Abstract
Src e o alvo da rapamicina em mamíferos sinalização (mTOR) são comumente activado em câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC) e, portanto, potenciais alvos de quimioterapia. Embora a utilização combinada do inibidor de Src dasatinib com outros agentes quimioterapêuticos demonstrou uma eficácia superior para o tratamento do cancro, os mecanismos que levam ao aumento da sensibilidade do dasatinib não são completamente compreendidos. Neste estudo, verificou-se que a rapamicina melhorado dramaticamente o crescimento celular e inibição do ciclo celular G1 prisão induzida por Dasatinib em células de adenocarcinoma de pulmão A549 humana sem afetar a apoptose. Os efeitos sinérgicos foram consistentemente correlacionada com a sobre-regulação de quinases dependentes de ciclina, incluindo inibidor proteínas p16, p19, p21, e p27, bem como a repressão da expressão CDK4 e a translocação nuclear. mecanicistas investigações demonstraram que FOXO1 /FOXO3a e p70S6K /4E-BP1, as moléculas a jusante de PI3K-Src-Akt e sinalização mTOR, foram significativamente suprimida pelo uso combinado de dasatinib e rapamicina. Restringindo Src e mTOR com pequena interferência RNA em células A549 ainda confirmou que a Src /PI3K /mTOR desempenhou um papel crucial no reforço do efeito anticancerígeno do dasatinib. Além disso, este resultado também foi validado por uma série de ensaios utilizando outras duas linhas celulares de NSCLC NCI-H1706, NCI-H460 e. Conclusivamente, os nossos resultados sugerem que a aplicação de inibidores de Src combinatória e mTOR pode ser uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento de NSCLC
citação:. Chen B, Xu X, Luo J, Wang H, S Zhou (2015) rapamicina melhora o Anti-Cancer Efeito de dasatinib suprimindo Src /PI3K /mTOR via em células NSCLC. PLoS ONE 10 (6): e0129663. doi: 10.1371 /journal.pone.0129663
Editor do Academic: Shi-Yong Sun, da Universidade Emory, Estados Unidos
Recebido: 27 de fevereiro de 2015; Aceito: 11 de maio de 2015; Publicação: 10 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Shanghai Municipal Natural Science Foundation (Grant N0.13ZR1434700) e National Natural Science Foundation da China (Grant N0.81301994). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é o principal subtipo patológica de cancro do pulmão, que é a causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo [1]. Entre os pacientes com NSCLC, as cinases da família Src (SFKs) são sobre-expresso constitutivamente activado ou [2,3]. Como um potencial alvo terapêutico para a NSCLC, Src pode jogar um papel importante na progressão de adenocarcinomas do pulmão através de regulação sinais de múltiplas moléculas de superfície celular, incluindo integrina, factores de crescimento, e receptores acoplados à proteína G [4,5]. estudos pré-clínicos demonstraram que a inibição SFKs pode suprimir a proliferação, angiogénese, invasão e sobrevivência de células cancerosas [6-9]. À medida que o inibidor específico de Src, dasatinib tem sido aprovado para o tratamento de leucemia mielóide crónica (LMC), e que está agora a ser avaliados para o uso clínico de cancro do pulmão [10,11]. No entanto, como monoterapia dasatinib exibiram actividade clínica modesta, que era menor do que se observa geralmente em pacientes que receberam quimioterapia NSCLC [11]. Em contraste, a combinação de dasatinib com quimioterapia citotóxica apareceu mais promissora do que a utilização como um agente único. Desde Src pode mediar resistência dos tumores à quimioterapia citotóxica, por inibição de Src dasatinib tem sido demonstrada para estimular a resposta de células do cólon e cancro do pulmão ao cisplatino in vitro [12,13]. Além disso, um estudo clínico recente de dasatinib em combinação com erlotinib alcançado reforçada efeito benéfico do tratamento em doentes com NSCLC previamente tratado [14]. Além disso, dasatinibe também poderá facilitar os efeitos anticancerígenos da radioterapia [15]. Embora a eficácia superior sugeriu fortemente que a combinação com Dasatinib é de importância crítica para terapias NSCLC, os mecanismos que levam a uma maior sensibilidade dos quimioterapias ainda são complexos e não totalmente compreendido. Dado que Src modula transduções de sinal que regulam a proliferação, invasão, apoptose,
etc
. das células cancerosas, estudos decifrar a regulação da activação Src e sua interação com outras moléculas sinalizadoras na terapia do câncer são particularmente garantido.
Além Src, o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) também é altamente ativada no câncer de pulmão muitos pacientes e representa como outro alvo para a terapia. A via de sinalização da mTOR impulsiona muitos processos celulares importantes e está implicada num número crescente de estados patológicos, incluindo o cancro [16]. Recentemente, dados clínicos preliminares indicaram uma certa actividade anti-tumoral do inibidor de mTOR Rapamicina e seus análogos, em alguns cancros, incluindo NSCLC [17,18]. Notavelmente, rapamicina também está sendo explorada por sua capacidade de restaurar a sensibilidade das células cancerosas para montante sinalização agentes direcionados [19]. Akt inibição /mTOR por rapamicina ou seus derivados têm aparecido para aumentar sinergisticamente a citotoxicidade de radiação e agentes quimioterapêuticos, promover a indução de paragem do ciclo celular e apoptose [20,21]. Por outro lado, foi demonstrado que mTOR poderia ser activado por Src sinalização através de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt [22-24]. Isto levou à hipótese de que a combinação de rapamicina com inibidores de Src, tais como dasatinib, poderá facilitar a actividade anti-cancro e ser mais eficaz na quimioterapia. Um estudo recente demonstrou que a inibição dupla de Src e mTOR foi altamente eficaz na regressão do tumor em modelos de ratos com câncer de mama [25]. No entanto, não há dados pré-clínicos estão disponíveis no momento, com a sua utilização combinatória para o tratamento de cancro do pulmão. Além disso, o efeito potencial de mTOR na regulação da sinalização Src permanece em grande parte obscura.
Aqui, nosso objetivo é investigar o efeito terapêutico combinatória da rapamicina e Dasatinib em câncer de pulmão usando células de adenocarcinoma de pulmão humano (A549), células pulmonares escamosas de carcinoma (NCI-H1703) e de grandes células células do cancro do pulmão (NCI-H460) como modelos celulares in vitro. Neste estudo, a inibição do crescimento celular induzida por dasatinib e de paragem do ciclo celular foram dramaticamente aumentada por co-tratamento com rapamicina, em paralelo com o então sobre-regulação das quinases dependentes de ciclina (CDKs) inibidores de proteínas. Análise sobre as moléculas de sinalização mostrou que a desactivação Src foi eficientemente facilitado pela inibição da mTOR via PI3K-Akt. Usando pequenos RNAs interferentes contra Src e mTOR, observou-se a repressão semelhantes às dos inibidores sobre a proliferação celular, a progressão do ciclo celular, invasão, migração e em células A549. Além disso, nossos resultados revelaram a interacção sinérgica entre Src e mTOR sinalizações em células NSCLC, que sugeriu o benefício terapêutico promissor de mTOR /Src dupla inibição para o tratamento NSCLC.
Materiais e Métodos
Reagentes e anticorpos
O dasatinibe e rapamicina foram adquiridos de Selleck química (Xangai, China). Os anticorpos primários contra a fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-mTOR (Ser2448), mTOR, fosfo-PI3K (Tyr458), p85 de PI3K, fosfo-Akt (Thr308), Akt, fosfo-FOXO1 (Ser256), fosfo-FOXO3a (Ser253), fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46), 4E-BP1, Cdk2, Cdk4, Cdk6, e anticorpo conjugado Alexa Fluor 555 foram obtidos a partir celular Tecnologias de sinal (Xangai, China). Os anticorpos primários contra proteínas inibidoras de CDK, incluindo p16, p19, p21, p27, e β-tubulina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Xangai, China). Os anticorpos contra fosfo-p70S6K (Thr389 /412), p70S6K, foram adquiridos a partir de ORS Signalway (College Park, MD, EUA). reagentes O HRP secundário ou FITC anticorpos conjugados, si-mTOR, si-Src e transfecção foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Xangai, China).
Cultura celular e tratamento
A humano A549 adenocarcinoma linha celular, escamosas linha de células de carcinoma de pulmão humano NCI-H1703, pulmão linha celular de cancro de células grandes humanas NCI-H460 e células epiteliais brônquicas normais BEAS-2B foram adquiridas a partir da ATCC (Pequim, China), e cultivadas em Dulbecco modificado meio de eagle (Life Technology, Xangai, China) suplementado com soro de bovino fetal a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO
2. O número de células e a viabilidade foram determinados pela exclusão de azul de tripano, com pelo menos 90% de células viáveis antes da exposição ao tratamento. As células A549 foram tratados com dasatinib (5, 10, 25, ou 50 nM) sozinho ou em combinação com rapamicina (20, 50, ou 100 nM) durante 24 a 96 horas. As células tratadas com 0,1% de dimetilsulf óxido (DMSO) foram usados como controlo de veículo.
Ensaios
proliferação de células e ciclo celular
Para o ensaio de proliferação de células, 10
4 células por cavidade foram semeadas em 24 Bem placas e incubou-se durante 24 h. As células foram tratadas com 5, 10, 15, ou 20 nM de dasatinib na presença ou ausência de rapamicina (20, 50, ou 100 nM), e colhidas às 24, 48, 72, e 96 h. Tripano ensaios de exclusão de azul foram realizadas para determinar o número de células utilizando um Auto Cellometer T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EUA).
Para o ensaio do ciclo celular, as células em placas de 6 poços foram recolhidas, lavadas e fixas durante a noite em etanol frio a 75% a -20 ° C. Em seguida, as células foram tratadas com tampão Tris-HCl (pH 7,4) com 100 ug /ml de ARNase A e coradas com iodeto de 25 ug /mL de propídio (PI) (Life Technology, Xangai, China). Dez mil células foram adquiridos e analisados por citometria de fluxo (BD FACSCalibur, CA, EUA) com base no conteúdo de ADN.
Ensaio de Apoptose
1 × 10
6 as células foram tratadas com DMSO ( 0,1%), dasatinib (10 nM) sozinho ou em combinação com rapamicina (100 nM) durante 96 h. a taxa de apoptose celular foi determinada por anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. intensidades de fluorescência de todas as sondas foram determinados por citometria de fluxo (BD FACSCalibur, CA, EUA).
-PCR quantitativo em tempo real
O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol e tratada com DNase de acordo com a instruções dos fabricantes. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando M-MLV de transcriptase inversa e oligo-dT (Invitrogen, Xangai, China). Os ensaios de PCR quantitativa em tempo real foram realizados em placas de 96 poços ópticos sobre uma Prism 7000 Sistema de Detecção de Sequência ABI (Lifetechnology, Xangai, China) com SYBR Verde Mistura Mestre qPCR (Qiagen, Xangai, China). Expressão de P16, P19, P21, P27, ciclina A /D1 /E e mRNA Cdc25A foi normalizado contra a de RNA 18s. As sequências dos iniciadores para ensaios de PCR em tempo real foram listadas na Tabela S1.
Western blot
proteínas homogeneizado (20 ug) de cada células tratadas foram resolvidos em géis de SDS-poliacrilamida e transferidas electroforeticamente para polyvinylidenedifluoride membranas Immobilon-P. Posteriormente, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos contra proteínas inibidoras da CDK (p16, p19, p21 e p27), cdk2 /4/6, proteínas forkhead box (FoxO1 e FOXO3a), a Src fosforilada ou total, PI3K, Akt, mTOR, p70S6K e 4E-BP1, respectivamente. Beta-tubulina foi utilizada para normalização da carga de proteína. Após incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo IgG, as membranas foram desenvolvidas utilizando transferência de Western ECL reagente de detecção (Thermo, Pequim, China). As densidades ópticas das bandas foram realizadas utilizando Quantidade Um programa de software (Bio-Rad, Beijing, China).
imunofluorescência celular coloração
Depois semeadas em 12 poços da placa durante 24 h, as células A549 foram tratadas com DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) sozinho ou em combinação com rapamicina (100 nM) durante 48 h. As células foram lavadas e fixadas com 0,4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com anticorpos primários contra Src ou fosforilada Cdk4 durante a noite a 4 ° C. Após lavagem, as células foram incubadas com FITC ou 555 anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor. Posteriormente, o núcleo das células foram coradas com PI e, em seguida, observada utilizando o sistema de imagem múltipla Cytation 3 (BioTek, VT, EUA).
pequeno ARN interferente (siRNA) transfecção
As células A549 foram semeadas numa placa de cultura de tecidos de seis bem por 2 x 10
5 células por poço em 2 ml de antibiótico livre de meio e incubadas, durante 24 h. De acordo com as instruções do fabricante, as células foram incubadas com o meio de transfecção contendo Si-Src, Si-mTOR, ou ARNsi de controlo durante 8 h. Em seguida, o meio de transfecção foi substituído por meio completo fresco normal, seguido de uma incubação adicional durante 24 a 72 h. Subsequentemente, as células foram recolhidas para ensaios sobre a proliferação celular, ciclo celular e Western blotting, respectivamente.
invasão celular ensaio
ensaio de invasão celular foi realizada utilizando câmaras de trans-poços (Matrigel da membrana revestida para a invasão, BD Biosciences, Xangai, China). Um total de 5 × 10
5 as células foram plaqueadas na câmara superior com meio isento de soro e tratadas com 0,1% de DMSO, dasatinib (10 nM) sozinho ou em combinação com rapamicina (100 nM). Em seguida, as células foram deixadas a invadir para 10% de FBS como um quimioatractivo na câmara inferior, durante 24 h. As células na câmara superior foram cuidadosamente removido usando cotonete de algodão, e as células sobre a membrana de fundo foram fixadas e coradas com vermelho rápido nuclear. Os números de células invadidas foram contadas sob microscópio e a invasão por cento foi calculada por células invasoras através da matriz e membrana de Matrigel em relação à invasão de células no grupo de controlo.
cicatrização de feridas ensaio
As células foram semeadas em placas de 24 poços de cultura de tecidos, e atingiram 70-80% de confluência como uma monocamada após 24 h de crescimento. A monocamada foi cuidadosamente e lentamente riscada com uma nova ponta de pipeta de 1 ml através do centro do poço. Então assim foi lavar duas vezes com meio para remover as células isoladas. Depois de reabastecer o poço com meio fresco, as células foram tratadas e cultivadas durante mais 18 h. As células em monocamada foram fotografados em um microscópio de contraste de fase invertida.
A análise estatística
Todos os dados representam pelo menos três experiências independentes e são expressos como a média ± desvio padrão (SD) comparações estatísticas foram realizadas usando um pacote de software estatístico SPSS 16.0 e analisados com um modo de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Dunnett de um post-hoc, quando adequado. A significância estatística foi fixado em valores de p 0,05 (*), ou 0,01 (**).
Resultados
A rapamicina aumentou o efeito inibidor da dasatinib na proliferação celular e na progressão do ciclo celular em células A549
Como se mostra na figura 1A, em dasatinib níveis farmacologicamente relevantes diminuiu marcadamente o número de células de células A549 de forma dependente da concentração. Notavelmente, o co-tratamento com rapamicina (50 e 100 nM) a inibição do crescimento mediada por dasatinib significativamente melhorada em células A549, em que 10 nM de dasatinib, mais 100 nM de Rapamicina poderia alcançar magnitudes iguais de actividade anti-cancro de dasatinib sozinho na concentração de 50 nm. Resultados sobre os efeitos do dasatinib com rapamicina indicaram que a proliferação celular A549 foi significativamente inibida pelo dasatinib (10 nM) a 96 h de tratamento (Fig 1B). Importantemente, o co-tratamento com rapamicina (100 nM) diminuiu ainda mais o número de células em tão cedo quanto 48 h, sugerindo que a eficácia sinérgica marcado para o tratamento de dasatinib si. No entanto, a rapamicina sozinha mostrou supressão menor sobre a curva de crescimento das células cancerosas.
(A) O efeito dependente da concentração de rapamicina na actividade anti-cancro de dasatinib em células A549. Conforme detalhado na secção “
Métodos
“, as células A549 foram tratadas com controlo de veículo (0,1% DMSO) ou dasatinib (5, 10, 25, e 50 nM) na presença e ausência de rapamicina (20, 50 , e 100 nM). os números de células viáveis foram analisados às 72 h após a co-tratamento. (B) Efeitos da rapamicina sobre as alterações temporais de inibição do crescimento induzida pelo dasatinib em células A549. As células foram tratadas com o controlo de veículo (0,1% DMSO), dasatinib (10 nM) com ou sem rapamicina (100 nM). Os números de células foram medidos em 0, 24, 48, 72 e 96 horas após o tratamento. (C) Efeitos de dasatinib e rapamicina sobre a distribuição do ciclo celular. As células A549 foram tratados com dasatinib (10 nM) ou rapamicina (100 nM) durante 96 h, e analisadas por citometria de fluxo, após coloração com PI. Os resultados são expressos como a percentagem média de células em G0 /G1, S e G2 /M, fase a partir de três experiências independentes. (D) Efeito de dasatinib e rapamicina sobre a apoptose em células A549. As células foram tratadas com dasatinib (10 nM) ou rapamicina (100 nM) durante 96 h, e as taxas de apoptóticas foram determinados por citometria de fluxo com Anexina-V e coloração de PI. Colunas, com média de três determinações; Barras, DP. * P 0,05, ** p 0,01.
Estudos anteriores demonstraram que tanto Src e mTOR são muitas vezes constitutivamente ativados nas células de leucemia mielóide aguda (AML) e, portanto, constituem potenciais alvos terapêuticos. Por exemplo, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) erlotinib inibidor poderia induzir a paragem do ciclo celular na fase G1 pela inibição da sinalização oncogénica via mTOR e Src [26]. Em acordo, os resultados do ensaio do ciclo celular em células A549 mostrou que o dasatinib (10 nM) aumentou significativamente a percentagem de células em fase G1, em comparação com o grupo de controlo (Figura 1C), o que sugere a prisão directa da progressão do ciclo celular por inibição de Src em células cancerosas. Em contraste, a rapamicina (100 nM) sozinha exibiram pouco efeito sobre a distribuição de células em várias fases do ciclo celular. No entanto, a presença de rapamicina na co-tratamento com dasatinib marcadamente aumentou a percentagem de células em fase G1, resultando em obstrução significativa da transição G1 /S e a mitose celular. O resultado foi consistente com a inibição do crescimento celular synergized pelo dasatinib e rapamicina em combinação. Entretanto, observou-se o impacto do dasatinib e de rapamicina sobre a apoptose celular foi também avaliada em células A549, mas nenhuma diferença significativa da taxa de apoptose das células entre os tratamentos com controlo, dasatinib ou a rapamicina (Figura 1D), o que sugere que a rapamicina e dasatinib teve efeito menor sobre a apoptose em células A549.
a rapamicina potenciada dasatinib para regular proteínas inibidoras de CDK e regular negativamente Cdk4
paragem do ciclo celular G1 é controlado por vários factores, incluindo as ciclinas, proteína de ciclo de divisão celular ( CDC), CDK e proteínas inibidoras de CDK. Nosso estudo preliminar demonstrou que as expressões de ciclina A /D1 /E e Cdc25A não foram significativamente alteradas pelo dasatinib e rapamicina em mRNA e os níveis de proteína (S1 FIG). Quanto aos inibidores de CDK, dasatinib aumentou a expressão da p16, p19 e p21 em ambos os níveis de mRNA (Fig 2A) e proteína (Fig 2B), com diferença estatística entre os grupos de controle. Curiosamente, o co-tratamento com rapamicina acentuadamente promovida dasatinib induzida por sobre-regulação de p16, p19, p21, e p27, mas rapamicina sozinha pareceu ter pouco impacto sobre a expressão destas proteínas inibidoras de CDK. Como consequência, a expressão de Cdk4 foi drasticamente suprimido pela combinação de rapamicina e dasatinib, mas nenhum nem Cdk2 Cdk6 parecia claramente responsivo aos tratamentos (Fig 2B).
células A549 foram tratadas com controlo de veículo (0,1 % de DMSO) ou dasatinib (10 nM) na presença e ausência de rapamicina (100 nM) durante 24 h. (A) A expressão relativa de proteínas inibidoras de CDK (p16, p19, p21 e p27) a nível mRNA. Colunas, com média de três determinações; Barras, DP. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Expressão de proteínas CDK, inibidores de CDK e Foxos determinado por western blotting. (D) A localização de Cdk4 determinado por coloração por imunofluorescência. imagens representativas de coloração indicada de Cdk4 (vermelho), núcleo (azul), e as imagens fundidas.
Para confirmar ainda mais os efeitos do dasatinib e rapamicina em proteínas inibidoras da CDK, a expressão e distribuição de Cdk4 em As células A549 foram ainda analisadas por coloração por imunofluorescência. Normalmente, Cdk4 liga-se a ciclina D para formar um complexo no citoplasma, em seguida, se acumula sobre a membrana nuclear e translocar para o núcleo quando as células progridem através de fase G1 /S. O nosso resultado mostrou que Cdk4 predominantemente localizada no núcleo em células A549; no entanto, eles foram parcialmente sequestrado no citoplasma sob a tratamento com dasatinib (Fig 2C). Além disso, a translocação para o núcleo de Cdk4 foi significativamente bloqueada por tratamento com dasatinib e rapamicina em combinação. Tomados em conjunto, estes resultados consistentemente sugerido que a inibição da progressão do ciclo celular e pelo dasatinib rapamicina foi mediada através da sobre-regulação de CDK proteínas inibidoras, bem como a regulação negativa de Cdk4 em células A549.
Os anteriores relatórios demonstraram que a p19, p21 e p27 foram transcricionalmente regulados por Foxos, que foi mais tarde provam como alvos a jusante de PI3K /AKT [25,27]. Foi recentemente relatado que a p16 pode também ser regulada por via de Src-AKT em senescência celular em células de cancro da próstata humanos [28]. Neste estudo, o resultado indicou que os níveis de fosforilação de FOXO1 e FOXO3a também foram marcadamente aumentada por co-tratamento quando comparada com a induzida por qualquer Src ou inibidor de mTOR sozinho (Fig 2B). Além disso, o resultado foi, em paralelo com a expressão de inibidores de CDK. Portanto, especulamos que a sobre-regulação de inibidores de CDK por dasatinib e rapamicina foi provavelmente atribuído ao Src e PI3K /AKT.
A rapamicina em sinergia com dasatinib na supressão de PI3K-Akt-mTOR sinalização em células A549
o estudo mais recente demonstrou que a fosforilação de Src podem facilitar a activação de Akt-mTOR via de sinalização em células AML [29]. Para investigar o potencial interacção entre Src e mTOR vias, analisamos a ativação de Src, PI3K, AKT e mTOR em sequência. Em primeiro lugar, a coloração por imunofluorescência de fosfo-Src indicaram que a activação de Src foi inibida pelo dasatinib e mais significativamente reprimido por o co-tratamento com rapamicina (Figura 3A), sugerindo que a inibição de mTOR por rapamicina pode sinergizar com dasatinib na supressão da activação de Src em células A549 . E este resultado foi ainda confirmada por transferência Western (Fig 3B). Além disso, os nossos dados demonstram que a inibição de Src pelo dasatinib também poderia suprimir a activação da sinalização de PI3K-Akt em células A549, o que estava de acordo com relatórios anteriores [29]. Mais importante ainda, as inibições de Src, PI3K, AKT e foram reforçados por unanimidade na presença de rapamicina em comparação com dasatinib sozinho, como se mostra na figura 3B e 3C. Foi interessante notar que o resultado foi bem correlacionada com as observações sobre expressão do inibidor de CDK e proteínas forkhead box (Fig 2B), que concordaram com a nossa especulação sobre a conexão entre a paragem do ciclo celular e desativação-Src-PI3K AKT. Por outro lado, a imunomarcação de Western blotting e os resultados indicaram que a activação de Src foi inibida por rapamicina, a um menor grau do que dasatinib. Estes dados sugeriam que mTOR que foi convencionalmente reconhecido como o alvo responsiva de PI3K /AKT, também pode desempenhar um papel importante na regulação da activação de Src.
células A549 foram tratadas com controlo de veículo (0,1% DMSO) , dasatinib (10 nM) com ou sem rapamicina (100 nM) durante 24 h. proteínas de homogenato (20 ug) a partir de todo o lisado celular foi recolhido e utilizado para transferência de Western. (A) Activação de Src determinado por coloração por imunofluorescência. imagens representativas indicaram coloração da Src (vermelho), núcleo (azul), e as imagens fundidas. (B) A activação de Src, PI3K, AKT e determinado por western blotting. (C) quantificação Densitometria de Src, PI3K e fosforilação de Akt em células A549. (D) A activação da sinalização de mTOR determinado por western blotting. (E) Densitometria quantificação de mTOR, p70S6K e fosforilação 4E-BP1 em células A549. Os dados apresentados índices médios de fosforilação em relação ao controlo não tratado a partir de três experiências independentes. Colunas, com média de três determinações; Barras, DP. * P 0,05, ** p 0,01.
Subsequentemente, a activação de mTOR foi determinada utilizando transferência de Western dos níveis fosforiladas de mTOR. Como esperado, a activação de mTOR foi significativamente inibida pelo inibidor da rapamicina. Embora Dasatinib exibiu efeito moderado na repressão activação mTOR, a combinação com rapamicina extremamente avançado a inibição induzida pela Dasatinib sozinho (Fig 3D e 3E). Além disso, a fosforilação da p70S6K e 4E-BP1, os alvos conhecidos na jusante de mTOR, ambos foram significativamente suprimida por rapamicina e que também foram adicionalmente diminuída pela combinação com dasatinib. Em conjunto, esses resultados sugerem que a rapamicina em sinergia com Dasatinib na repressão da PI3K-Akt-mTOR via de sinalização em células A549.
repressão dupla de mTOR e Src por siRNAs induzidas paragem do ciclo celular e inibição do crescimento das células A549
Para validar a potencial interacção entre Src e sinalização mTOR, investigou ainda a alteração dos níveis de fosforilação de PI3K /AKT, e os níveis de expressão de CDK proteínas inibidoras em células A549 com o artificial knock-down de Src ou mTOR . Como mostrado na Fig 4A, a expressão de restrição de Src ou mTOR por ARNsi reprimida significativamente os níveis de fosforilação de PI3K /AKT e p70S6K /4E-BP1, respectivamente. Por outro lado, os níveis das proteínas inibidoras de CDK, incluindo p16, p19, p21, p27 e expressão, foram todos aparentemente elevada pelo Si-Si ou mTOR-Src (Fig 4B). No acordo, a expressão de FoxO1 também foi aumentada enquanto Cdk4 diminuiu significativamente. Mais importante ainda, a dupla knock-down de mTOR e Src promoveu significativamente a inibição da via PI3K /AKT, p70S6K /4E-BP1, e resultou na sobre-regulação de CDK proteínas inibidoras, quando em comparação com qualquer um de Si-mTOR ou Si-Src sozinho. Os resultados foram consistentes com os nossos achados em células A549 tratadas com rapamicina e Dasatinib.
(A) Os níveis de ativação de PI3K, AKT e mTOR determinados por western blot. As células A549 foram transfectadas com Si-Src, Si-mTOR, ou ARNsi de controlo, durante 8 horas, seguido de uma incubação prolongada de 24 h. proteínas de homogenato (20 ug) a partir de todo o lisado celular foi recolhido e utilizado para transferência de Western. (B) A expressão de proteínas inibidoras de CDK (p16, p19, p21, e p27), FOXO1, e Cdk4 determinado por western blotting. (C) Efeitos do si-mTOR e si-Src na progressão do ciclo celular. As células A549 foram transfectadas com Si-Src, Si-mTOR, ou ARNsi de controlo, durante 8 horas, seguido de uma incubação prolongada de 24 h. Em seguida, as células foram recolhidas e analisadas por citometria de fluxo com coloração de PI. Os resultados são expressos como a percentagem média de células em G0 /G1, S e G2 /M, fase a partir de três experiências independentes. Os resultados foram expressos como a percentagem média de células em G0 /G1, S e G2 /M, fase a partir de três experiências independentes. (d) efeitos do si-mTOR e si-Src sobre as alterações temporais da proliferação celular. ells A549 foram transfectadas com Si-Src, Si-mTOR, ou ARNsi de controlo, durante 8 horas, e, em seguida, incubadas com meio normal durante 72 h. Os números de células foram medidos aos 0, 24, 48, e 72 h após a transfecção. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,01.
Além disso, o knock-down de mTOR e Src resultou em paragem do ciclo celular semelhante à induzida pelos inibidores específicos de rapamicina e dasatinib. Como mostrado na Fig 4C, a dupla inibição de mTOR e Src por ARNsi induzidas supressão mais significativa da progressão do ciclo celular na fase G1 em células A549 em comparação com quer Si-Si ou mTOR-Src sozinho. Além disso, a proliferação celular também foi afectada de maneira comparável com aquela induzida pelos inibidores químicos (Fig 4D). Foi notável que só si-mTOR também induziu prisão G1 moderada e inibição do crescimento das células A549, possivelmente devido à sua maior eficácia em deprimente mTOR do que a imposta por rapamicina. Colectivamente, si-mTOR aumentou significativamente a inibição paragem do ciclo celular e crescimento que induzida por si-Src em células A549, que apoiou a nossa conclusão sobre o efeito quimioterápico reforçada do dasatinib em combinação com rapamicina.
A rapamicina aumentou a inibição efeito de dasatinib na invasão celular e migração em células A549
Para confirmar ainda mais o efeito de aumento da rapamicina sobre a actividade anti-cancro de dasatinib, examinámos a invasão e a migração de células A549 sob vários tratamentos. Como mostrado na Fig 5A, a capacidade invasiva através de filtros de Matrigel-revestidas de células tratadas pelo dasatinib foi significativamente diminuída em comparação com as células de controlo. O co-tratamento de dasatinib com rapamicina diminuiu ainda mais a percentagem de invasão de células A549 de cerca de 50%, ao passo que A rapamicina por si só não exibem supressão clara na invasão de células, quando comparado com o controlo.
(A) Imagens representativas ( painel superior) e quantificação (painel inferior) das células invasoras. Conforme detalhado por “ensaio de invasão de células” no “
Métodos
“, as células A549 foram tratadas com DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) sozinho ou em combinação com rapamicina (100 nM) durante 24 h. Os números de células invasoras foram contadas sob microscópio e os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes, * p 0,05, ** p 0,01. (B) Imagens representativas de ensaios de cicatrização de feridas em células A549 que foram tratadas com DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) ou rapamicina (100 nM) durante 18 h. (C) A expressão da MMP-2/9 e E-caderina determinada por transferência de Western em células A549 que foram tratadas com DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) ou rapamicina (100 nM) durante 24 h.
Além disso, o efeito do dasatinib e rapamicina sobre a capacidade de migração de células A549 foi avaliada por ensaio de cicatrização de feridas utilizando células fisicamente feridos (Fig 5B). Aos 18 h após ser arranhado, as células A549 tratadas de forma eficiente migraram para a incisão, eo efeito da rapamicina sozinha na migração celular apareceu limitado. Em contraste, a migração foi obviamente inibida pelo tratamento com dasatinib. 0,01. 0,01.