfóides não [28]. Adoptivamente transferidos,
ex vivo
gerado, DC imaturas foram relatados para ser rapidamente eliminado pelas células NK através relacionado com TNF ligando indutor de apoptose (TRAIL) [29], [30]. Da mesma forma, foi demonstrado que o transplante de células aloreactivas NK pode suprimir a doença do enxerto-versus-hospedeiro mediadas por células T, eliminando DCs hospedeiras [31], [32]. Durante infecções virais crónicas, uma susceptibilidade DC aberrante à lise mediada por células NK resultou numa acumulação de DCs imunogénicas mal em gânglios linfáticos, causando disfunção imune progressiva [33]. Por outro lado, DC lise por células NK poderia também regular negativamente a duração das respostas das células T específicas do vírus
In vivo
limitando a exposição das células T a células apresentadoras de antigénio infectados [34].
no entanto, DC morte por células NK autólogas
in vivo
não foi directamente demonstrado até à data e o potencial relevância deste lise durante uma resposta do sistema imune continua a ser avaliada.
a número de
in vivo
modelos forneceram evidências de que o reconhecimento das células NK de MHC classe I com deficiência de células-alvo resulta em maior geração de CTLs contra tumores [21], [35]. Nestes modelos experimentais, as células NK activadas produzem citocinas que, por sua vez, parecem promover a activação primeira corrente contínua e, subsequentemente, uma resposta protectora de CTL contra tumores parentais. Isto levou-nos a investigar se, durante uma resposta imunitária protectora contra tumores, células NK activadas pode também seleccionar um subconjunto mais imunogénica de DCs. Mostramos aqui que a edição DC ocorre
in vivo
e que este fenómeno tem um papel fundamental para o desenvolvimento e camundongos sobrevivência CTL específicos de tumor em um modelo murino de vacinação tumor.
Resultados e Discussão
ativação de células NK em tecidos periféricos resulta em uma diminuição Perforin dependente de conteúdo DC na drenagem dos gânglios linfáticos
Os ratinhos foram inoculados com YAC-1, uma linha celular de MHC-desprovido, como um alvo de células NK capaz de induzir a activação de células NK. Após 36 h, DCs derivado foram analisados tanto drenagem e LN contralateral. Como mostrado na Figura 1, tanto a percentagem e o número absoluto de CD11c
+ DCs foram drasticamente diminuída em LN drenantes em comparação com LNs controlateral (p = 0,0029 para a percentagem e p = 0,007 para o número absoluto).
In vivo
depleção de células NK através da injecção de anticorpos monoclonais anti-asialo-GM1 (mAbs) reverteu este fenómeno, confirmando o papel importante desempenhado pelas células NK. Em linfonodos de drenagem de ratos com depleção de células NK, tanto a percentagem e o número absoluto de CD11c
+ DCs foram comparáveis com LNs controlateral, indicando que as células NK devem estar envolvidos na redução de DCs. Anti-asialo GM1 mAb tratamento conduziu a um decréscimo de, pelo menos, 80% das células NK (Figura 1 A, B). Estes resultados sugerem que o declínio no número DC observado na drenagem LN foi NK cell-dependente e, aparentemente, consequente à activação de células NK no reconhecimento de células MHC-desprovidas
A:. Representante análises de células mononucleares isoladas a partir de qualquer drenagem ou contralateral nós (Controle LN) linfáticos de camundongos esgotados ou não de células NK (Drenagem LN + anti-asialo GM1). B: células NK são eficientemente empobrecido em ratos após administração de anti-asialo GM1 mAbs. C: a percentagem (esquerda) e o número absoluto (direita) de DC entre as células mononucleares isoladas de nódulos linfáticos. Bares representa valores médios e desvio padrão de cinco experiências independentes (três ratos por grupo). ** = P 0001; * = P 0005.
Uma possível explicação para a redução observada de números celulares de DC por activação de célula NK é a libertação de citocinas específicas, por células NK, capaz de influenciar a sobrevivência das DCs ou a sua capacidade de migrar do da periferia para o LN. Alternativamente, as células NK podem afetar o número de DCs na drenagem LN por lise directa
Para elucidar o mecanismo subjacente ao declínio no número de DC, que repetiu a mesma experiência em nocaute perforina (PFN
-. /- ) ratinhos, uma vez que uma molécula de perforina é essencial para a citotoxicidade das células NK. No pfn
– /- ratos, não houve diferença no número e percentagem de CD11c
+ DCs encontrados na drenagem e linfonodos contralateral (não mostrados). Estes dados sugerem que a citotoxicidade dependente de perforina pode representar um caminho na redução dependente da célula NK da LN DCs.
NK celular Selects ativação Linfonodo CC com T Superior celular Ativando Capability
células NK foram mostrados para matar imatura DCs
in vitro
[13], [15]. Uma interpretação para a morte específica de células autólogas saudáveis por células NK foi de que as células NK pode agir para controlar a qualidade de DCs em maturação [26]. Esta hipótese implica que as células NK iria impedir a sobrevivência de DCs imaturas menos imunogénicos, o que iria induzir inadequado, baixa afinidade de escorvamento de células T, resultando finalmente num estado de tolerização. O resultado final deste processo de edição DC mediada por células NK pode, portanto, ser a selecção de DCs mais imunogénicas, devido à remoção de DCs que não conseguem mediar a iniciação das células T óptima.
De modo a verificar se esta mecanismo é funcionalmente relevante in vivo, testou-se DCs persistente no LN de drenagem após a edição das células NK eram fenotipicamente e funcionalmente mais imunogénico. Os grupos de ratinhos que foram ou células NK empobrecido ou não foram inoculados s.c. com as células YAC-1. Após 36 h as DCs dos gânglios de drenagem e linfáticos contralateral foram analisados para a expressão de moléculas co-estimuladoras e marcadores de maturação, tais como CD40, CD80, CD83, CD86 por citometria de fluxo e para IL12p35, IL-12p40 e ARNm IL23p19 por PCR em tempo real . Além disso, avaliou-se DCs persistente na drenagem LN sobre a edição de célula NK apresentaram maior capacidade de activação de células T. Os esplenócitos de murganhos C57BL /6 foram estimulados com DC ordenados de gânglios linfáticos de ratinhos BALB /c injectados com células YAC-1 24 h antes da remoção do nó de linfa. Seis dias mais tarde, a taxa de proliferação foi avaliada como a perda de corante CFSE. Embora as diferenças significativas para as moléculas da superfície das citocinas analisadas ou não eram discerníveis (não mostrado), a proliferação de células T alogénica foi significativamente diminuída quando DCs de ratos com depleção de células NK foram usadas como estímulo (Figura 2). Estes resultados indicam que redução mediada por células NK do número DC representa um
in vivo
mecanismo funcionalmente relevante pela qual os DCs mais imunogênica são eficientemente selecionada. Com efeito, após a activação das células NK periférica, DCs contidas nos linfonodos de drenagem foram reduzidos em número, mas dotado de mais potentes propriedades de activação de células T.
A drenagem linfática DCs nó de ratos injectados por via subcutânea com MHC
negcells foram classificadas e cultivadas na presença de esplenócitos alogénicos previamente marcadas com CFSE. A: Os esplenócitos foram cultivados sozinhos (sem estímulo) ou com 10% de DCs nódulos linfáticos altamente purificadas de camundongos células NK empobrecido (10% DC drenagem LN + anti-asialo GM1) ou controlo (10% DC drenagem LN) antes da administração do MHC células alvo -negativo. diluição CFSE dos esplenócitos no dia 6 de cultura, estão indicadas. A depleção de células NK compromete a indução da proliferação por LN DCs. Os dados são representativos de quatro experiências independentes resumidos no Painel B: ▪ = 10% DC LN de drenagem; ▴ = 10% DC drenagem LN + anti-asialo GM1. * = P . 0,02
A edição de DCs por células NK Promove Specific Antigen Expansão T celular e uma mais protetor resposta imune Durante Cancer Cell Vacinação
Nossos dados mostram que
in vivo
activação das células NK resulta num decréscimo dependente de perforina de células dendríticas LN, que está associada com a presença de DCs mais imunogénicos na drenagem LN. Por conseguinte, investigado se que resulta em uma resposta imune adaptativa mais protectora num modelo de vacinação de células de cancro. Grupos de camundongos, que tanto haviam sido submetidos a depleção de células NK ou tratamento simulado, foram injectados s.c. com as células desprovidas de MHC-(isto é, as células YAC-1) e células TS /A, uma linha de células NK de células resistentes a Tumor Mamário de adenocarcinoma. Como controlos, os grupos de ratinhos foram injectados com TS /A ou as células YAC-1 sozinho. Após três semanas, os baços foram colhidos e as células foram re-estimuladas em cultura com TS /A células tumorais ou o péptido AH1, que é uma classe MHC I epitopo imunodominante restrito de TS /A antigénio gp70env [36], [37]. Os esplenócitos de murganhos que haviam sido injectados com células TS /A mais YAC-1 demonstraram números significativamente maiores de IFN-γ produção de células após estimulação, em comparação com os ratos com depleção de células NK ou ratinhos de controlo (p 0,05 e 0,01) (Figura 3 ,UMA). Estes dados indicam que a lise das DCs por células NK activadas suporta a expansão dos linfócitos T específicos do antigénio
in vivo
. Nenhum aumento de células produtoras de IFN-y foi observado quando as culturas foram re-estimuladas por células YAC-1, indicando que o aumento de células produtoras de IFN-y não foi associada com a activação de células NK. Além disso, a re-estimulação por qualquer TS /A ou a sua imunodominante de MHC de classe Epitopo I-restricted AH1 induziu um aumento semelhante de produzir IFN-y esplenócitos, indicando que eles estavam representadas principalmente por MHC de classe I-restringida de linfócitos T citotóxicos (CTL).
A: Os murganhos foram inoculados com as células TS /A imunogénicas, as células TS /A misturados com células de MHC-desprovida (YAC-1) ou as células YAC-1 sozinho. Num grupo de ratinhos, anti-asialo GM1 mAb foram administrados i.p. 48 h antes da administração de vacinas de células para destruir as células NK. Após 21 dias, os esplenócitos foram estimulados de novo com a utilização de células TS /A, a classe TS /A I do CPH-péptido imunodominante restrito AH1 ou com as células YAC-1 e as frequências de células produtoras de IFNy foram determinadas por ensaio ELISPOT. Um aumento significativo das células produtoras de IFNy específico para o antigénio foi detectada em ratinhos vacinados com TS /A misturado com as células YAC-1 (TS /A + YAC-1). O aumento específico de antigénio de CTL foi revogada quando os ratos tinham sido esgotadas de células NK antes da vacinação (TS /A + YAC-1 + anti asialo GM1). B: Foram realizadas experiências semelhantes em ratinhos KO perforina (PFN
– /-) e em paralelo com os murganhos de tipo selvagem (WT). Um número significativamente menor de TS /A de CTL específico do tumor foi induzida por vacinação de ratinhos KO, em perforina, quando em comparação com ratinhos do tipo selvagem. As barras representam valores médios e SEM de resultados obtidos em três experiências independentes (três ratinhos por grupo). ** = P 0001; * = P 0005
Para elucidar se a ajuda das células NK para a expansão CTL era, na verdade associado a mediada por células NK lise DC, vamos definir o mesmo experimento usando grupos de PFN
-. /- Ratos, que falta a actividade citolítica de células NK. As células do baço de PFN
– /- murganhos injectados com TS /A, mais as células MHC-negativos YAC-1 continha um número significativamente menor de células T produtoras de IFN-y, quando comparado com murganhos do tipo selvagem que também foram injectados com TS /Uma vantagem de YAC-1 (Figura 3 A, B). Estes resultados sugerem que a célula NK mediada por, dependente de perforina, a lise das DCs tem um papel na geração óptima de células T específicas de antigénio. No entanto, os presentes resultados também oferecer, pelo menos em parte, uma interpretação alternativa, ou seja, que as células NK pode estimular directamente a maturação de CD, provavelmente através da libertação de citocinas pro-inflamatórias (por exemplo, TNF-α), como demonstrado anteriormente [21], [ ,,,0],35]. De facto, em murganhos deficientes em perforina-, a activação de células T anti-tumor não era tão baixa como observada em ratos com depleção de células NK utilizando o tratamento anti-asialo (Figura 3, A). Assim, a resposta de células T específica do antigénio aumentada, detectável mediante edição de DC mediada por células NK poderia representar o resultado de tanto matar DC e DC activação mediada por citocina.
Finalmente, também observamos que a vacinação com irradiado TS /células a Plus células YAC-1 resultou num aumento significativo da sobrevivência de ratinhos após provocação com uma dose letal de células TS /a (Figura 4). 60% de ratinhos pré-injectados com TS irradiados /A mais YAC-1 sobreviveram 8 semanas após a inoculação do tumor enquanto que, no mesmo intervalo de tempo, apenas 20% em qualquer das ratinhos ou ratos com depleção de células NK pré-injectados com irradiado TS /A células apenas sobreviveram ao desafio do tumor. No seu conjunto, estes resultados suportam o conceito de que a activação de células NK induzidas por células MHC-negativos podem promover uma resposta imune mais protectora durante a vacinação de células de cancro.
Os ratinhos foram vacinados com células tumorais imunogénico por si só (TS /A) , células de tumor misturadas com células de MHC-negativos sozinhos (YAC-1) (cinco ratinhos por grupo) de MHC-negativos ells (TS /A + YAC-1) ou. Num grupo de ratinhos, anti-asialo GM1 mAb foram administrados i.p. 48 h antes da administração de vacinas de células para destruir as células NK. Após 21 dias, os ratinhos foram desafiados com uma dose letal de células tumorais e monitorizados para o crescimento do tumor duas vezes por semana, durante dois meses. Os ratinhos vacinados com células de tumor misturadas com células de MHC-negativa (TS /A + YAC-1) exibiu um atraso no crescimento do tumor e uma sobrevivência notável com TS /Um desafio de células de cancro. Esse efeito protetor foi revogada quando os ratos foram esgotadas de células NK (TS /A + YAC-1 + anti-asialo GM1).
Observações finais
Temos aqui demonstrado que a NK células podem provocar edição DC
in vivo
. células NK, depois da ativação por MHC classe I carentes, adquirir a capacidade de selecionar os DCs mielóides mais imunogênicas em linfonodos de drenagem através de um mecanismo dependente de perforina. Embora nossos dados actuais não constituem uma prova formal de citotoxicidade direta mediada por células NK contra DCs, a revogação do fenômeno em pfn
– /-. Camundongos pode indicar uma lise DC direta por células NK
notavelmente, esta matança putativo conduz à selecção de DCs mais imunogénicas, caracterizados por uma maior capacidade para induzir a proliferação de células T alogénicas. Assim, para além de uma estimulação directa de DCs mediadas por citoquinas libertadas por células NK, células NK pode contribuir para a activação das células T, seleccionando as DCs mais imunogénicas.
A identificação do tipo de células NK responsável pela processo de edição, bem como os locais onde DC assassinato supostamente ocorre, ainda continua a ser identificado. Neste contexto, é possível que este evento pode ocorrer na periferia, em que as células NK estão equipados com uma actividade citolítica mais elevada, em comparação com aqueles detectados nos gânglios linfáticos. Por outro lado, não se pode excluir que, em determinadas condições (por exemplo, uma tempestade de citocinas), nódulos linfáticos células NK pode mudar seu fenótipo funcional e adquirir maior potencial citolítico, como proposto anteriormente [38]. Uma possibilidade alternativa é que as células NK periféricas que exibem uma elevada actividade citolítica poderia migrar para os nódulos linfáticos a seguir a activação e aquisição de receptores de quimiocinas adequadas, tal como sugerido por relatórios recentes [39] – [41]
A interacção entre NK activadas. As células DC e também é relevante para o estabelecimento de uma resposta imunitária protectora. Em um modelo de vacinação anti-cancro, a administração de células de tumor em conjunto com NK activação de células MHC-desprovido, impulsionado a expansão de CTL específicos de tumor, resultando em aumento de sobrevivência de ratinhos após provocação com uma dose letal de células tumorais. A depleção de células NK auditivos esta resposta de células T específica de tumores, bem como o seu papel de protecção contra o desafio do tumor. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que,
In vivo
, células NK pode editar DCs para a geração óptima de respostas imunitárias adaptativas por uma selecção eficiente das DCs mais imunogénicas. Por fim, os nossos dados sugerem também que as vacinas de células de cancro poderia ser melhorado por meio de estratégias destinadas a activação de células NK, como a utilização de células cancerosas NK-sensíveis.
Materiais e Métodos
linhas celulares, Modelo animal e condições experimentais
O TS /A linha de adenocarcinoma mamário murino de células [36] (gentilmente cedido pelo PL Lollini, Universidade de Bolonha, Bolonha, Itália) foi cultivada em DMEM /10% FCS (Cambrex, Charles City, IA, EUA). O YAC-1 (ATCC TIB-160) [42] em vez foi cultivada em RPMI 1640/10% FCS (Cambrex, Charles City, IA, EUA). tipo selvagem fêmea BALB /c (H-2K
d) e ratinhos de tipo selvagem 5-8 semanas de idade C57BL /6 (H-2
b) ratos foram adquiridos da Harlan (Udine, Itália). Perforina
– /-. Camundongos (CByJ.B6-PRF1
tm1Sdz /J) foram adquiridos da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)
Os ratos foram subcutaneamente (sc) injectados com 2 x 10
6 irradiados (20.000 rads) células YAC-1 ou, quando indicado, quer com TS irradiados /a células tumorais sozinho (5 x 10
5) ou TS irradiados /a células tumorais (5 x 10
5) misturado com células irradiadas de YAC-1 (2 x 10
6). Animais submetidos a
in vivo
depleção de células NK recebeu três intraperitoneal (ip) com as injecções de anticorpos anti-asialo-GM1 (de soro de coelho anti-NK, 200 mL /ratinho de 1:10 de solução estoque diluída, Wako) em dias -2 /0 /+ 1 como previamente descrito [43] (dia 0 foi o dia da inoculação do tumor de células de vacinação. foi feito em três semanas após a vacinação com uma dose tumorigénica 5 x 10
4 de TS /a células tumorais. o crescimento e o tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana utilizando um calibrador. a injecção de YAC-1 em ratinhos BALB /C representa um sistema alogénico, mas a ausência de ambos os MHC de classe I e classe expressão II em células YAC-1 minimiza o aloantígenos potencial. os animais foram alojados em colônia livre de patógenos e experimentos foram realizados de acordo com o Regulamento Nacional de pesquisa de Recursos Animais e aprovado pelo Conselho de revisão do Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Génova.
linfóide Órgão de isolamento de células
nós inguinal linfáticos (LNs) foram cirurgicamente removidos e coletado em RPMI 1640/10% FCS. Eles foram cortados em pequenos fragmentos, utilizando lâminas de barbear e digeridos em 2 mg /ml de colagenase D e 30 ug /ml de ADNase I (Roche, Mannheim, Alemanha) a 37 ° C durante 30 min. As suspensões de células isoladas foram preparadas por meio de filtração através de um filtro celular de 70 uM (BD Labware, San Jose, CA, EUA). CD11c
+ células foram isoladas por selecção positiva usando microesferas anti-CD11c e um separador magnético (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). As células do baço foram isoladas por dissociação mecânica e filtrado através de um filtro celular de 70 uM (BD Labware). Eritrócitos nas preparações esplênicos foram removidos por lise hipotônica com NH
4Cl /KHCO
3 /EDTA.
Os anticorpos e citometria de fluxo
Animais submetidos a
in vivo
NK depleção de células recebeu duas IP injecções com anti-asilao GM1 no dia -2/0 (soro anti-NK coelho, 200 ul /rato de 1:10 solução de diluída, Wako Neuss, Alemanha). Após 36 h de injecção, linfonodos inguinais foram colhidas e as suspensões celulares obtidas foram marcadas com anti-CD11c, anti-DX5, anti-CD40, anti-CD80, anti-CD86 e anti-MHC de classe II (todos da eBioscience, San Diego , CA) e analisadas por citometria de fluxo (FACS Canto II, BD).
ensaio de proliferação
Para o ensaio de proliferação, as células do baço de ratinhos B6 foram marcadas com éster de succinimidilo carboxifluoresceína 5 uM (CFSE ) em PBS mais 0,1% de BSA durante 10 min a 37 ° C. Após lavagem extensiva com PBS mais 0,1% de BSA, as células foram incubadas com DCs CD11c alogénicas ordenados de drenagem LN dos ratinhos injectados com células YAC-1 que tinham ou não tinham sido sujeitos a depleção das células NK. As DCs foram extensivamente lavadas em PBS antes da cultura com células T. Após 6 dias, CFSE fluorescência foi avaliada em CD3
+ células por citometria de fluxo.
ligado a enzima immunospot Ensaios
As frequências de IFN-y-produção de células do baço de animais vacinados foram determinada depois de três semanas por um enzyme-linked immunospot (ELISPOT) realizada em esplenócitos. placas de Multiscreen-IP (Millipore, Bedford, MA e BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) foram revestidos durante a noite com 10 ug /ml de IFN-γ mAb anti-em PBS (endógena, Woburn, MA e BD Pharmingen, San Jose , CA, EUA). As placas foram depois lavadas com meio RPMI 1640 e bloqueadas durante 3 h com PBS albumina de soro bovino-2%. Os esplenócitos foram contadas em RPMI 1640 completo e em seguida semeadas a uma diluição em série de 2 vezes, começando a partir de 4 × 10
5 células por poço, em duplicado, na presença ou ausência de: (i) irradiadas (20000 rads) TS /A células tumorais; (Ii) YAC-1, células (tanto em relação 10:01 efectora de células /estimulador); (Iii) péptido derivado AH1-gp70 retroviral endógenas, o ácido 9-amino-H-2L
d-péptido restrito (SPSYVYHQF, sintetizado por INBIOS S.r.l., Napoli, Itália) numa concentração final de 10 ug /ml. AH1 é o antigénio CD8 imunodominante expressa na superfície de TS /A linhas celulares de cancro [37]. Onde indicado, a estimulação celular foi também obtida por PMA e ionomicina com uma concentração final de 50 ng /mL e 500 ng /mL, respectivamente (SIGMA). Após 40 h de incubação, as placas foram lavadas com PBS-0,05% Tween 20 e incubadas com 1 ug /ml de mAb secundário biotinilado ao IFN-γ (Endogen e BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) em soro bovino PBS-1% albumina durante 3 horas à temperatura ambiente. Rábano estreptavidina conjugada com peroxidase (1:5,000) foi então adicionada durante 2 h à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram coradas com o kit de coloração de AEC (Sigma e BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) e as manchas foram contadas utilizando um microscópio estereoscópico. A aumento de 2 vezes no número de pontos ao longo do controlo (esplenócitos cultivados com nenhum estímulo) foi considerada como uma resposta positiva. Os dados foram expressos como o número de células formadoras de manchas por milhões de células do baço.
Análise Estatística
A significância estatística das diferenças foi avaliada com o teste t de Student ou teste de Mann Whitney utilizando software Prism Graphpad ( GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Todas as barras de erro representam SEM.