Sumário

Fundo

sulfatase humana 1 (HSulf-1) é um endosulfatase heparina-degradantes que desulfates proteoglicanos de sulfato de heparano na superfície celular (HSPGs) na matriz extracelular e modula negativamente de ligação à heparina factor de crescimento e citocina na proliferação celular. Mas HSulf-1 função é mais complicado, e seu mecanismo molecular não tem sido bem conhecido.

principais conclusões

Para investigar mais as funções de HSulf-1 gene na regulação do fator de crescimento endotelial vascular receptor (VEGFR) de sinalização, uma série de vectores que expressam, foram gerados HSulf-1 RNA pequeno hairpin (shRNA) e VEGFR-2 shRNA HSulf-1. HSulf-1 re-expressão pode downregualte a fosforilação de VEGFR-2 e inibem a proliferação de células de cancro tanto em linhas celulares de cancro do ovário e hepatocelulares. Knockdown da HSulf-1 por expressão HSulf-1 shRNA melhorada a recuperação de elevados níveis de fosforilada VEGFR-2, e knockdown de VEGFR-2 por VEGFR-2 shRNA inibiu a actividade de proliferação de células de cancro in

in vitro

em certa medida. Em xenoenxertos de cancro humano em ratinhos nus, o crescimento tumoral foi inibido significativamente, após injecções de adenovírus expressando HSulf-1, com as taxas de inibição de tumor de 46,19% e 49,56% em modelos de tumor de ovário e hepatocelulares, respectivamente. HSulf-1 expressão reduzida significativamente a densidade de microvasos tumor.

Conclusões

Os resultados demonstraram que HSulf-1 re-expressão tanto em células de câncer de ovário e hepatocelular induz eficácia antitumoral atenuando a fosforilação de VEGFR- 2 e suprimir a angiogénese. antiproliferação Portanto, HSulf-1-mediada e antiangiogenesis poderia ser uma abordagem razoável para a terapia do cancro

Citation:. Ji W, Yang J, Wang D, Cao L, Tan W, Qian H, et al. (2011) HSulf-1 Gene Exposições Anticancer de eficácia através Negativamente Reguladora VEGFR-2 Sinalização em cancros humanos. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10.1371 /journal.pone.0023274

editor: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Abril, 2011; Aceito: 11 de julho de 2011; Publicação: 10 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Ji et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Natural Científico da China (81071866, 30872998). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteoglicanos sulfato de heparano (HSPGs) na matriz extracelular, são constituintes importantes para a regulação da sinalização de factor de crescimento de ligação à heparina, como o factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de hepatócitos (HGF) [1], [2]. A sulfatação de

N

resíduos acetilglicosamina do HSPGs é fundamental para as interações entre estes ligantes de fatores e seus tirosina quinases de receptores na superfície da célula [3]. sulfatase humana 1 (HSulf-1) foi caracterizada a ser um endosulfatase heparina-degradante que funciona para desulfate HSPGs da superfície celular e modulam negativamente o factor de crescimento e citocina [4]. HSulf-1 proteína é amplamente expressa no tecido normal, mas inativados em sua maioria de vários cancros humanos, por exemplo, o ovário, mama, pâncreas, renal, hepática, cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [5] – [7]. A perda de heterozigosidade, a metilação de ilhas DNA CPG e modificações de histonas, possivelmente, são as principais razões para HSulf-1 inativação em cancros humanos [8], [9]. O factor nuclear hepática variante 1 (vHNF1), codificada pelo gene de factor de transcrição 2 (TCF2, HNF1beta), foi também relatada para regular negativamente a expressão HSulf-1 em cancro do ovário [10]. Re-expressão da HSulf-1 em células cancerosas eficazmente resulta numa diminuição da proliferação das células, bem como um aumento da sensibilidade à apoptose induzida pela quimioterapia [11]. Portanto, os dados relatados sugerem que HSulf-1 normalmente funciona como um regulador negativo da proliferação celular, pode desempenhar um papel importante na terapia do cancro.

Para investigar o papel regulador da HSulf-1 no crescimento de ligação à heparina factor de sinalização em cancros humanos, os estudos anteriores identificaram que HSulf-1 expressão pode diminuir a fosforilação cascata de uma série de quinases, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), extracelular quinase regulada por sinal (ERK), cinase de proteína cinase activada por mitogénio ( MEK), a serina /treonina quinase (AKT) após tratamento com factores de crescimento adicionados exogenamente, e seguido de inactivação de vias de sinalização a jusante [6], [11], [12]. HSulf-1 está também envolvida na inibição da fosforilação mediada por autócrino de EGFR-ERK em células de cancro da mama induzidos por privação de soro, e a inibição da sinalização de EGFR-ERK autócrina por HSulf-1 resulta numa redução da expressão de ciclina D1, um diminuição da fracção de fase S e uma fracção G2-M aumentada, e, finalmente, que conduz à inibição da sobrevivência das células em células de cancro da mama [7]. Portanto, a perda da HSulf-1 em cancros e linhas celulares de cancro está associada com a sobre-regulação do factor de crescimento de sinalização pela fosforilação da cinase aumentada, e a fosforilação e activação da tirosina-quinases receptoras têm sido implicadas na promoção da carcinogénese e do desenvolvimento de cancros.

Além disso, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e receptor de VEGF (VEGFR) estão envolvidos na supressão de células cancerosas HSulf-1-mediada [6]. Nós, portanto, supor que HSulf-1 pode apresentar potência anticancerígena por inibir a angiogênese na maioria dos cânceres humanos. A família VEGFR contém três membros, o VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR /Flk-1) e VEGFR-3 (Flt-4), que são os receptores da tirosina quinase transmembranares que regulam a formação de sangue e linfático embarcações. Entre estes três receptores, o VEGFR-2 é geralmente reconhecido como tendo um papel principal na mediação da resposta induzida por VEGF que regula directamente a angiogénese de tumores [13]. Neste estudo, com a construção de vários vectores portadores do gene da HSulf-1, HSulf-1 RNA pequeno hairpin (shRNA) ou VEGFR-2 shRNA, que forneceram provas para demonstrar que a re-expressão HSulf-1 exibiram um efeito negativo sobre o crescimento de células por downregulating VEGFR-2 sinalização tanto no câncer de ovário e linhas de células de carcinoma hepatocelular. A eficácia antitumoral da HSulf-1 também foi validado em xenoenxertos de cancro do ovário e hepática em ratos nus.

Resultados

Inactivação de HSulf-1 é um evento molecular comum na maioria dos cancros humanos e envolve em VEGFR-2 sinalização

a proteína HSulf-1 é amplamente expresso no tecido e funções normais para modular negativamente a sinalização do factor de crescimento. Para demonstrar a sua inactivação na maioria dos vários cancros humanos, examinámos HSulf-1 expressão em diversos tipos de amostras de cancro humano por imuno-histoquímica. Nas células epiteliais normais de tecidos, HSulf-1 foi positivo com uma taxa positiva de 100,0%. Mas nos seus correspondentes cancros, HSulf-1expression foi suprimida obviamente. As taxas de positivos da HSulf-1 foram 23,1% (26/06), 16,7% (12/02), 31,8% (22/07), 11,1% (09/01), 44,4% (18/08) em hepatocelular, mama, gástrico, cânceres renais e de cólon, respectivamente (Fig. 1A).

(a) Os espécimes, incluindo vários tipos de câncer e seus tecidos normais adjacentes, foram fixados em formol a 10% neutra durante 6 horas, incluídas em parafina incorporado, e cortado em 5 seções mm de espessura para HSulf-1 imuno-histoquímica. As células de carcinoma (HCC) hepatocelular foram negativos para a expressão HSulf-1, que estavam rodeados por células do fígado HSulf-1-positivos. O câncer de mama, câncer de estômago e células de carcinoma de células claras renais foram todos negativos, e as células de câncer de cólon foram positivos para HSulf-1 expressão; ampliação original × 200 (painel superior). As percentagens de células HSulf-1-positivos em todas as amostras foram contadas dentro de 5 campos de alta potência (ampliação original × 400) sob o microscópio, e mostrou em histogramas (painel inferior); * P 0,05; ** P 0,01. (B) A expressão de VEGFR-2, incluindo t-VEGFR2 e p-VEGFR2, em 26 casos de HCC foi detectado por imuno-histoquímica; ampliação original × 400 (painel da esquerda). As percentagens de células positivas em 6 HSulf-1-positivos e 20 HCC HSulf-1-negativas foram contadas dentro de 5 campos de alta potência (ampliação original × 400) sob o microscópio, e mostrou em histogramas (painel direito); * P . 0,05

O efeito evidente da HSulf-1 é o de diminuir a fosforilação cascata de uma série de quinases de tirosina receptores, o que foi demonstrado em VEGF e VEGFR sinalização [6]. Por conseguinte, explorou a expressão de um total de VEGFR-2 (t-VEGFR2) e VEGFR-2 fosforilado em Tyr1175 (p-VEGFR2

Tyr1175) em amostras de tumor (Fig. 1B). Entre os 26 casos de carcinoma hepatocelular, existe uma diminuição evidente da p-VEGFR2

nível Tyr1175 no carcinoma hepatocelular HSulf-1-positivos do que no carcinoma hepatocelular HSulf-1-negativa (P 0,05), mas não houve diferença de expressão t-VEGFR2 entre eles (P 0,05).

Adenovírus mediada HSulf-1 re-expressão diminui a expressão da fosforilação de VEGFR-2 em células cancerosas

Para testar a eficiência da infecção de adenovirus, células de cancro BEL-7404 foram infectadas com o adenovírus Ad5-EGFP controlo portador de um gene repórter da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e observou quarenta e oito horas após a infecção sob um microscópio fluorescente. As percentagens de células positivas para EGFP-eram 42,67 ± 12,25% e 86,33 ± 26,48% a multiplicidades de infecção (MOI) de 5 e 10 ufp /célula, respectivamente (Fig. 2A).

(A) BEL 7404 células foram infectadas com o adenovírus Ad5 controlo-EGFP a MOI de 5 e 10 ufp /célula, e as percentagens de células EGFP-positivos foram observados sob um microscópio de fluorescência, ampliação original 400 ×. (B) RT-PCR foi utilizada para identificar HSulf-1 expressão mediada por adenovírus Ad5-hSulf1. 1, as células infectadas com Ad5-hSulf1 a uma MOI de 10 pfu /célula; 2, as células infectadas com Ad5-hSulf1 a uma MOI de 10 pfu /célula e, em seguida, transfectadas com HSulf-1 shRNA vector numa concentração de 20 ug /10

5 células; 3, células parentais. (C) A expressão da HSulf-1, t-VEGFR2 e p-VEGFR2

Tyr1175 foi identificado por western blotting. gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizada como um controlo de carga. A análise densitométrica foi efectuada para demonstrar os níveis de expressão de p-VEGFR2

Tyr1175 nas células cancerosas, com a densidade normalizada de GAPDH. As colunas representam a média de três análises separadas; barras = SD; ** P . 0,01

As linhas celulares de cancro parentais, SKOV3 e BEL-7404, foram negativos para HSulf-1 expressão. Após 48 h pós-infecção de Ad5-hSulf1 a uma MOI de 10 pfu /célula, as células cancerosas foram positivos para HSulf-1, HSulf-o e um shRNA pode regular negativamente o nível de expressão HSulf-1 (Fig. 2B). Uma vez que o gene da HSulf-1 pode diminuir a fosforilação de quinases envolvidas em muitas vias de sinalização de factor de crescimento, foram examinados os níveis de t-VEGFR2 e p-VEGFR2

Tyr1175 expressão. Em comparação com as células cancerosas parentais, o nível de t-VEGFR2 permaneceu sem alteração nas células Ad5-hSulf1 infectadas. No entanto, o nível de p-VEGFR2

Tyr1175 teve uma diminuição evidente após a infecção de Ad5-hSulf1. Quando o HSulf-1 shRNA foi transfectado para o Ad5-hSulf1 infectadas células cancerosas, HSulf-1 expressão foi re-inibidas, e o teor de p-VEGFR2

Tyr1175 recuperado quase até aos níveis normais (Fig. 2C).

adenovírus mediada HSulf-1 reactivação inibe a proliferação de células de cancro

porque a perda de HSulf-1 é um evento molecular comum na maioria dos cancros humanos, que reactivada HSulf-1 expressão por infecção de adenovírus que transporta o gene HSulf-1 em diferentes linhas celulares de cancro e examinou a proliferação celular. Em comparação com o controlo de adenovirus Ad5-EGFP, Ad5-hSulf1 exerceu um efeito inibidor evidente sobre a proliferação de células de cancro com forma MOI-dependente. Quando MOI era mais de 20 ufp /célula, a viabilidade celular foi diminuída para menos de 50% em Ad5-hSulf1 infectadas células cancerosas, ao passo que, a viabilidade celular foi superior a 80% em Ad5-EGFP infectadas células de cancro (Fig. 3A).

(a) células cancerosas BEL-7404 SKOV3 e foram infectadas com Ad5-hSulf1 em diferentes MOI. Ad5-EGFP foi usado como controlo um adenovirus. (B) células de cancro BEL-7404 e SKOV3 foram transfectadas com o VEGFR-2 shRNA vector numa concentração de 20 ug /poço. Quarenta e oito horas após a transfecção, a expressão de VEGFR-2 foi detectada por blotting e viabilidade celular ocidental foi detectada por ensaio MTT. O controlo negativo shRNA (Ctrl-shRNA) foi utilizado como um controlo negativo; * P 0,05; ** P 0,01. células de cancro (C) BEL-7404 foram infectadas com Ad5-hSulf1 a MOI de 10 pfu /mL e, em seguida, transfectadas com o VEGFR-2 shRNA vector numa concentração de 20 ug /10

5 células, em seguida, VEGFR-2 e células viabilidade foram detectados. BEL-7404 células parentais foram utilizadas para representar a quantidade máxima de crescimento de células para produzir a percentagem de viabilidade; * P 0,05; ** P . 0,01

As células cancerígenas cultivadas em placas de 96 poços foram transfectadas com os vectores contendo o VEGFR-2 e shRNA controlo negativo shRNA numa concentração de 20 ug /poço. A expressão de VEGFR-2 foi analisada por transferência de Western, e a viabilidade celular foi medida por brometo de 3- (MTT) -2,5-difeniltetrazólio (4,5-dimetiltiazol-2-il). Em comparação com o controlo negativo shRNA, o VEGFR-2 inibiu shRNA VEGFR-2 e diminuiu a viabilidade celular em certa medida (Fig. 3B). Para demonstrar se VEGFR-2 knockdown sob condições de HSulf-1 sobreexpressão tem o mesmo efeito sobre a viabilidade celular, as células cancerosas BEL-7404, que foram infectadas com Ad5-hSulf1 a uma MOI de 10 pfu /célula, foram transfectadas com o VEGFR-2 shRNA vector numa concentração de 20 ug /10

5 células para knockdown a expressão de VEGFR-2 (Fig. S1), os resultados mostraram que a viabilidade de células BEL-7404 após a transfecção de VEGFR-2 shRNA foi ainda mais reduzida na contexto da HSulf-1 efeito (Fig. 3C).

Adenovírus mediada por terapia genética HSulf-1 exibe uma eficácia antitumoral potente por antiangiogenesis em xenoenxertos cancerosas humanas em ratos pelados

a reactivação da hSulf- uma função nas células cancerosas podem inactivar o factor de crescimento de vias de sinalização a jusante, por conseguinte, HSulf-1 é um novo alvo para a terapia genética do cancro. Por este meio, nós construímos um vetor de adenovirus expressando o tipo selvagem do gene HSulf-1, Ad5-hSulf1. A sua eficácia antitumoral foi validada tanto em xenoenxertos de cancro do ovário e hepatocelulares em ratinhos nus (Fig. 4A). Após injecções intratumorais de vírus, com uma dose total de 10

9 pfu por murganho, supressão do crescimento do tumor no grupo tratado com Ad5-hSulf1 foi mais eficaz, com as taxas de inibição de tumor de 46,19% e 49,56% em SKOV3 e BEL 7404 modelos, respectivamente, em comparação com o grupo controle em branco (P 0,01). Não houve diferença entre o grupo controle negativo do vírus e do grupo de controlo em branco (P 0,05).

(A) modelos BEL-7404, 5 ratinhos por grupo, efeito de supressão de Ad5-hSulf1 no tumor SKOV3 e o crescimento foi analisado, em comparação com o grupo controle ou o adenovírus Ad5 negativa grupo-EGFP; Os pontos pretos no eixo X apresentou os pontos de tempo de injeções de adenovírus; ** P 0,01. (B) O exame patológico dos tumores de xenoenxerto SKOV3. A comparação do peso do tumor em modelos SKOV3 (painel da esquerda); Barra = 1 cm; ** P 0,01 versus os grupos Ad5-EGFP controlo ou. Por hematoxilina e eosina (HE) e exames de imuno-histoquímica, as percentagens de células positivas para HSulf-1, a densidade microvascular (MVD) contam marcado pelo anticorpo CD31, foram quantificadas dentro de 5 campos de alta potência (ampliação original × 400) sob o microscópio. Após injecções de Ad5-hSulf1, as células tumorais foram positivas para a expressão HSulf-1 no citoplasma. Por conseguinte, a contagem de MVD foi marcadamente diminuída, em comparação com a dos do grupo de controle. (C, D) O total de VEGFR-2 e fosforilada de VEGFR-2 (C), e AKT total e AKT fosforilado (D) foram identificadas por mancha (painel da esquerda) ocidental e imuno-histoquímica (painel da direita) em Ad5-hSulf1 tratada SKOV3 xenoenxerto tumores, em comparação com os grupos de Ad5-EGFP controle e.

no final do período de observação, os ratos portadores de xenoenxertos SKOV3 foram sacrificados e os tumores foram removidos e pesados. Os pesos do tumor do grupo de Ad5-hSulf1 foram menores do que a dos outros dois grupos (Fig. 4B, painel esquerdo). As secções de tumores embebidos em parafina foram examinadas imunohistoquímica. No grupo de controlo em branco, as células cancerosas foram negativos para a expressão HSulf-1. Mas no grupo de Ad5-hSulf1, células cancerosas re-proteína expressa HSulf-1. Uma análise quantitativa da densidade de microvasos (MVD) foi realizada por CD31 imuno-histoquímica. Os MVDs em tecidos tumorais foram 24,67 ± 6,51 e 52,33 ± 12,34, no grupo controle, respectivamente (Fig. 4B, painel da direita) Ad5-hSulf1 e. Houve uma diferença significativa entre os dois (P 0,05).

como o gene da HSulf-1 exerce uma grande papel na regulação de múltiplos caminhos por inibição da fosforilação de tirosina-quinases intracelulares que poderiam ser crítico na proliferação de células tumorais e angiogénese tumoral, por conseguinte, que examinaram a expressão de proteínas a jusante, incluindo VEGFR-2 e serina /treonina quinase (AKT) em tumores de xenoenxerto. Os resultados mostraram que a expressão de p-VEGFR2

Tyr1175 e AKT fosforilado em Thr308 (p-AKT

Thr308) foi regulada negativamente no grupo de Ad5-hSulf1 examinado por transferência de Western e imuno-histoquímica (Fig. 4C, D).

Discussão

a sulfatação de HSPGs da superfície celular é pensada para desempenhar um papel importante na regulação do factor de crescimento de ligação à heparina na matriz extracelular de sinalização [14], [15]. A proteína HSulf-1 é uma enzima arilsulfatase actividade que pode regular negativamente o estado de sulfatação HSPGs [16]. Fortes evidências demonstraram que HSulf-1 normalmente funções para desulfate HSPGs da superfície celular e regular negativamente a sinalização do receptor de tirosina cinase para ab-rogar eficazmente o crescimento e sobrevivência celular [4], [17]. Este processo desempenha um papel distinto na inibição de transformação maligna e o crescimento de células de cancro [18], [19]. Portanto, HSulf-1 é considerado como um gene supressor de tumor. Estudos anteriores mostraram que HSulf-1 é inativado na maioria dos cancros humanos, quer através de mecanismos genéticos, como a eliminação e mutação, ou através de mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA e histonas deacetylation [12], [20], [21]. Também demonstramos imunohistoquímica que HSulf-1 expressão foi regulada negativamente em 87 casos de espécimes clínicos, incluindo hepatocelular, mama, gástrico, renal e câncer de cólon, em comparação com os tecidos normais adjacentes. Devido às razões que HSulf-1 tem funções complicadas, e o seu mecanismo molecular, não tem sido bem conhecido, no entanto, nestes estudos testou-se a inibição HSulf-1 mediada pelo VEGFR de sinalização está associada a antiproliferação e antiangiogenesis em cancros.

Ambas as lesões primárias e tumores metastáticos deve desenvolver um novo suprimento vascular, a fim de apoiar a expansão de células cancerígenas e divulgação. A maioria das células cancerosas podem expressar tanto o ligando VEGF e VEGFR que atuam em um loop autócrino para estimular diretamente a angiogênese do tumor [22]. A angiogénese é um passo limitante da taxa no crescimento do cancro, progressão e metástase. O VEGF é um mediador importante da angiogénese, que é bem balancedly expressa na maioria dos tecidos e tipos de células, mas altamente regulados positivamente em tumores [23]. A ligação de VEGF ao seu receptor resulta na autofosforilação do receptor e a subsequente activação de uma série de quinases de tirosina, em seguida, activa a múltiplas proteínas a jusante que desempenham papéis funcionais na sobrevivência celular, a proliferação celular, a permeabilidade vascular e a estabilização de novos vasos sanguíneos [24] – [ ,,,0],26]. Portanto, a activação mediada por fosforilação de VEGFR é um processo importante para a regulação do crescimento de cancro. Porque HSulf-1 catalisa a dessulfatação de HSPGs, portanto, afecta a capacidade de ligação de factores de ligação à heparina para os seus receptores no EGFR, ERK1 /2, MEK, PI3K /AKT vias de sinalização, e deprime a fosforilação e activação da tirosina-quinases receptoras . Estas vias de sinalização foram todos envolvidos no processo angiogénico [27] – [29]. HSPGs altamente sulfatados potenciar a interacção entre VEGF e VEGFR-2, em seguida, fosforilam e activam o VEGFR-2. Neste processo, a expressão de VEGF e VEGFR-2 não pode ser afectado por sulfatação ou de dessulfatação HSPGs [30]. Verificou-se que o aumento da fosforilação de VEGFR-2 em Tyr1175 foi conhecida como sendo essencial para a activação dependente de VEGF de sinalização MAPK e angiogénese [31]. Para verificar o efeito negativo da HSulf-1 sobre a angiogênese do câncer, geramos adenovírus expressando HSulf-1. HSulf-1 expressão mediada por adenovírus, não só os níveis de downregualted fosforilada VEGFR-2, mas também inibiu a proliferação de células de cancro tanto em linhas celulares de cancro do ovário e hepatocelulares. Knockdown da HSulf-1 por expressão HSulf-1 shRNA vector melhorada a recuperação de elevados níveis de VEGFR-2 fosforilado, indicando que HSulf-1 regula a fosforilação e activação de VEGFR-2. No entanto, a inibição da proliferação de células cancerosas

In vitro

por HSulf-1 re-expressão pode ser devido principalmente ao dessulfata�o de HSPGs e desactivação do muitas vias de sinalização de factor de crescimento. No entanto, quando foi utilizado o VEGFR-2 shRNA para silenciar a expressão de VEGFR-2 em células de cancro do ovário e hepatocelulares, a viabilidade celular foi diminuída até certo ponto, o que demonstra que a sinalização de VEGFR-2 participam na regulação da proliferação de células cancerosas, e o efeito anti-proliferação da HSulf-1 em células cancerosas é em parte devido à inibição de VEGFR-2 sinalização. Quando células cancerosas BEL-7404 foram infectadas com Ad5-hSulf1 a re-express HSulf-1 e, em seguida, transfectadas com o VEGFR-2 shRNA para silenciar VEGFR-2, a viabilidade das células ainda estava diminuída, exactamente demonstrando que há um outro mecanismo envolvido VEGFR-2, activação e proliferação de células de cancro no contexto da HSulf-1 efeito.

Para avaliar o efeito da HSulf-1 no crescimento de tumor, que tratada xenoenxertos de cancro humano em ratinhos nus com adenovírus expressando HSulf-1. Os resultados revelaram que o crescimento tumoral foi inibido após o tratamento. As taxas de inibição de tumor foram 46,19% e 49,56%, em modelos de tumor de ovário e hepatocelulares, respectivamente. Re-expressão da HSulf-1 resultou numa regulação negativa da fosforilada VEGFR-2 e AKT fosforilado, em seguida, significativamente reduzida densidade de microvasos de tumor, indicando que HSulf-1 expressão foi associada com antiangiogenesis.

Em conclusão, HSulf-1 é um sulfatase que funciona para desulfate HSPGs da superfície celular. Pode inibir a fosforilação da cinase a jusante, com um espectro largo e regular negativamente a sinalização do receptor de tirosina quinase. Este estudo deu uma evidência convincente de demonstrar que HSulf-1 re-expressão tanto em células de cancro do ovário e hepatocelulares atenua a fosforilação de VEGFR-2, em seguida, suprime a proliferação de células cancerosas e angiogénese, finalmente induz a eficácia antitumoral. Portanto, nossos dados sugerem que anti-proliferação HSulf-1-mediada e antiangiogenesis poderia ser uma abordagem razoável para a terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Exames de HSulf-1 e VEGFR-2 expressão em clínica amostras de cancro

a expressão de HSulf-1 foi detectada por imuno-histoquímica em 87 casos de espécimes clínicos cancro, incluindo 26 carcinomas hepatocelular, 12 cânceres de mama, 22 cânceres gástricos, 9 cânceres renais, 18 cancros do cólon, e seu normal adjacente tecidos. VEGFR-2, incluindo t-VEGFR2 e p-VEGFR2

Tyr1175, também foi detectada em 26 carcinoma hepatocelular por imuno-histoquímica. Os espécimes foram fixados em formol a 10% neutra durante 6 h, parafina-embedded, e cortado em 5 seções mm de espessura para imuno-histoquímica com um-HSulf-1 anti anticorpo de coelho (Abcam inc., Cambridge, MA), um anti-coelho O VEGFR-2 e um anticorpo

anticorpo Tyr1175-fosfo-VEGFR2 anti-coelho (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). Aprovação para o uso de espécimes clínicos foi dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa, A Segunda Universidade Médica Militar, e que tenhamos obtido o consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos no estudo.

Preparação de vetores e adenovírus

o plasmídeo pcDNA3.1-hSulf1 contendo a todo o comprimento HSulf-1 cDNA e o vector contendo o pSUPER.retro.puro HSulf-1 shRNA (19 pares de oligonucleótidos dirigidas ADNc HSulf-1 posiciona 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) foram gentilmente oferecida a partir Viji Shridhar (Departamento de Patologia Experimental, Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, MN). O vector pGenesil-1.1 que contém o VEGFR-2 shRNA (19 pares de oligonucleotídeos segmentação cDNA VEGFR-2 posições 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) ou o controlo negativo shRNA (19 pares de oligonucleotídeos: gacttcataaggcgcatgc) foram adquiridos de Wuhan Genesil Biotecnologia Co., Ltd. (Wuhan, China).

para recombinar o vector de adenovírus, pcDNA3.1-hSulf1 foi usado para amplificar o cDNA HSulf-1 com os iniciadores P1 (5′-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 ‘) e P2 (5’ gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 ‘). O produto de PCR foi digerido com BamHI e Sall, em seguida, inserido no plasmídeo pDC315 adenovírus (Microbix Biosystems, Ontário, Canadá) para gerar pDC315-hSulf1. Os plasmídeos pDC315-hSulf1 e pDC315-EGFP foram transfectadas, respectivamente, em células HEK293 (Microbix Biosystems, Ontário, Canadá) usando o Reagente de Transfecção Polyfect (QIAGEN Inc., Valencia, CA) juntamente com o plasmídeo de empacotamento de adenovirus pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canadá). Depois de uma recombinação homóloga em células HEK293, obteve-se os adenovírus denominados Ad5-hSulf1 e Ad5-EGFP. Ad5-EGFP foi utilizado como controlo do vírus. Todos os adenovirus foram amplificados em células HEK293 e purificou-se por ultra-centrifugação em gradientes de cloreto de césio (CsCl). Os títulos virais foram detectados com o Tissue Culture Infectious Dose 50 método (TCID50) [32], estabelecido pelo Qbigene Inc. (IIIkich, França), e mostrou como unidades formadoras de praga por mililitro (ufp /ml).

cultura de células e transfectantes

a linha de células de cancro do ovário SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), o hepatocelular linha de células de carcinoma BEL-7404 (Instituto de Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China ) foram cultivados em meio de acordo com as recomendações dos fornecedores. Quando as células estavam em fase logarítmica, que foram infectadas com adenovirus (Ad5-hSulf1 ou Ad5-EGFP) a MOI de 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 ufp /célula, e colhidas 48 h após a infecção. As células infectadas com vírus e as suas células paternas foram transfectadas com HSulf-1 shRNA e VEGFR-2 shRNA vectores que utilizam o Polyfect Transfection Reagent (Qiagen Inc., Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fornecedor. Vinte e quatro horas mais tarde, a puromicina (3 pg /ml), ou G418 (400 ug /ml) foi adicionado para seleccionar transfectantes HSulf-1 shRNA ou VEGFR-2 transfectantes shRNA, respectivamente. Após continuamente cultivadas durante 24 h, as células foram colhidas e o silêncio da expressão do gene alvo foi testado.

In vitro

exame da expressão do fator correlato

As células cancerosas, incluindo as células progenitoras, e shRNA transfectadas infectados por vírus, foram colhidas 48 h após a infecção ou transfecção. O ARN total foi extraído a partir de 10

5 células com o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e utilizados para amplificar um HSulf-expressão por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR), com os iniciadores P3 (5′-ccaccttcatcaatgcctt -3 ‘) e P4 (5′-ccttgaccagtccaaactgc-3′). Os fragmentos amplificados foram 762 pb. gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foi amplificado com os iniciadores P5 (5’-accacagtccatgccatcac-3 ‘) e P6 (5′-tccaccaccctgttgcttgta-3’) como um controlo interno. A proteína total foi extraída de 10

5 células de M-PER de mamíferos Proteína Reagente de Extracção (Pierce, Rockford, IL) e investigadas por transferência de Western como previamente descrito [33], com os anticorpos primários indicados, incluindo o coelho anti-VEGFR -2 e coelho anti-Phospho-VEGFR-2

Tyr1175 (Cell Signaling Tecnologia, Inc., Danvers, MA).

A viabilidade celular por MTT ensaio

O parental, a vírus células transfectadas infectadas e shRNA foram diluídos a uma concentração de 10

5 células /ml, e plaquearam-se a uma densidade de 100 uL /​​poço em placas de 96 poços. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT usando Proliferação celular Kit I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), como descrito anteriormente [34]. absorvência média para cada amostra foi analisada com um leitor de microplacas (modelo 550, Bio-Rad Laboratories, Tóquio, Japão) a um comprimento de onda de 570 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm.

modelos animais e

in vivo

experimentos

células

SKOV3 e BEL-7404 foram injectados subcutaneamente nos flancos direito de camundongos BALB /c (nu /nu) (Shanghai Centro Experimental animal, da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China) , 10

7 células por rato, para estabelecer xenotransplantes. Três semanas mais tarde, os ratinhos foram separados aleatoriamente em 3 grupos: Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP e os grupos de controlo, cinco ratinhos por grupo. Os ratinhos nos grupos de Ad5-hSulf1 e Ad5-EGFP foram dadas 5 injecções intratumorais, uma injecção a cada dois dias, com uma dose total de 10

9 pfu de vírus por ratinho. Os ratinhos no grupo de controlo receberam o mesmo volume de solução de preservação viral (10 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 2 mmol /L de MgCl

2, 4% de sacarose). O tamanho do tumor foi medido regularmente, e o volume do tumor foi estimado com a fórmula “

a

×

b

2 × 0.5″, em que

a

e

b

representam a diâmetros máximo e mínimo. Os ratinhos foram sacrificados no final do período de observação, e os tumores foram removidos, pesados ​​e fixados em formol neutro a 10% durante 6 h. As secções consecutivas embebidas em parafina foram cortados para examinar a expressão de HSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2

Tyr1175 e t-AKT, p-AKT

Thr308 por imuno-histoquímica e Western blotting. O anticorpo de coelho anti-fosfo-AKT

Thr308 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). O valor MVD em tecidos de tumor foi realizada por imunohistoquímica usando um CD31 de rato anti-CD31 anticorpo monoclonal (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). As percentagens de células positivas e valor MVD em tumores foram contados em 5 campos aleatórios de alta potência (ampliação original x 400), sob microscópio, e apresentados como média ± desvio padrão (SD) [35].