Abstract

O efeito da quimioterapia do câncer gástrico (GC) RNA Expressão Perfil permanece muito pobre por causa da resistência a múltiplas drogas (MDR). No entanto, os mecanismos subjacentes MDR de GC está longe de ser totalmente compreendido. O objetivo deste estudo é ilustrar os potenciais mecanismos do MDR da GC em, principalmente, o nível de RNA não-codificante de comprimento (lncRNA). Neste estudo, a linha celular de GC, sublinhas SGC7901, e dois MDR, SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR foram sujeitos a uma análise lncRNA microarray. Bioinformática e experiências de verificação foram realizadas para investigar os potenciais lncRNAs envolvidos no desenvolvimento da MDR. análise de caminho indicou que 15 vias correspondeu às transcrições-down regulamentado e que 20 vias correspondeu-regulada transcrições (p-valor de corte é de 0,05). GO análise mostrou que os GOs maior enriquecidos alvo de transcrições up-regulamentados eram “desenvolvimento do sistema” e os mais altos GOs esenriched visados ​​pelas transcrições regulada para baixo foram “processo de biossíntese de esteróis”. Nosso estudo é o primeiro a interrogar lncRNAs diferencialmente expressos em linhagem de células GC humana e sublinhas de MDR e indica que lncRNAs valem a pena para um estudo mais aprofundado para ser os novos biomarcadores candidatos para o diagnóstico clínico de metas de MDR e potenciais para posterior tratamento.

Citation: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) multirresistência longo relacionada RNA não codificante Análise de câncer gástrico Expression Profile. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10.1371 /journal.pone.0135461

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, United States |

Recebido: 24 de dezembro de 2014; Aceito: 22 de julho de 2015; Publicação: 20 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Toda a matéria dados de dados e normalizados foram mostrados em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National programa em Key Projeto de Pesquisa básica ( “973” programa, No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); National Natural Science Foundation da China (No. 81301763); Henan projectos provinciais chave científicas e tecnológicas (N.º 142.102.310.473); Programa Key, National Natural Science Foundation da China (No. 81.030.044)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A multirresistência ( MDR) continua a ser um grande obstáculo para o fracasso da quimioterapia no tratamento do câncer gástrico, que é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Várias proteínas associadas à resistência multi-droga (PRM) [1] ou miARNs [2] que medeiam MDR através de diferentes mecanismos tenham sido previamente identificados. No entanto, os mecanismos subjacentes MDR de GC está longe de ser totalmente clara.

genomas sequenciação indicaram que genomas eucariotos codificar um número surpreendentemente grande de transcrições não codificantes em comparação com genomas procariotas. Entre estas transcrições não codificadoras, muitos são longos RNAs não-codificantes (lncRNAs), que desempenham papéis importantes na regulação do ARNm de transcrição ou tradução nos níveis transcricionais ou pós-transcricional. lncRNAs são RNAs que não possuem o potencial de codificação, que são 200 pb e conta para, pelo menos, 80% dos transcritos de todo o genoma [3]. Dados acumulando indicam que lncRNA desempenha um papel importante na regulação do mRNA [4], organela biogênese [5], o tráfico subcelular de moléculas [6], e desenvolvimento celular [7] [8].

lncRNA desregulação estava envolvido em vários tipos de doenças, incluindo o cancro

[

4

,

9

,

10

]. Ou seja, lncRNAs podem desempenhar papéis importantes na carcinogênese, metástase e invasão de múltiplos tumores malignos através de afectar a expressão do oncogene. Por exemplo, o inibidor de COX-2-lncRNA, lebre, pode actuar como um novo alvo potencial para a COX-2-modulação da inflamação e cancro [11]; mediada por RNAi knock-down de LINC01081 em fibroblastos de pulmão fetal normal mostrou que este lncRNA regula positivamente o nível de transcrição FOXF1, indicando ainda que decréscimo na expressão LINC01081 pode contribuir para o desenvolvimento da displasia alvéolo-capilar com desalinhamento das veias pulmonares [12]; lncRNA HOTAIR pode também ser um indicador valioso para a gestão do cancro do cólon [13] e MALAT1 pode ser considerado como um indicador de prognóstico potencial e pode ser um alvo para diagnóstico e terapia génica para o adenocarcinoma do ducto pancreático [14]; a sobre-expressão de H19 lncRNA aumenta a carcinogénese e metástases de cancro gástrico e o efeito de H19 em GC é mediado pela regulação positiva directa de ISM1 e a supressão de expressão indirecta CALN1 através de miR-675 [15]. Assim, para obter uma visão preliminar dos mecanismos moleculares de MDR de GC, estudamos o perfil de expressão lncRNA de sublinhas GC MDR.

Aqui, nós estudamos os perfis de expressão diferencialmente de lncRNAs e mRNAs entre SGC7901 GC cellline e MDR sublinhas SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR usando análise de microarray lncRNA. Comparação de transcritos diferencialmente expressos entre as sublinhas e cellline parental revelou 15 vias que correspondiam a transcrições regulada para baixo e 20 vias que correspondiam a transcrições up-regulamentados (valor p de corte foi de 0,05). ontologia gênica (GO) análise mostrou que os termos GO mais altamente enriquecido para as transcrições-regulada eram “desenvolvimento do sistema”, “nucleossomo” e “ligação” e os termos GO mais altamente enriquecido para as transcrições regulada para baixo eram “esteróis processo biossintético “,” periferia da célula “e” actividade de desidrogenase de esteróide “. Nossos resultados mostraram que os perfis de expressão lncRNA e mRNA diferiram significativamente entre sublinhas de MDR e linha de células parental. Esta constatação sugere que os níveis de expressão aberrante de lncRNAs pode contribuir para o desenvolvimento de MDR de GC. Um estudo mais aprofundado das diferenças nos perfis de expressão lncRNA pode fornecer novos métodos potenciais para reverter MDR fenótipo de GC.

Resultados

diferencialmente expressos lncRNAs

Os dados de microarranjos highthroghput lncRNA mostrou uma total de 27.883 lncRNAs expressos em cellline câncer gástrico, SGC7901 e duas sublinhas de multirresistência, SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR (S1 Tabela). Para inferir as relações entre as amostras, análise de agrupamento hierárquico foi utilizado para organizar celllines em grupos de acordo com seus níveis de expressão, apresentando as relações dos modos de expressão lncRNA entre celllines (Fig 1A e 1B). Um estudo mais aprofundado destes dados exibiu uma média de 1637 diferencialmente expressos lncRNA. Entre eles, 638 foram consistentemente sobre-regulada e 999 foram consistentemente sub-regulada (dobre change≥2.0) (S2 Tabela). ASHG19A3A028863 (dobre mudança: 146,0139) foi o mais up-regulada lncRNA e ASHG19A3A007184 (dobre mudança: 58,7105) foi o mais regulada lncRNA. Além disso, lncRNAs regulada eram mais comuns do que lncRNAs up-regulamentados em nossos dados de microarranjos (S2 tabela).

A. A dispersão de lncRNA perfil de expressão. mapa B. Calor e dendrograma de agrupamento hierárquico de chips lncRNA.

diferencialmente expressos mRNAs

Houve 19,644 mRNAs identificados nas sublinhas GC MDR analisados ​​por expressão de mRNA de perfil de dados usando análise de microarray e a análise de agrupamento hierárquico apresentado as relações entre os modos de expressão de mRNA que estavam presentes nas sublinhas GC MDR e sua linha de células parental (Fig 2A e 2B) (S3 Tabela). Entre os mRNA diferencialmente expressos entre SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR e SGC7901, 730 foi consistentemente sobre-regulada e 650 foi consistentemente sub-regulada em SGC7901 /ADR e celllines SGC7901 /VCR comparação com SGC7901 (Fig 2B). (Tabela S4). NM_000735 (símbolo de gene: CGA, a mudança vezes: 106.19) foi o mais up-regulada mRNA, e NM_001136574 (símbolo de gene: LANCL1, dobre mudança: 25,43) foi o mais baixo-regulado mRNA (Fig 2B)

A. mapa de calor e dendrograma de agrupamento hierárquico de chips de mRNA. B. Formas mostrando top 10 mRNAs expressos diferencialmente.

GO análise

Para determinar o gene e os atributos do produto de genes em processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares, Gene Ontology (GO) análise foi realizada por meio deste. teste exacto de Fisher é feito para testar se houver mais de sobreposição entre a lista DE e a lista de anotação GO do que seria esperado por acaso. O valor de p indica o significado dos termos GO enriquecimento nos genes DE. Quanto menor o valor-p, mais significativo o GO Prazo (valor-p = 0,05 é recomendado). Ele mostrou que os GOs maior enriquecidos alvo de up-regulada transcrições foram homeostase do tecido (GO: 0.048.731; ontologia: processo biológico; p = 6.84E-08) (Fig 3A), nucleossomo (GO: 0.000.786; ontologia: componente celular; p = 2.10E-07) (Fig 3B) e vinculativa (GO: 0.005.488; ontologia: função molecular; p = 0,001) (Fig 3C) e que os GOs maior enriquecidos visados ​​pelas transcrições regulada para baixo foram processo de biossíntese de esteróis (GO: 0016126; ontologia: processo biológico; p = 0,000) (Fig 3D), periferia da célula (GO: 0.071.944; ontologia: componente celular; p = 3.80E-06) (Fig 3E) atividade esteróide desidrogenase (GO: 0.016.229; ontologia: molecular função;. p = 0,001) (Fig 3F) (S5 Table)

O gráfico mostra os dez melhores contagens dos termos de enriquecimento significativos. A ontologia abrange três domínios: Processo Biológico, componente celular e função molecular. O teste exato de Fisher é usada para descobrir se existe mais sobreposição entre a lista DE ea lista de anotação GO do que seria esperado por acaso. O valor de p indica o significado dos termos GO enriquecimento nos genes DE. Quanto menor o valor-p, mais significativo o GO Prazo (valor-p = 0,05 é recomendado) (AC) As GOs maior enriquecidos alvo de up-regulada transcrições: A, Processo Biológico (BP), B, componente celular ( CC), C, função Molecular (MF). (DF) Os GOs maior enriquecidos alvo de transcrições regulada para baixo: A, Processo Biológico (BP), B, componente celular (CC), C, função Molecular (MF)

análise Caminho

neste estudo, análise de caminho exibiu que 20 vias consistentemente correspondeu-regulada transcrições e que a rede mais enriquecido era “Alcoholism-Homo sapiens (humanos)” (Fisher-P value = 3.66E-08) composto dos 24 genes-alvo (Fig 4A); Além disso, a análise via também mostrou que 15 vias consistentemente correspondeu transcritos-regulada negativamente e de que a rede mais enriquecido era “sapiens da biossíntese-homo esteróides (humanas)” (valor de Fisher-P = 0,00044) composta de 5 genes alvo (Fig 4B ) (S6 Mesa, a recomendar p-valor-limite é 0,05). Entre estas vias, a categoria gene interrupção “Ritmo circadiano” tem sido relatada a ser associado a vários tipos de câncer, incluindo câncer gástrico [16], leucemia mielóide crónica [17], cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço [18], carcinoma hepatocelular [19 ], carcinoma do endométrio [20], e cancro da mama [21]. A categoria de genes “via de sinalização do receptor de NOD-like”, que consiste em NOD1, foi mostrou que NOD1 /Card4 e NOD2 /CARD15 polimorfismos do gene pode ser associada com risco alterado de gástrica [22], colorrectal [23], do pulmão [24 ], laringe [25], da vesícula biliar [26], pancreático [27], intestino delgado, rim [28], o cancro da bexiga urinária [29], o cancro da pele, linfoma [30] e leucemia [31]. Aqui, nós examinamos ainda mais a expressão e função de ARNT (aril receptor de hidrocarboneto translocator nuclear) mediada MDR1 (multirresistência 1) aumento da regulação via. Verificou-se que ARNT e MDR1 foi significativamente regulada para cima no SGC7901 /ADR e linhas celulares /VCR SGC7901 comparação com SGC7901, o efeito de sobre-regulação significativa de MDR1 mediada por ARNT vector de expressão de transfecção foi comprometida através de Sp1 siRNAs transfecção. ensaio de formação de placa de colónias mostrou que as taxas de formação de colónias de células SGC7901 /ADR foram remarably superior em pARNT + /siSp1- grupo em comparação com pARNT + /siSp1 + grupo com o suplemento de adriamicina (ADR) em cultura Meida (p 0,0001) (Figura 5).

(A) Pathway: Alcoolismo-Homo sapiens (humanos). (B) Pathway: sapiens biossíntese-Homo esteróides (humano) .O enredo barra mostra o top ten pontuação Enrichment (-log10 (valor P)) Valor da via enriquecimento significativo. Amarelo marcados os nós estão associados com genes regulados por baixo, laranja marcada nós estão associados com up-regulada ou apenas genes de conjuntos de dados inteiros, nós verdes não têm nenhum significado.

Expressão

(A) de ARNT, MDR1 e Sp1, um western blotting, b, qRT-PCR. (B) O efeito de siARNT transfecção na expressão de ARNT, MDR1 e Sp1, um western blotting, b, qRT-PCR de SGC7901 /ADR, C, qRT-PCR de SGC7901 /VCR. (C) O efeito de pARNT (vector de expressão de ARNT) e siSp1 transfecção na expressão de ARNT, MDR1 e Sp1, um western blotting, b, qRT-PCR de SGC7901 /ADR. ensaio de formação de (D) Placa de colónias de células SGC7901 /ADR com o suplemento de adriamicina para o meio de cultura (de 1 ug /ml) no momento designado. (Os dados foram meio de três experimentos separados (média ± SEM), one-way análise de variância, *** p 0,0001)

em tempo real de validação quantitativa PCR

Para. examinar os dados de microarranjos, seis lncRNAs up-regulamentados e dez lncRNAs sub-regulados foram selecionados aleatoriamente a partir das lncRNAs consistentemente diferencialmente expressos usando SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR e SGC7901 linhas de células e a qRT-PCR resultados e dados de microarranjos são consistentes (Fig 6A ); para estudar ainda mais os níveis dos estas lncRNAs expressão nos tecidos gástricos resistentes a drogas, vinte amostras gástricas resistentes a drogas e emparelhado tecidos não multirresistentes foram examinados para o nível destes lncRNAs utilizando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) expressão (Fig 6B) .Os resultados demonstraram que as amostras com câncer gástrico tratados com ADR durante 5 dias apresentaram diferença significativa de níveis desses dezesseis lncRNAs expressão afformentioned comparação com grupos de controlo (Fig 6c). Além disso, a análise de correlação mostrou que os níveis de expressão lncRNA NR_015379 foram correlacionados negativamente com as taxas de inibição destas amostras gástricas resistentes a drogas vinte (Figura 6D e 6E, p 0,01).

os níveis de expressão de (a) Dezasseis lncRNAs em SGC7901 /ADR e SGC7901 /celllines VCR comparação com linha de células SGC7901. (B) diagrama esquemático de amostras de cancro gástrico tratados com HDRA seguido por qRT-PCR e ensaio de taxa de inibição. (C) os níveis de expressão Sixteen lncRNAs em vinte amostras de câncer gástrico tratados com ADR em comparação com grupos de controle. Níveis de expressão (DE) lncRNA NR_015379 foram negativamente correlacionada com as taxas de inibição de amostras de cancro gástrico tratados com ADR.

Discussão

Nossa pesquisa anterior já descobriram que miR-21 pode promover a resistência aos medicamentos de vários tipos de câncer [32 ]; LncRNA-MRUL promove a expressão ABCB1 em sublinhas celulares de cancro gástrico multirresistentes [33]; atividade CUTL1 é inversamente associado com resistência aos medicamentos e, portanto, é um alvo terapêutico atractivo para modular resistência a múltiplas drogas em câncer gástrico [34]; CSCs gástricos foram identificados a partir de linha de células SGC7901 pré-condicionados-VCR, caracterizado pela alta tumorigenicidade e da capacidade de auto-renovação e diferenciação [35]; MAD2 pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cancro gástrico humano e que o silenciamento do gene MAD2 pode ajudar a lidar com a resistência a múltiplas drogas de células gástricas cancerosas [36] e expressão MGr1-Ag /37LRP induzida por hipoxia activados por HIF-1 depende sobre a activação de ERK. Estes eventos são dependentes de intermediários reativas de oxigênio [37] .No entanto, os mecanismos de resistência a múltiplas drogas de GC são muito mais esclarecidos e lncRNAs desregulação da sublinhas GC MDR não foram estudados ainda.

Neste estudo, linha de células GC , sublinhas SGC7901, e dois MDR, SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR foram sujeitos a uma análise lncRNA microarray. Bioinformática e experiências de verificação foram realizadas para investigar os potenciais lncRNAs envolvidos no desenvolvimento da MDR. análise de caminho indicou que 15 vias correspondeu às transcrições-down regulamentado e que 20 vias correspondeu-regulada transcrições (p-valor de corte é de 0,05). GO análise mostrou que os GOs maior enriquecidos alvo de up-regulada transcrições foram “desenvolvimento do sistema” e os mais altos GOs esenriched visados ​​pelas transcrições regulada para baixo foram “processo de biossíntese de esteróis”.

A evidência crescente mostrou que lncRNA ( ARN não codificante de comprimento) poderá desempenhar um papel importante na carcinogénese e invasão tumoral e metástase [38]. Por exemplo, John [39] etc demonstrou que lncRNA

PCGEM1

está associado ao câncer de próstata; foi encontrada crescimento transformante lncRNA-Smad7 factor-induzida β para inibir a apoptose de células (A) cancro da mama do rato JygMC e sugerem assim ed um mecanismo complexo para regular os aspectos anti-apoptótica e tumor-progressivas de TGF-β sinalização [40] ; lncRNA, próstata transcrito associado a um cancro 29 (PCAT29), caracterizou-se, juntamente com a sua relação com o receptor de androgénio, funcionado como um supressor de tumor regulada de androgénio em cancro da próstata [41]; Yuan etc descoberto um induzida por TGF-β lncRNA romance, lncRNA-ATB, que estimulou EMT através sequestrantes miR-200s e facilitou a colonização por estabilização

IL-11

ARNm, promovendo, assim, ambos os passos precoces e tardios de metástases do cancro [42].

verificou-se que lncRNAs desempenham papéis cruciais na alteração da expressão de genes codificadores de proteínas através de cis- ou trans-mecanismos. Aqui descobrimos que lncRNAs-regulada em SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR comparação com SGC7901lncRNA como AF119893, que foi antisense intrônica para NRP2 (Neuropilin-2). Tem sido sugerido que o eixo NRP2 /VEGF-C desempenha um papel no cancro da bexiga e resistência à terapia da via VEGF-paxilina-NRP2 poderia representar um novo alvo terapêutico para o cancro e outras doenças relacionadas com a angiogénese. lncRNA AF461897 foi intron sentido cumulação de ABCB9. Dong etc demonstrou que o miR-31 exerceu um efeito anti-apoptótico provavelmente através da inibição da ABCB9 e, assim, proporcionar uma nova estratégia que envolva a utilização de miR-31 como um alvo potencial no NSCLC quimioterapia. lncRNA BC065904 foi intrão-sentido sobreposição de CTBP2, um dos co-repressores transcricionais de família C-terminal da proteína de ligação (CtBP), que funcionava como um co-repressor de E2F7 e como um regulador de resposta a danos no ADN. lncRNA NR_026900 foi exão-sentido sobreposição de QSOX1, o que foi demonstrado para reduzir a proliferação, a migração e a invasão de células do cancro da mama in vitro e reduz o crescimento do tumor in vivo.

Por outro lado, lncRNAs regulada para baixo em SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR comparação com SGC7901lncRNA como AF113689 foi antisense natural para RRM1. Khatri etc têm relatado que a pré-exposição de RRM1 siARN diminuiu o valor IC50 de cloridrato de gemcitabina 5 dobras em células A-549 em relação ao cloridrato de gemcitabina sozinha, indicando que era um oncogene RRM1 potencial de cancro do pulmão. lncRNA uc010iyh foi antisense intrônica de NAIP (Neuronal apoptose proteína inibitória), que é um dos IAP-família. Tem sido demonstrado que os IAP podem estar envolvidos na doença da próstata (BPH, PIN e PC) pode ser desenvolvimento desde provocar a inibição de apoptose e a proliferação de células posteriormente. LncRNA uc003jsd foi exão sentido cumulação de PDE4D, ou seja, 3 ‘específica do AMPc, 5’-cíclica 4D fosfodiesterase. Lin etc mostraram que as funções de PDE4D como um factor indutor de tumores e representa uma enzima segmentado única de células cancerosas. LncRNA NR_002332 foi exão-sentido sobreposição de ST7, supressor de tumorigenicidade 7, que tem sido proposto para ser um gene supressor de tumores no cromossoma 7q31.1 região-q31.2.

Pathway Analysis revelou potenciais vias envolvidas na o desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas (MDR) de cancro gástrico. ARNT foi uma das 20 vias consistentemente correspondiam a sobre-regulada transcritos e foi referida como estando envolvida no desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas de tumores múltiplos malignos [43], incluindo o mieloma múltiplo [44], e AML (leucemia mielóide aguda) [45] . MDR1 codifica a P-glicoproteína, que é uma bomba de efluxo dependente da energia que poderia exportar moléculas hidrofóbicas planares, incluindo alguns fármacos quimioterapêuticos, tais como a adriamicina, cisplatina, taxol e assim por diante a partir da célula [46, 47]. Aqui, descobrimos que ARNT e MDR1 foram significativamente up-regulamentada em SGC7901 /ADR e linhas de células /VCR SGC7901 compacared para SGC7901, o efeito significativo aumento da regulação do MDR1 mediado por ARNT vector de expressão de transfecção foi comprometida através de Sp1 siRNAs transfecção, que indicado o papel de ARNT-MDR1pathway no fenótipo MDR do cancro gástrico.

Outras investigações mostraram que alguns genes codificadores de proteínas envolvidas no fenótipo de resistência a drogas e desenvolvimento de tumores malignos foram talvez cis-regulados por lncRNAs correlacionados . Por exemplo, ABCB1 (cassete de ligação de ATP, subfamília B (MDR /TAP), membro 1, P-glicoproteína (P-gp) gene de codificação), localizada a montante 400KB de lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-relacionados e para cima regulada lncRNA), foi significativamente up-regulada por meio de um potencial papel realce-like interpretado por MRUL e promoveu fenótipo de resistência a drogas de SGC7901 /ADR e células SGC7901 /VCR [33]; ADAM22, um gene candidato para a transformação maligna de ovário endometriose [48], foi correlacionada com lncRNA AL133090 de uma maneira sobrepondo-sentido exão; PLCG1 foi correlacionada com lncRNA AK021471 de uma forma sobreposta sentido intron e mutações recorrentes em PLCG1 foi identificado em angiossarcoma [49]; FYN foi correlacionada com lncRNA AK AK090692 em um intron sentido sobreposição caminho e antagomir-1290 suprime CD133 (+) células no câncer de pulmão de células não pequenas, visando quinase relacionadas com fyn Src tirosina família [50], etc.

Este estudo demonstrou que a desregulamentação de lncRNAs estava envolvido com o desenvolvimento de phynotype multirresistência do câncer gástrico. Uma análise mais aprofundada destes lncRNAs e vias relacionadas podem fornecer informações aos mecanismos de resistência aos medicamentos de quimioterapia de câncer gástrico e proporcionar novas direções para phynotype multirresistência inversa.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Institutional Review Board da Quarta Universidade médica Militar. consentimento informado por escrito foi obtida para todas as amostras de doentes.

linhas de células e cultura de células

A linha de células GC humana SGC7901 foi obtida a partir da Academia de Ciências Médicas Militares (Pequim, China). Duas sub multirresistentes, SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR, foram desenvolvidos em nosso laboratório [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR e SGC7901 foram cultivadas em meio RPMI1640 (Thermo Scientific Co., EUA) que foi suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (Thermo Scientific Co., EUA) numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. VCR (1,0 ug /ml) ou de ADR (0,5 ug /ml) foi adicionado no meio de cultura de células apropriadas para manter o fenótipo resistente à droga.

isolamento de ARN, rotulagem e matriz de hibridação

o ARN total foi colhido a partir SGC7901, SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, CA, EUA) e o Kit RNeasy (Qiagen Co., Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, incluindo um passo de digestão com DNase. O ARN total a partir de cada cellline foi quantificada usando um NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), a integridade de ARN foi avaliada usando o padrão electroforese em gel desnaturante de agarose, e a pureza foi avaliada pela relação da absorvância a 260 nm a 280 nm (A260 /A280). ADNc de cadeia dupla (ds-cDNA) foi sintetizado utilizando 5 ug de ARN total em um kit de síntese de ADNc-ds Invitrogen SuperScript na presença de 100 pmol de iniciadores oligo dT. Em seguida, o ds-cDNA foi etiquetado e realizada a hibridação tal como anteriormente descrito [52]. A hibridação rotulagem RNA e microarray foi realizada por Kangchen Bio-tech, Shanghai, China.

análise do perfil de expressão Highthroughput lncRNA

RNA Qualificado foi utilizado para sintetizar cDNA de cadeia dupla usando Superscript Double- stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., EUA). cDNA de cadeia dupla foi marcado e hibridado com a V2.0 lncRNA microarray humana (Arraystar Co. EUA). microarray V2.0 contém cerca de 33.000 lncRNAs recolhidos a partir de fontes de dados de autoridade, incluindo NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, lncRNAs de literaturas e UCRs. As sequências foram seleccionadas com estratégias proprietárias. sequências de repetição e ncRNAs mais curto do que 200 pb foram eliminados. Para aumentar a confiança estatística, cada matriz lncRNA humana foi composta por 60,302 sondas distintas (60 meros) e cada transcrito foi representado por 1-5 sondas. Cada transcrição foi representado por um exão ou emenda sonda junção específico para identificar transcritos individuais com precisão. A hibridização microarray e análise bioinformática foi realizada por Kangchen Bio-tech, Shanghai, China. Os dados de intensidade-primas e dados normalizados foram mostrados em Gene Expression Omnibus (GSE69342: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN total de SGC7901, SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, CA, EUA) e, em seguida, foi transcrito de forma inversa utilizando o kit reagente PrimeScript RT com gDNA Eraser (Perfeito Tempo real) (Takara, Dalian China) de acordo com truções do fabricante. A expressão de oito lncRNAs regulado para cima e para baixo seis lncRNAs-regulados foi medida por qRT-PCR utilizando ensaios SYBRGreen (Takara, Dalian, China), e GAPDH foi usada como um controlo interno. Os iniciadores estão listados na Tabela 1. O nível de cada lncRNA expressão foi representada como a mudança vezes utilizando 2- △△ métodos Ct. O nível de expressão de lncRNAs diferencialmente expressos entre SGC7901 e MDR sublinhas SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR foram analisados ​​utilizando o teste t de Student com SPSS (versão 17.0 SPSS Lnc). Um valor de p 0,05 foi considerado significativo.

histocultura droga resposta do ensaio (HDRA) tecido de tumor fresco GC foi colhida a partir de cada amostra ressecada cirurgicamente e colocados numa placa de 24 poços. Cubos de esponja de colagénio (gel de 1 cm

3) foram imersos em 1 ml de RPMI 1640 suplementando com soro bovino fetal a 20%. Os tecidos tumorais foram colocados sobre a esponja de colagénio seguinte ADR foram adicionados a uma concentração final de 6 ug /mL e foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO2. tecidos tumorais tratados com solução salina normal (N.S) sem ADR foram utilizados como controle. Métodos de avaliação e de cálculo são como previamente descrito [53]. A taxa de inibição (IR) do crescimento do tumor = 100 × (1-absorvância média de poços tratados por grama de tumor a absorvância dos poços de controlo por grama de tumor /média). Neste estudo, o valor de cut-off de IV igual a ou maior do que 30% (IR30) foi definida como a quimiossensibilidade de acordo com o resultado do estudo preliminar [54]. Assim como instruído, a informação patológica clínica da origem do tecido tumoral usado para HDRA deve ser dada, respectivamente, foram apresentados na Tabela 2.

linhas de células e condições de cultura

A célula GC humana linha SGC7901 foi obtida a partir da Academia Militar de Ciências Médicas (Pequim, China). sublinhas multirresistentes SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR foram desenvolvidos em nosso laboratório. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, e SGC7901 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Thermo Scientific, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (ThermoScientific) numa atmosfera de 5% de CO2, incubadora humidificada a 37 ° C. Vincristina (VCR; Sigma, Inc., St. Louis, MO; 1,0 ug /ml) e ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO; 0,5 ug /ml) foram adicionados ao meio de cultura de células adequadas para sublinhas manter o fenótipo resistente a medicamentos

Construção de pcDNA3.1 (+) -. plasmídeo ARNT

Para sobre-expresso ARNT, pcDNA3.1 (+) – plasmídeo ARNT foi construído. O vector humano cDNA ARNT expressão (pcDNA3.1 (+) – ARNT) foi construído por CW Biotech Co. Ltd, Beijing, China. Resumidamente, o plasmídeo pcDNA3.1 (+) – ARNT foi gerado de acordo com a sequência de ADNc do GenBank. O gene ARNT foi gerado através de amplificação por PCR. O plasmídeo pcDNA3.1 (+), foi extraído através de um kit Maxi Preparação (Omega, Geórgia, EUA). O produto de PCR foi subclonado em BamHI (Takara, Mountain View, EUA) e os locais HindIII (Takara) de plasmídeo pcDNA3.1 por ligase de T4 (Takara, Mountain View, USA). O pcDNA3.1 (+) -. ARNT construção foi verificada por sequenciação de ADN (Invitrogen, Grand Island, EUA) (dados não mostrados)

A geração de linhas celulares estáveis ​​Arnt

SGC7901 /ADR células foram cultivadas em placas de 12 poços com 1,0 x 10

5 células em cada poço, numa incubadora com fornecimento constante de 5% de CO2 a 37 ° C. O meio foi mudado após 24 h com diferentes concentrações de antibiótico G418 G418 (600 ug /mL) e substituídas a cada 3 dias durante 14 dias após a cultura de células. células parentais foram transfectadas com pcDNA3.1 (+) – Arnt plasmídeos utilizando lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. A densidade das células foi de 2 × 10

5 células por poço em placas de seis poços. colónias de células com monoclonal de resistência a G418 foi gerado usando o método de diluição limitante por cultura de célula única em meio de 100 uL em placas de 96 poços durante 24 h. colónias de células monoclonais foram digeridos a 15 dias mais tarde para amplificação posterior de células de cultura com expressão estável ARNT em placas de 24 poços. As células foram transferidas para um frasco de cultura de células até que houve aproximadamente 90% confluentes. Os Arnt sobre-expressos linhas de células transfectadas por pcDNA3.1 (+) – ARNT foram nomeados como SGC7901 /ADR ARNT

RNA de interferência pequeno (siRNA) transfecção

Para knockdown da expressão de mRNA ARNT. , foi realizada a transfecção de siRNA. Para as transfecções, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 50 nM de ARNsi (Gene Pharma Co., Xangai, China) foram utilizados de acordo com as recomendações do fabricante, conforme descrito anteriormente [55]. As sequências de siRNA utilizados são: 5′-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ‘, 5′-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3’

Western blotting

de proteína celular total foram lisadas utilizando tamp de lise suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonilo (1 mM. ) no gelo. Em seguida, a proteína foi submetida a electroforese através de géis de SDS 12% de poliacrilamida e transferido para uma membrana de PVDF (Millipore, Massachusetts, EUA). 5% leite magro em pó foi utilizada para bloquear as membranas à temperatura ambiente durante 1 h e os anticorpos primários foram incubadas durante a noite. Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários marcados com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente depois de três lavagens de 10 min em solução salina tamponada com trietanolamina Tween (TBS-T). Finalmente, os sinais foram detectados utilizando um kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EUA) e as membranas foram digitalizados e analisados ​​utilizando um ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, Califórnia, EUA) sistema de imagem com software de imagem (Versão 1.0) .