da arte abstracta
Fundos
A expressão de Viver, um membro dos inibidores da família de proteínas da apoptose, é associada com o desenvolvimento e progressão do tumor. Os objetivos deste estudo foram avaliar se Vivendo afeta o comportamento biológico oncogénica de células de câncer colorretal, e documentar a relação entre a sua expressão e vários parâmetros clínico no cancro colorectal.
Métodos
Nós investigamos o impacto das Vivendo no comportamento das células tumorais usando o pequeno RNA de interferência e pcDNA3.1 vector em linhas celulares de cancro colorectal SW480 e DKO1. A expressão de Vivendo foi investigada por RT-PCR e imuno-histoquímica em tecidos de cancro coloretcal. As células em apoptose foram visualizados por ensaio TUNEL, e as células de proliferação foram visualizados por Ki-67 coloração de anticorpos.
Resultados
Knockdown de Vivendo suprimida a migração de células tumorais e invasão em células de cancro colorrectal. Knockdown de Vivendo induziu a apoptose por expressão p27-se-regulação da caspase-3, -7 e PARP actividades e a paragem do ciclo celular, diminuindo ciclina D1, ciclina D3, quinase dependente de ciclina 4 e 6, e pela indução. As cascatas de sinalização MAPK foram significativamente bloqueada por knockdown de Vivendo. Em contraste, a sobre-expressão de Vivendo reforçada migração celular e invasão do tumor, e inibiu a apoptose e ciclo celular prisão. O valor médio do índice de apoptose (AI) de tumores de Livin positivos foi significativamente menor do AI de tumores de Livin negativos. No entanto, não houve diferença significativa entre a expressão de Livin e Ki-67 O índice de marcação (KI). Vivendo expressão foi significativamente aumentada no cancro colorectal e tecidos de nódulos linfáticos metastáticos em comparação com tecidos normais da mucosa colorretal e de nódulos linfáticos não metastático e foi associada com o estágio do tumor, invasão linfática, metástases em linfonodos e baixa sobrevida.
Conclusões
Estes resultados indicam que Vivendo está associada à progressão do tumor, aumentando a motilidade celular do tumor e inibir a apoptose em câncer colorretal
Citation:. Myung DS, Parque YL, Chung CY, Parque HC, Kim JS, cho SB, et al. (2013) Expressão de Vivendo em Câncer Colorretal e sua relação com o comportamento tumoral celular e prognóstico. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10.1371 /journal.pone.0073262
editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de fevereiro de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 02 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Myung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (0720570) da Research Programa de Desenvolvimento de Controle do Câncer, Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é uma das principais causas de morbidade associada ao câncer e mortalidade no mundo. Apesar das evidências de que a sobrevivência de 5 anos é de 90% quando o cancro colorectal é diagnosticado numa fase inicial, 40% dos casos são diagnosticados quando o câncer ainda está localizada [1]. Os rápidos avanços na nossa compreensão sobre as características moleculares e biológicas do câncer colorretal têm proporcionado conhecimentos úteis para a patogênese do câncer colorretal. Biomarcadores têm sido desenvolvidos para identificar indivíduos que mais se beneficiarão de vigilância de câncer e gestão [2-5]. Identifiying biomarcadores que podem detectar cancro colo-rectal anterior ou monitorar a progressão do câncer permitiria personalização da medicina e melhorar as taxas de sobrevivência de pacientes com câncer.
Os mecanismos subjacentes de ação na progressão do câncer estão começando a ser desvendado. Os mecanismos moleculares e bioquímicos relatados que podem contribuir para as alterações fenotípicas em favor da carcinogénese, incluem inibiu a apoptose, proliferação das células do tumor, o aumento da capacidade de invasão, perturbação de adesão celular, promoção de angiogénese, e inibiu a vigilância imunitária. Estes acontecimentos podem contribuir para o desenvolvimento e progressão do cancro [6-8].
A apoptose desempenha um papel importante em muitos acontecimentos biológicos, incluindo a morfogénese, a renovação celular e eliminação de células prejudiciais. Uma perturbação na apoptose pode conferir uma vantagem de sobrevivência em células malignas que abrigam alterações genéticas e, assim, promover a progressão do câncer [9,10]. O evento central na apoptose é a activação proteolítica de uma classe de proteases de aspartilo de cisteína-específica, as caspases. Iniciador caspases clivam caspases efectoras, que por sua vez degradar um número de substratos proteicos intracelulares e, assim, induzem as características morfológicas características de apoptose [11]. Estas actividades de caspase são inibidos pelos inibidores da apoptose de proteínas da família (IAPs). Até agora, oito IAP humanas foram identificadas, incluindo c-IAP1, c-IAP2, NAIP, XIAP, PLI-2, Bruce, survivina e Vivendo [12]. Livina foi recentemente identificado como sendo um gene anti-apoptótica romance. Livina é recrutado para os complexos de sinalização de receptor de morte, em que inibe a activação de caspases responsáveis pela apoptose e protege as células de diversos estímulos pró-apoptóticos. Livina está associada com a indução de fenotipos oncogénicos incluindo invasão, motilidade, a proliferação celular e a inibição da apoptose em linhas celulares de cancro humano [13-16]. Além disso, a expressão de Livin na grande maioria dos cancros humanos é melhorada e correlacionados com o desenvolvimento e progressão de cancro [17-22]. O silenciamento do gene de Livin usando pequeno ARN interferente (siRNA) diminui o volume do tumor por indução de apoptose num modelo de xenoenxerto de cancro colorrectal [23]. Portanto, vivendo é considerada um potencial alvo terapêutico para o tratamento de câncer colorretal.
Os objetivos deste estudo foram avaliar se Vivendo afeta comportamento biológico oncogénica de células de câncer colorretal em humanos, para avaliar Vivendo expressão em tecidos de câncer colorretal em humanos, e examinar a correlação de Vivendo com apoptose, proliferação de células tumorais e as características clínico-patológicas, incluindo a sobrevivência.
declaração de Ética Materiais e Métodos
Este estudo foi aprovado pela revisão Institucional Conselho de Chonnam Hwasun National University Hospital (Jeonnam, Coreia). Um consentimento informado foi obtido de cada participante antes da aquisição de tecidos. Todos os participantes assinaram consentimento de suas informações a serem armazenados no banco de dados do hospital e usado para a pesquisa.
Pacientes e amostras de tecido
Vinte tecidos de câncer colorretal e tecidos de cólon normais emparelhados foram coletadas por biópsia colonoscopic para as preparações de RNA e proteínas no Chonnam Hwasun National University Hospital. amostras fixadas em formalina e tecido embebido em parafina de 161 pacientes escolhidos aleatoriamente submetidos a cirurgia para o cancro colorectal na Universidade Nacional Chonnam Hwasun Hospital entre janeiro de 2004 e dezembro de 2004 foram obtidos para imuno-histoquímica. Nenhum paciente havia sido submetido a radioterapia pré-operatória ou quimioterapia. relatórios patológicos e histórias clínicas no momento da cirurgia foram revistos em registros médicos. blocos de tecido foram seleccionados através da visualização lâminas patológicos originais e a escolha de blocos que mostram a junção entre o epitélio do cólon normal e a região do tumor. Os tumores foram encenadas em conformidade com a American Joint Committee on Cancer sistema de estadiamento [24]. A sobrevivência foi medido a partir do momento da cirurgia, até o acompanhamento de 31 de dezembro de 2010.
cultura de células e siRNA transfecção
As linhas celulares de cancro colorectal SW480 e DKO1 humanos foram obtidas a partir da American Type cultura Colecção (Rockville, MD, EUA) e cultivadas em DMEM (Hyclone, Loan, UT, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) numa incubadora humidificada a 37 ℃ com um co 5%
2 atmosfera. Livina e mexidos ARNsi foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA) e da Qiagen (Valencia, CA, EUA), respectivamente. livina ADNc foi subclonado no vector pcDNA3.1 (Invitogen, Carlsbad, CA, EUA). livina construção foi verificada por sequenciação. O gene específico foram transfectadas utilizando Lipofectamine
TM RNAiMAX e Lipofectamina
TM 2000 (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante e, em seguida, incubadas durante 48 h. Além disso, as células transfectadas com o vector pcDNA3.1 foram tratados selectivamente com o 5-fluorouracilo (5-FU) (10 ug /ml, Choong-Wae, Chung-Nam, Coreia) durante 48 h.
Inverter transcription- reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)
o RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) e transcritos de modo inverso com os reagentes de transcrição MMLV (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. A amplificação por PCR do ADNc foi realizada utilizando os iniciadores específicos do gene e ir Taq
® polimerase de ADN (Promega, Madison, WI, EUA). Os seguintes iniciadores específicos utilizados foram; Livina 5′-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3 ‘/5′-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3′; GAPDH 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘/5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’.
Western blot
Os lisados celulares foram preparados usando M-PER
® reagente Extração de proteínas de mamíferos (Thermo, Rockford, IL, EUA) com Halt
TM fosfatase inibidor e Halt
TM cocktail inibidor de protease (Thermo). As proteínas totais foram electrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA), e as proteínas específicas foram colocados a hibridar com o anticorpo primário. Foram utilizados os anticorpos seguintes: anticorpos contra Vivendo, X-chromosome ligação IAP (XIAP), survivina e β-tubulina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos contra quinase extracelular regulada por sinal (ERK), fosfo-ERK, p38, e fosfo-p38, c-Jun NH
2-terminal cinase (JNK), fosfo-JNK, fosfo-Akt, Akt, fosfo-p65 clivada, caspase (3, 7, e 9), poli clivado (ADP-ribose) polimerase (PARP), dependente de ciclina quinase 4 (CDK4), CDK6, ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, p21, p27, p57, p15, p16 e segundo activador derivado de mitocôndrias de caspases proteína /IAP ligação directa com baixo pi (SMAC /DIABLO) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). proteínas imunorreactivas foram visualizadas por a quimioluminescência aumentada HRP sistema de detecção de substrato (Millipore) e o LAS-4000 analisador de imagens luminescentes (Fujifilm, Tóquio, Japão).
foi calculada
invasão celular ensaio
capacidade invasiva pelo número de células que passaram por Transwell câmaras de filtro (Corning Inc., Corning, NY, EUA) com poros de 8 um. filtros Transwell foram revestidas com gelatina a 1% durante a noite e secou-se à temperatura ambiente (TA). As células foram semeadas sobre as células viáveis de 2 x 10
5 em 0,2% de BSA em meio a câmara superior. Fibronectina do plasma humano (Calbiochem, La Jolla, CA, EUA) foi adicionado como uma forma de BSA a 0,2% quimioatractivo na cara inferior. Depois de 24 h de incubação, as células invadidas sobre a superfície inferior do Transwell foram corados com Diff-Quik solução (Sysmex, Kobe, Japão) e contado em cinco campos selecionados sob um microscópio de luz. Os dados são expressos como média ± desvio padrão do número de células /campo em três experiências individuais.
migração celular ensaio
O ensaio de migração de células foi feita utilizando-Cultura inserções (2 x 0,22 cm
2; Ibidi, Regensburg, Alemanha). Para criar uma lacuna ferida, as células foram semeadas em placas de cultura a-inserções, que foram suavemente removido após 24 h de incubação usando pinças estéreis. O progresso do fechamento da ferida foi fotografada com um microscópio invertido. A distância entre as lacunas foi normalizado para 1 cm após a captura de três locais aleatórios.
A viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada com o EZ-CyTox (sais de tetrazólio, WST-1) ensaio de viabilidade celular kit (Daeil Lab Inc., Seoul, Coreia do Sul). Após a aplicação do reagente WST-1 a 37 ℃, a viabilidade celular foi medida utilizando um leitor de microplacas (Infinito M200, Tecan, Áustria GmbH, Viena, Áustria) com Magellan V6 software de análise de dados (Tecan). Triplicado poços foram usadas para cada experiência e todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado.
análise de citometria de fluxo
As células transfectadas foram tripsinizadas, recolhidas em PBS e ressuspensas em 1x tampão de ligação (BD Biosciences , San Diego, CA, EUA). As suspensões de células foram incubadas na APC Anexina V e 7-amino-actinomicina D (BD Biosciences) a TA. Para a análise do ciclo celular, as células foram incubadas em 10? G /ml de ribonuclease A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 50 ug /mL de iodeto de propídio (PI) à TA no escuro. A população de células anexina-V-positivo e a fase do ciclo celular foram analisados usando um BD celular Missão
® versão 3.3 do instrumento (Becton Dickinson, San José, CA, EUA) e WinMDI software versão 2.9 (The Scripps Research Institute, San Diego, CA, EUA).
imunohistoquímica
secções de tecido parafina de pacientes foram desparafinados, reidratados e recuperados com tampão de recuperação. Os tecidos foram tratados com uma solução de peroxidase-bloqueio (Dako, Carpinteria, CA, EUA) para bloquear a actividade da peroxidase endógena e foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-humano de Livin em solução diluente primário (Invitrogen) durante a noite a 4 ° C. Após lavagem em TBST, os tecidos foram coradas utilizando Dako, real
TM Envision sistema de detecção de HRP /DAB (Dako). tecidos manchados foram vistos e fotografados em microscópio de luz.
Avaliação da expressão Vivendo
espécimes imunocoradas foram avaliadas independentemente por dois observadores sem o conhecimento dos dados clínico-patológicos. Se houvesse uma discrepância, um consenso foi alcançado após uma avaliação mais aprofundada. A intensidade das células cancerosas positivas foi graduada numa escala de quatro: 0, sem coloração de células cancerosas; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; 3, de coloração forte. A percentagem de células cancerosas coradas também foi graduada numa escala de quatro: 0, nenhum; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. A classificação de intensidade foi multiplicado pela classificação por cento mancha obter uma pontuação global. A pontuação geral média para os 161 tumores analisados foi de 4,0. Assim, a pontuação geral média de 4,0 foi escolhido como o ponto de corte para discriminar Vivendo status de expressão. As amostras com uma pontuação . 4 foram considerados positivos, e aqueles com uma pontuação ≤ 4 foram considerados como expressão negativa
Avaliação da proliferação de células tumorais
células tumorais em proliferação foram visualizados por coloração imuno-histoquímica utilizando um anticorpo anti-Ki-67 (MIB-1; diluída 1: 150; Dakopatts, Glostrup, Dinamarca). Distinct nuclear Ki-67 imunorreactividade foi considerado positivo. O índice de marcação de Ki-67 (KI) é apresentada como o número de núcleos de Ki-67-positivos /1000 núcleos de células de tumor. KI foi utilizado para estimar a capacidade proliferativa das células tumorais.
desoxinucleotidiltransferase Terminal (TdT) mediado desoxiuridina trifosfato de rotulagem final (dUTP) nick (TUNEL) ensaio
células e corpos apoptóticos foram detectado usando o deadend
TM Colorimétrico Sistema de TUNEL (Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as secções de tecido foram desparafinados e hidratado através de uma série de álcoois graduados. A permeabilização foi, então, realizada em solução de proteinase K, durante 15 min. Marcação foi realizada pela adição da enzima TdT mistura de reacção para secções de tecido sobre as lâminas durante 60 minutos numa câmara humidificada 37 ℃. As células marcadas foram desenvolvidas utilizando estreptavidina HRP e substrato de enzima 3,3-diaminobenzidina. Um método quantitativo para o cálculo de células em apoptose foi usado por dois patologistas independentes. Todas as secções foram examinadas sob campos de alta potência (ampliação de 40 x 10). Os campos foram seleccionados para a zona mais alta marcado para cada caso. O índice apoptótico (IA) foi expresso como o número de núcleos positivos, incluindo corpos apoptóticos entre 1000 núcleos de células de tumor.
A análise estatística
dados de pelo menos três experiências independentes foram utilizados para comparações entre grupos . Os dados são apresentados como médias ± desvios-padrão. Student
t
-test foi usada para determinar a significância estatística para as comparações entre os grupos. A χ
2-teste e teste exato de Fisher, quando necessário, foram usados para comparar Vivendo expressão com vários parâmetros clínico. As relações entre a expressão de Livin ea KI ou AI foram avaliadas pela Student
t
-teste. sobrevida atuarial de pacientes com expressão de Livin positivo ou negativo foram avaliados de acordo com o método de Kaplan-Meier e as diferenças foram testadas com um teste de log-rank. A Statistical Package for the Social Sciences (SPSS /PC + 15,0, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para todas as análises. Um valor de p 0,05 foi considerado significativo.
Resultados
O impacto do Livin ‘on invasão, migração e proliferação de células de câncer colorretal humanos
Para investigar a função de Livin’ on comportamento biológico oncogênico de células de cancro colorectal, vivendo siRNA ou pcDNA3.1-Vivendo foi usada para controlar a expressão do gene endógeno de Livin em linhas celulares de cancro colorrectal humano SW480 e DKO1. Vivendo a expressão do gene em todas as células testadas, mostrou um decréscimo específico em ARNm e os níveis de proteína por transfecção de livina siRNA e um aumento específico por transfecção de pcDNA3.1-livina. Os números de invadir células SW480 e DKO1 Vivendo siRNA-transfectadas foram 30,2 ± 3,1 e 55,3 ± 11,0, enquanto que 51,8 ± 9,5 e 115,3 ± 10,3 células foram observadas em células transfectadas com siRNA mexidos. As células foram medidos em seis aleatórios 0,5 × 0,5 milímetros
2 campos microscópicos, utilizando 10 ug /ml de fibronectina como um quimioatractor. A diferença entre os dois tipos de células foi significativa (p = 0,015 e p 0,001, respectivamente). Em contraste, o número de células invasoras foi significativamente aumentado em pcDNA3.1-Vivendo transfectadas células SW480 e DKO1 em comparação com células vazio pcDNA3.1-transfectadas (P = 0,024 e P = 0,012, respectivamente) (Figura 1A). A diferença ferida artificial em placas de células transfectadas com ARNsi mexidos tornou-se significativamente mais estreita do que a de células de Livin siRNA-transfectadas com 48 h em SW480 e às 24 h em células DKO1 (p = 0,012 e p = 0,016, respectivamente). A lacuna ferida artificial em pcDNA3.1-Vivendo transfectadas SW480 células tornaram-se significativamente mais estreito do que em células empty-pcDNA3.1 transfectadas às 24 e 48 h (p = 0,034 ep = 0,008, respectivamente) (Figura 1B). O ensaio de proliferação celular foi realizada em 2, 3, 4, e 5 dias após a transfecção de Vivendo siRNA ou pcDNA3.1-Vivendo para acessar o potencial de Livin ‘on a proliferação celular. As células em proliferação, conforme determinado por absorvância, diminuiu significativamente nas células SW480 de Livin siRNA-transfectadas em comparação com as células transfectadas com ARNsi mexidos em 3, 4 e 5 dias (p = 0,005, 0,001, e 0,022, respectivamente), mas nenhum diferença significativa foi observada em células DKO1. Além disso, em todas as células testadas, não houve diferença significativa da proliferação celular entre pcDNA3.1-Vivendo e células transfectadas vazio pcDNA3.1-(Figura 1C).
(A) O impacto de Vivendo na invasão de células de câncer colorretal. foi realizado o ensaio de invasão usando o siRNA ou células transfectadas com pcDNA3.1. células invasoras coradas foram contadas e são representadas como um gráfico de entre os grupos. O número de células transfectadas com LS que invadiram foi significativamente menor do que a de células SS-transfectadas. O número de células invasoras foi significativamente maior em células BT-transfectados em comparação com células transfectadas com EV (média ± erro padrão [ES], n = 6; * p 0,05). (B) O impacto da Livin ‘on a migração de células de cancro colorrectal. O ensaio de cicatrização da ferida utilizando siRNA ou células transfectadas com pcDNA3.1 foi realizada e gráficos de migração de células são apresentados como as distâncias relativas cura. A migração celular foi significativamente perturbada em células SW480 e DKO1 LS-transfectadas e aumento nas células SW480 transfectadas LV-(média ± EP, n = 3; * p 0,05). (C) O impacto de Livin sobre a proliferação de células de cancro colorrectal. A absorvância indica células viáveis em proliferação diminuída nas células SW480 LS-transfectadas mas não houve diferença significativa da proliferação celular entre células LV e EV transfectadas (média ± EP, n = 3; * p 0,05). SS; corrida siRNA, LS; Vivendo siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Viver.
O impacto do Livin ‘on a apoptose em células de câncer colorretal humanos
Foram realizadas análises de citometria de fluxo para avaliar o impacto do Livin’ on a apoptose. A taxa de apoptose celular induzida por transfecção de ARNsi de Livin aumentaram significativamente, em comparação com a induzida por transfeco de siARN mexidos (6,9
vs.
19,6%) em células SW480, mas Vivendo knockdown teve uma influência mínima sobre a apoptose (11,3
vs.
16,7%) em DKO1 células (Figura 2A). 5-FU é bem conhecido por induzir a apoptose e afectar ciclo celular das células cancerosas. A sobre-expressão de Vivendo por transfecção de pcDNA3.1-Vivendo inibiu a apoptose de células SW480 em resposta ao 5-FU, mas a sobre-expressão de Vivendo teve uma influência mínima sobre a apoptose em células DKO1 (Figura 2A). Nós investigamos ainda mais as actividades específicas da caspase para determinar a activação das caspases durante a knockdown e superexpressão de Viver. caspases-3 clivada e expressões -7 e PARP foram regulados positivamente nas células SW480 e DKO1 após Vivendo knockdown e para baixo-regulamentado após a superexpressão de Viver (Figura 2B). Tal como mostrado na Figura 2C, o nível de proteína de Survivina foi reduzido devido ao Vivendo knockdown em células SW480 e DKO1, mas os níveis de proteína XIAP e SMAC /DIABLO não foram alteradas em resposta a knockdown de Livin. Além disso, a survivina, XIAP e SMAC /DIABLO níveis de proteína não se alteraram após a sobre-expressão de Vivendo.
(A) A percentagem de células apoptóticas induzidas por transfecção de LS foi maior do que a induzida por transfecção de SS (6,9 vs. 19,6%) em células SW480, mas Vivendo knockdown teve uma influência mínima sobre a apoptose (11,3 vs. 16,7%) em células DKO1. A sobre-expressão de Vivendo por transfecção de LV inibiu a apoptose de células SW480 em resposta ao 5-FU, mas a sobre-expressão de Vivendo teve uma influência mínima sobre a apoptose em células DKO1 (B) Expressão de caspase-3 clivada, -7, -9, e PARP proteínas. A caspase-3, -7 e PARP expressão foi aumentado em células SW480 e depois DKO1 Vivendo knockdown, e diminuíram após a sobre-expressão de Vivendo (C) A expressão de proteínas reguladoras da apoptose. nível de proteína survivina diminuiu seguinte knockdown Vivendo em células SW480 e DKO1, mas os níveis de proteína XIAP e SMAC /DIABLO não foram alterados em resposta a knockdown Vivendo. Além disso, os níveis de proteína survivina, XIAP e SMAC /DIABLO não foram alterados após a superexpressão de Viver. PARP; Poly (ADP-ribose) polimerase, XIAP; IAP, SMAC /DIABLO de ligação do cromossomo X; segunda ativador derivados de mitocôndrias das caspases /IAP direta proteína com baixo pI, SS vinculativo; corrida siRNA, LS; Vivendo siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Vivendo, 5-FU; 5-fluorouracilo, 7-AAD; 7-amino-actinomicina D.
O impacto do Livin ‘on paragem do ciclo celular em células de câncer colorretal em humanos
Nós realizadas análises de citometria de fluxo para detectar se Vivendo poderia alterar a distribuição do ciclo celular. Livina knockdown resultou em paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 de células SW480 e a fase S de células DKO1 (Figura 3A). 5-FU tratamento induziu a paragem do ciclo celular na fase subG1 de SW480 e fase G0 /G1 de células DKO1. A sobre-expressão de Vivendo inibiu a paragem do ciclo celular induzida por 5-FU em células SW480 e teve uma influência mínima nas células DKO1 (Figura 3A). Em seguida, foram avaliados os efeitos de Vivendo em vários inibidores de CDK (CDKIs) envolvidos na paragem do ciclo celular em células de câncer colorretal em humanos. Tal como mostrado na Figura 3B, o nível da proteína p27 aumentado significativamente por knockdown de Livin, e diminuiu a sobre-expressão de vivia no células SW480 e DKO1. No entanto, os níveis de p21, p57, p15 e proteína p16 não foram alterados em resposta a knockdown e superexpressão de Viver. Ciclinas e CDKs é regulada negativamente pela CDKIs. Portanto, examinámos o efeito de Vivendo em níveis expressos de ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, CDK4, CDK6 e. Como mostrado na Figura 3C, a ciclina D1, ciclina D3, CDK4, CDK6 e os níveis de proteína foram significativamente diminuído por knockdown de Livin, e aumentou a ciclina D1 e CDK4 por sobre-expressão de vivia no células SW480 e DKO1.
( a) Vivendo knockdown resultou em paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 de células SW480 e a fase S de células DKO1. 5-FU tratamento induziu a paragem do ciclo celular na fase subG1 de SW480 e a fase G0 /G1 de células DKO1. Superexpressão de Vivendo inibida parada do ciclo celular induzida por 5-FU em SW480 células e teve uma influência mínima nas células DKO1. Uma experiência representativa de três experiências independentes é mostrado. (B) Expressão de quinase dependente de ciclina (CDK) inibidor de proteínas. O nível de proteína p27 foi significativamente aumentada por knockdown Vivendo e diminuiu superexpressão de Vivendo em células SW480 e DKO1. No entanto, os níveis de p21, p57, p15 e proteína p16 não foram alterados em resposta a knockdown ou superexpressão de Viver. (C) A expressão de ciclinas e as proteínas dependentes de ciclina-cinase (CDK). Ciclina D1, ciclina D3, CDK4 e CDK6 níveis de proteína foram significativamente diminuiu Vivendo knockdown e aumentou a ciclina D1 e CDK4 pela superexpressão de Vivendo em células SW480 e DKO1. SS; corrida siRNA, LS; Vivendo siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Viver.
O impacto do Livin ‘on vias de sinalização intracelular envolvidos na apoptose e ciclo celular prisão em células de câncer colorretal humanos
Nós estudamos o efeito de Livin’ on a estimulação da vias de sinalização intracelular que conduzem à prisão apoptose e ciclo celular em células SW480 e DKO1 para explorar os possíveis mecanismos envolvidos na apoptose e ciclo celular prisão. Os níveis de fosforilação de ERK1 /2, JNK e p38 foram regulados negativamente em Vivendo knockdowned SW480 e células DKO1 (Figura 4). Mas Akt e níveis de fosforilação p65 permaneceu inalterada pelo knockdown Vivendo. Além disso, ERK1 /2, JNK, p38, os níveis de Akt e fosforilação p65 permaneceu inalterada pela superexpressão de Viver.
Os níveis de fosforilação de ERK1 /2, JNK e p38 diminuiu seguintes knockdown Vivendo de células SW480 e DKO1. Mas Akt e p65 os níveis de fosforilação não mostrou nenhuma mudança seguinte knockdown Vivendo. Além disso, a ERK1 /2, JNK, p38, os níveis de fosforilação de Akt e p65 não foram alterados por sobre-expressão de Vivendo. SS; corrida siRNA, LS; Vivendo siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Viver.
Vivendo expressão em cancro colorectal humana e tecidos de nódulos linfáticos metastáticos
Para confirmar os resultados dos estudos de linha de células de câncer colorretal, avaliamos Vivendo expressão na RNA e proteína níveis por RT-PCR, Western blot e imunohistoquímica em tecidos com cancro colorectal humanos, emparelhado mucosa colorretal normal, e metastáticos e não-metastáticos tecidos de nódulos linfáticos de mesmos pacientes tirado de biópsia colonoscopic e espécimes cirúrgicos. Nas amostras de biópsia colonoscopia, que confirmou a sobre-regulação da expressão de Livin em tecidos de cancro do que em comparação com mucosa normal emparelhado com os níveis de RNA e de proteínas (p = 0,035 e p = 0,020, respectivamente) (Figura 5A, B). Nas secções de parafina de tecido, a proteína de Livin fez não ou apenas fracamente imunocoradas em condições normais da mucosa colorrectal (Figura 6A). A imunocoloração da proteína de Livin foi identificado predominantemente nos núcleos de células cancerosas, mas não foi detectável no estroma do tumor (Figura 6A). A imunocoloração de tecidos vivendo num dos nodos linfáticos metastáticos era significativamente mais forte do que em tecidos de nódulos linfáticos não-metastáticas (Figura 6B). A pontuação geral para Vivendo imunomarcação em tecidos de nódulos linfáticos metastáticos foi significativamente maior do que em tecidos de nódulos linfáticos não-metastáticos (
P Art 0,001) (Figura 6C)
(A) Vivendo a expressão do mRNA. (B) a expressão da proteína de Livin. Expressão de Viver é regulada em tecidos de câncer em comparação com mucosa normal emparelhado em níveis de mRNA e proteínas em amostras de biópsia colonoscópicas frescos. Cada barra representa a média ± SE de 20 casos. * P 0,05 contra a mucosa colorrectal normal. T; tecido de cancro colorectal, N; emparelhado mucosa colorretal normal.
(A) A proteína de Livin foi predominantemente histoquímica nos núcleos das células cancerosas, mas não ou apenas fracamente fez histoquímica na mucosa colorretal normal (× 100). (B) A imunocoloração de tecidos vivendo num dos nodos linfáticos metastáticos era significativamente mais forte do que em tecidos de nódulos linfáticos não-metastáticas (x100). (C) A pontuação total para se viver imunocoloração em tecidos de nódulos linfáticos metastáticos era significativamente mais elevada do que nos tecidos dos nodos linfáticos não-metastáticas (* p 0,001). T; tecido de cancro colorectal, N; emparelhado mucosa colorretal normal, NL; não metastático tecido linfonodo, ML; tecido linfonodo metastático.
As correlações entre a expressão Vivendo e proliferação de células tumorais e apoptose em câncer colorretal humanos
Ki-67 imunorreatividade foi predominantemente encontrada no núcleo das células cancerosas (Figura 7a ). O KI para 161 tumores variou 21,9-85,6 com uma média KI de 52,8 ± 15,1. Não se observou qualquer diferença significativa entre a expressão de Livin e Kl (p = 0,504) (Tabela 1). critérios morfológicos padrão para células apoptóticas, utilizando o ensaio TUNEL são a presença de frisado ou cromatina encolhida e corpos apoptóticos com um halo claro (Figura 7B). A AI para 161 tumores variou de 0,6 a 30,0 com um AI média de 8,8 ± 5,6. O valor médio de IH de Livin-positivos tumores foi de 6,4 ± 3,7, que foi significativamente menor do que o AI de tumores (p = 0,009) (Tabela 1).
(A) Imunocoloração de Ki-67 de Livin-negativo . A imunocoloração de Ki-67 mostra a positividade nuclear forte nas células cancerosas, mas raramente é positivo na mucosa colorrectal normal (¥ 200). (B) Detecção de células apoptóticas (seta) por coloração TUNEL. células em apoptose com características clássicas de condensação de DNA são mostrados para ter um halo que consiste em núcleo picnótica e no citoplasma encolhida (cabeça de seta) em tecidos de câncer colorretal, mas TUNEL coloração não é positivo na mucosa colorretal normal (× 400). TUNEL, terminal de desoxinucleotidiltransferase (TdT) mediado por trifosfato de desoxiuridina rotulagem final (dUTP) nick. T; tecido de cancro colorectal, N; emparelhado mucosa colorretal normal.
Índices
Total (n = 161)
Vivendo expressão
valor-p
negativo (n = 86)
positivo (n = 75)
KI (Média ± DP) de 52,8 ± 15.151.1 14.754.3 ± ± 15.60.504AI (Média ± SD) de 8,8 ± 5.611.3 ± 6.46.4 ± 3.70.009Table 1 . As correlações entre a expressão Vivendo e proliferação de células tumorais e apoptose em câncer colorretal
KI, Ki-67 índice de marcação.; AI, índice apoptótico;