Abstract

Fundo

A identificação e caracterização de células-tronco cancerosas (CSCs) é fundamental para a compreensão do mecanismo da patogênese do câncer. Evidências crescentes sugerem que CSCs desempenham papéis críticos no desenvolvimento e progressão do câncer. No entanto, existem controvérsias quanto ao facto de CSCs surgem a partir de células derivadas da medula óssea (BMDCs).

Metodologia e principais conclusões

No presente estudo, n-nitrosodietilamina (DEN) foi usado para induzir a formação de tumor em ratos fêmeas que receberam medula óssea de ratinhos macho. a formação do tumor foi induzida em ratos 20/26, incluindo 12 tumores hepáticos, 6 tumores de pulmão, um tumor da bexiga e um tumor de nasofaringe. Através de comparação de fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) resulta em áreas de secções de tumor de série coradas com H E, determinamos que BMDCs foram recrutados tanto para tecido tumoral e tecido normal circundante com uma frequência muito baixa ( 0,2-1% em tumores e 0-0,3% em tecidos normais). No entanto, cerca de 3-70% das células nos tecidos circundantes do tumor foram BMDCs, e a percentagem de BMDCs foi altamente associado com o estado inflamatório do tecido. No presente estudo, foi encontrada nenhuma evidência para apoiar a existência de células de fusão formadas BMDCs de formulário e as células-tronco de tecidos específicos.

Conclusões

Em resumo, nossos dados sugerem que, embora BMDCs pode contribuir a progressão do tumor, eles são, ao contrário de contribuir para a iniciação do tumor

citação:. Lin H, Hu G, Chen L, Yu H, Wang Q, Chen P, et al. (2012) Cancros quimicamente induzidos Não se originam de células derivadas da medula óssea. PLoS ONE 7 (1): e30493. doi: 10.1371 /journal.pone.0030493

editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de Câncer, o Brasil

Recebido: 16 de novembro de 2011; Aceite: 16 de dezembro de 2011; Publicação: 24 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Provincial de Zhejiang Natural Science Foundation da China (Y2100464) eo Sci-tech Projeto especial Key Nacional de Doenças Infecciosas (2012ZX10002-013). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

um crescente corpo de literatura sugere que os tumores se originam de uma pequena porção de células, conhecido como células-tronco cancerosas (CSCs) ou células tumorais iniciar (TICs), porque estas células estaminais ter características semelhantes a células tais como auto -renewal e diferenciação [1]. Até à data, os CSCs ter sido demonstrado existir em cancros do sistema hematopoiético [2], da mama [3], cérebro [4], próstata [5], gástrico [6], o pulmão [7], do cólon [8], e fígado [9]. No entanto, pouco se sabe sobre a origem dos CSCs. Uma possível origem de CSCs é a medula óssea, como as células derivadas de medula óssea (BMDCs) são frequentemente encontradas em tecidos tumorais e BMDCs têm a capacidade de se diferenciar em muitos tipos diferentes de células, incluindo células mesenquimais, células musculares e células epiteliais, incluindo células hepáticas . Recentemente, o nosso conhecimento da relação entre BMDCs e progressão do câncer melhorou dramaticamente. Um aspecto interessante é que as células cancerosas recrutar activamente BMDCs ao seu próprio microambiente. BMDCs em tumores não são apenas responsáveis ​​pela inflamação, mas também para a angiogênese tumoral [10]. BMDCs CD45-positivos são frequentemente encontradas em tecido tumoral, onde eles expressam vasculares factor de crescimento de células endoteliais do receptor-1 (VEGFR-1) [11], um receptor de VEGF chave. Além da inflamação, estas CD45 + /+ VEGFR1 células também contribuir para a angiogénese tumoral. Assim, a evidência demonstra que BMDCs fornecer um microambiente adequado para facilitar a metástase do câncer [12].

No entanto, não está claro se as células cancerosas se originam de BMDCs, e essa hipótese é freqüentemente debatido. Um relatório recente descobriu que, depois crónica

Helicobacter

infecção, BMDCs acumulado na mucosa gástrica e, eventualmente, deu origem a câncer gástrico [6]. Além disso, estudos adicionais sugeriram que mutações oncogénicas de células estaminais de tecidos ou outras células diferenciadas pode criar um conjunto de células auto-renovação em que essas mutações acumuladas e finalmente resultou em cancro [4], [5]. Em modelos de transplante de medula óssea, demonstrou-se que eram BMDCs pouco provável que seja a origem do cancro do fígado [13] e o cancro da pele [14]. Para testar se o cancro origina a partir BMDCs, o carcinógeno químico N-nitrosodietilamina (DEN) foi utilizado para induzir o desenvolvimento do tumor em ratinhos após transplante de medula óssea. A medula óssea de ratinhos fêmea receptora foi erradicada por irradiação e em seguida reconstituída com medula óssea de ratinhos normais do sexo masculino. O cromossoma Y foi utilizado como marcador para caracterizar a origem das células tumorais induzidas. Vinte tumores, incluindo 12 tumores hepáticos, 6 tumores de pulmão, um tumor da bexiga e um tumor de nasofaringe, foram induzidos com sucesso. Entre estes tumores, não foi observada a expansão clonal de células positivas Y-Y (+). O número de células Y + nos tumores estreitamente correlacionada com o número de linfócitos infiltrantes. Nós também descobrimos que a maioria das células Y + expressa tanto CD45 e VEGFR-1. Os nossos dados sugerem que, pelo menos no nosso modelo animal, BMDCs não são a origem das células estaminais do cancro, embora eles estão relacionadas com a inflamação do tumor e pode contribuir para a formação de neo-vasos tumorais.

Resultados

Detecção de rato X e Y-cromossomas por peixes

Para o transplante de medula óssea (TMO), células da medula óssea coletadas de camundongos machos 6 doadores foram transplantadas em camundongos fêmeas de 60 beneficiários. Como mostrado na Figura 1, as sondas FISH hibridada com ambos os cromossomas em metafase e interfase e produziu sinais fortes e específicas. sinais de FISH do cromossomo Y só foram detectadas em células da medula de doadores do sexo masculino óssea de ratinho (Figura 1B).

(A) A metaphase periférica de linfócitos de sangue de um rato fêmea receptora. (B) Um metafase de linfócitos de sangue periférico a partir de um rato dador masculino. linfócitos (C) de sangue periférico a partir de um rato fêmea receptora após BMT. Uma fêmea de linfócitos é indicado por uma seta. células da medula (D) óssea de um rato fêmea receptora após o TMO. Uma célula de medula óssea fêmea é indicado por uma seta. Ampliação, × 100 (A e B) ou 40 × (C e D). Barras de escala, 20 mm.

Transplante de Medula Óssea

Todos os ratos destinatário sobreviveu ao TMO. O nível global de enxerto era 82,5-94,5% tal como avaliado por meio do cálculo da percentagem de células Y-positivos entre ambos os linfócitos periféricos (Figura 1C) e células da medula óssea (Figura 1D). Um total de 500 células foi analisada em cada amostra. Este resultado indica que os procedimentos de TMO foram bem sucedidas.

Induzido por DEN Carcinogênese

Durante as 30 semanas de carcinogênese induzida quimicamente, 34 ratos BMT morreu. autópsias completas foram realizados em cada um destes ratinhos, com a principal causa de morte sendo extensa pneumonia e insuficiência hepática. Os tumores foram induzidos em 20 dos ratinhos sobreviventes 26; estes tumores incluiu 12 tumores do fígado, do pulmão, tumores 6 um tumor da bexiga e um cancro da nasofaringe. Imagens representativas dos tumores do pulmão e do fígado são apresentadas na Figura 2A e 2B, respectivamente. Estes tumores foram ressecados, embebidos em parafina, seccionados e caracterizada histologicamente utilizando H E. Dos 6 cancros do pulmão induzidas, 4 foram caracterizados como carcinoma de células escamosas, e os restantes dois foram caracterizados como adenocarcinoma (Figura 2C). Todos os 12 tumores do fígado foram caracterizados como carcinoma hepatocelular (Figura 2D). Tanto a bexiga (Figura 2E) e câncer de nasofaringe (Figura 2F) foram caracterizados como carcinoma de células escamosas.

(A) patologia bruta de um câncer de pulmão representativa. (B) a patologia bruta de um câncer de fígado representativa. Representante de H E secções de coloração para o adenocarcinoma do pulmão (C), carcinoma hepatocelular (D), o carcinoma de células escamosas da bexiga (E), e cancro da nasofaringe (F). Ampliação, x 20 (C, D, E, e F). Barras de escala, 50 um.

Distribuição de BMDCs em Den-Induzidos Tumores

Para investigar se os cancros induzidos por DEN originado da medula óssea, utilizamos peixe para determinar a percentagem de Y (Y +) células -positivas. Em cada caso, 500-5.000 células foram contadas para calcular a percentagem de células Y + em amostras de tumor. Em todos os tumores induzidos por Den, a frequência de células Y + foi 0,2-0,6% nos cancros do fígado (Figura 3B e 3C), 0-0,3% nos cânceres de pulmão (Figura 4), 0,6% no cancro da bexiga (Figura 5 ) e 1% no cancro da nasofaringe (Figura 6). Curiosamente, as frequências de células Y + foram extremamente elevados nos tecidos circundantes do tumor, em que uma grande percentagem de infiltração de células inflamatórias e fibroblastos residia. A frequência de células Y + no tecido circundante do tumor foi de 30-50% nos tumores do fígado (Figura 3B, 3C), 3-8% nos tumores do pulmão (Figura 4), de 40% no tumor da bexiga (Figura 5) e 70% do cancro da nasofaringe (Figura 6). No entanto, uma frequência significativa de células Y + não foi observada nos tecidos normais adjacentes aos tumores do fígado, do pulmão e da bexiga. Estes dados sugerem que a origem celular dos cancros não é a medula óssea

(a) um representante de H . E imagem coloração demonstrar as características histopatológicas da HCC tecido e o tecido circundante. (B) Uma imagem PEIXES representante da mesma área de uma secção adjacente de série construída pela fusão de várias imagens. (C) Ampliação de áreas a partir do tecido circundante do tumor (a) e do tecido tumoral (b) em (B). T, tecido tumoral. Ampliação, x 20 (A B). Barras de escala, 20 um

(A) H . image coloração E apresentando as características histopatológicas do câncer de pulmão e do tecido normal circundante. Ampliação, × 20. (B) H E de coloração (superior) e peixes (inferior) de uma área ampliada em (A). T, tecido de tumor; NT, o tecido não tumoral. Ampliação, × 40. Barras de escala, 20 um

(A) H . image coloração E apresentando as características histopatológicas da NPC e do tecido circundante. Ampliação, × 20. (B C) H E coloração (superior) e peixes (inferior) das áreas ampliadas em (A). T, tecido tumoral. Ampliação, × 40. Barras de escala, 20 um

(A) H . image coloração E apresentando as características histopatológicas do câncer de bexiga e do tecido circundante. Ampliação, × 20. imagens (B) PEIXES de áreas ampliadas em (A). T, tecido de tumor; NT, o tecido não tumoral. Ampliação, × 40.

Para avaliar se BMDCs podem fundir-se com células tumorais, analisamos o número de sinais X e Y em BMDCs nos tumores e seus tecidos circundantes. Nenhuma célula cariótipo derivados de fusão (XXY, XXXY) foram encontrados em nosso estudo. Este resultado é consistente com muitos outros achados [6], [11], [15], [16] e sugere que a fusão celular não é a principal contribuição de BMDCs a patogênese maligno.

Discussão

Embora a hipótese de células-tronco do câncer permanece debatida, muitos cientistas acreditam que os cancros contêm um pequeno número de células-tronco cancerosas (CSCs). Estes CSCs são capazes de se auto-renovar, diferenciar, e resistir à quimioterapia e, assim, manter o crescimento do câncer. Até à data, a origem de CSCs permanece um mistério. Pelo menos três origens possíveis de CSCs têm sido propostos, incluindo: 1) células estaminais de tecidos específicos [17]; 2) BMDCs [6], [15]; e 3) as células de fusão derivadas de progenitor e BMDCs específica de tecido ou de células estaminais [18] – [20]. Neste estudo, utilizamos um modelo de transplante de medula óssea de animais para investigar a origem dos CSCs em tumores induzidos quimicamente (DEN). DEN é cancerígena que pode induzir tumores em vários órgãos, incluindo o fígado e pele e no tracto gastrointestinal, respiratório e hematopoiéticas em ratinhos. Quando metabolizado, em DEN convertido num ião ethyldiazonium electrofílico que podem reagir com bases de DNA e produtos de adição de formulário e, assim, podem fazer com que as mutações no DNA e que, finalmente, quebras na cadeia contribuem para a patogénese [21]. Em nosso modelo, utilizamos uma alta dose de DEN (60 ppm) na água de beber durante 12 semanas para aumentar a frequência e encurtar o período de formação de tumores. Usando esta estratégia, os tumores foram induzidos com sucesso no fígado, pulmão, bexiga e nasofaringe.

BMDCs têm a capacidade de se diferenciar em células epiteliais durante a reparação de tecidos em diversos órgãos, incluindo o fígado [22], [23] , pulmões, pele, olhos, trato gastrointestinal e os rins [24]. No entanto, se e como BMDCs conta para a reparação de tecidos ainda é debatido. Embora o número de BMDCs foi variável, a maioria das publicações mostram que BMDCs foram recrutados para locais de danos de tecidos [25] – [28], enquanto outro relatório que BMDCs publicação não foram detectados nos modelos utilizados [29], [30]. Em fígado de murino e modelos de tumores pancreáticos, os tumores mais avançados tinham uma maior tendência para recrutar BMDCs [31]. Em nosso modelo, verificou-se que as percentagens de BMDCs em tecidos tanto tumorais e normais foram muito baixos ( 1%); No entanto, BMDCs foram encontradas no tecido que envolve o tumor. Esta área é infilitrated com células inflamatórias, o que sugere que estes BMDCs foram associados com a inflamação. Este resultado sugere que BMDCs eram menos propensos a ser transformado em células malignas que nenhum dos tumores em nosso modelo continha cluster células Y +.

Os resultados recentes mostraram que BMDCs pode incorporar em fígados e intestinos através da fusão de células [18] – [20], o que aumentou a possibilidade de que BMDCs pode desempenhar um papel na tumorigénese e regeneração por fusão com células progenitoras ou as células do órgão alvo haste. No entanto, muitos relatórios argumentam que não há nenhuma evidência clara de demonstrar que ocorre a fusão celular entre células alvo e BMDCs de órgãos nos seus modelos de [6], [11], [15], [16]. No presente estudo, confirmou a falta de provas para demonstrar a fusão celular, tanto em tumores e em tecido normal circundante por FISH. Notavelmente, embora BMDCs foram encontrados incorporada no adenoma intestinal em ratinhos neoplasia intestinal múltiplos APC-mutados, nenhum dos adenomas ubiquamente consistiu de BMDCs [20], o que sugere que o mecanismo pelo qual BMDCs contribuir para a patogénese não era susceptível de ser fusão celular. Em resumo, os nossos dados mostraram que, apesar de BMDCs pode contribuir para a progressão do tumor, a possibilidade de que BMDCs são a origem do tumor em si é extremamente baixa.

Materiais e Métodos

Transplante de Medula Óssea (TMO )

seis a oito semanas de idade e do sexo masculino C57BL feminino /6J foram adquiridos a partir do Centro de Pesquisa Modelo animal da Universidade de Nanjing (Nanjing, China). Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais, eo estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Zhejiang (Aprovação ID: SYXK2004-0050). Para o TMO, medula óssea total foi isolado a partir dos fémures e tíbias de murganhos dadores do sexo masculino, lavou-se, triturou-se utilizando uma agulha de calibre 20 e passado através de um filtro de células de malha de nylon de 40-m (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ) para produzir uma suspensão de uma única célula em PBS a uma densidade de 1,5 x 10

7 células /ml. A fêmea receptora C57BL /6J foram irradiadas com 900 rads de uma

60Co irradiador, reconstituída com 3 × 10

6 células da medula dador por meio de injecção na veia da cauda ou de amostragem retro-orbital dos ratinhos anestesiados 36 horas mais tarde, e utilizados para as experiências 4-5 semanas após a recuperação. Para confirmar o transplante bem sucedido de células de medula óssea do dador, no sangue periférico e receptor células de medula óssea foram obtidos de 4 semanas após a BMT e examinados quanto à presença do cromossoma Y com fluorescência

In situ

fluorescente (FISH).

induzido quimicamente Carcinogênese com n-nitrosodietilamina (DEN)

Cerca de 4-5 semanas após o TMO, 60 ratinhos receptores foram alimentados DEN (60 ppm em água potável, Sigma, St Louis, MO) para 12 semanas para duas sessões com um intervalo de separação de 2 semanas para iniciar o processo de carcinogênese. Os ratos que sobreviveram foram sacrificados em 30 semanas.

histológica e patológica Estudo

tumores induzidos por DEN foram removidas e fixadas em formalina a 4% durante a noite. Após a desidratação, o tecido do tumor foi incorporado em parafina. O tecido do tumor em parafina foi seccionado em série (5 um de espessura), e seleccionar as lâminas foram rotineiramente coradas com hematoxilina-eosina (H E). Todas as seções do tumor foram revisados ​​de forma cega por dois patologistas experientes.

fluorescência

in situ

Hibridização

Dois cromossomo artificial (BAC) clones bacterianas (RP24-0090J19 e RP24-185C22) contendo o gene SRY do rato cromossoma Y foram seleccionados para identificar células derivadas a partir de ratinhos macho. Os BACs contendo o fragmento de DNA a partir da região X7A.1 murino (RP23-0170B5 e RP23-0011C16) foram utilizados como sondas de controlo para o cromossoma X murino. secções de tecidos adjacentes ao H secções E-coradas foram seleccionadas para detecção de peixe. Os cortes foram desparafinados, digerido com protease K, e, em seguida, hibridados com as sondas BAC marcado com fluoróforos de acordo com o método descrito anteriormente [32]. Os resultados de FISH foram observados e capturados usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmara CCD arrefecida. Os sinais de FISH foram comparados com a H . E coloração da mesma área em uma seção tumor sucessiva

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Mei Jin e Dr. Jing-Yao Xu por sua experiência na revisão das secções de tumor.