Abstract

Fundo

A vitamina D é conhecida por desempenhar um papel importante na câncer prevenção. Uma das características associadas com o aparecimento de malignidade é a elevação dos níveis de Cu (II). O modo de câncer de prevenção mediado pelo calcitriol, a forma biologicamente ativa da vitamina D, permanecem largamente desconhecidos.

Métodos

Usando adicionado exogenamente Cu (II) para estimular uma malignidade, como condição de novo sistema celular de calcitriol coelho linfócitos sobrecarregados, avaliou-se a peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, danos no DNA e consequente apoptose. mediadores de radicais livres foram identificados usando varredores de radicais livres e o papel de Cu (II) na reação foi elucidada usando quelantes de iões metálicos celular redox ativos.

Resultados

A peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas ( marcadores de estresse oxidativo), consequente fragmentação do DNA e apoptose foram observadas devido ao calcitriol-Cu (II) interação. radicais hidroxila, peróxido de hidrogênio e superóxido ânions mediar o stress oxidativo produzido durante essa interação. Entre os metais activos redox celulares, cobre foi encontrado para ser responsável por esta reação.

Conclusão

Este é o primeiro relatório implicando Cu (II) e interação calcitriol como a causa da ação citotóxica selectiva de calcitriol contra células malignas. Mostra-se que esta interacção conduz à produção de estresse oxidativo devido à produção de radicais livres e consequente fragmentação do ADN, o que leva a apoptose. Um possível mecanismo é apresentado para explicar esse efeito biológico

Citation:. Rizvi A, Hasan SS, Naseem I (2013) Selective citotóxica Ação e danos DNA por Calcitriol-Cu (II) Interação: suposto mecanismo de Prevenção do Câncer . PLoS ONE 8 (9): e76191. doi: 10.1371 /journal.pone.0076191

editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América

Recebido: 09 de junho de 2013; Aceito: 23 de agosto de 2013; Publicação: 27 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rizvi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AR recebeu a UGC-CSIR Júnior Research Fellowship do Governo da Índia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vitamina D

3 é obtida a partir de alimentos (produtos lácteos enriquecidos e óleos de peixe) ou é sintetizado na pele a partir de 7-desidrocolesterol por irradiação ultravioleta. No fígado, a vitamina D

3 é hidroxilado em C-25 por vitamina D 25-hidroxilase ou do citocromo P450 e forma 25-hidroxivitamina D

3 (25 (OH) D

3). 25 (OH) D

3 é então transportado para o rim, onde no túbulo proximal renal é hidroxilados em C-1, resultando na formação do hormonalmente activo a partir da vitamina D, 1,25-di-hidroxivitamina D

3 (1,25 (OH)

2D

3) ou o calcitriol, que é um nutriente essencial que medeia uma variedade de processos metabólicos [1]. Várias linhas de evidência com base em farmacologia e

in vivo

estudos em modelos animais mostram que o calcitriol é um agente anti-câncer

in vivo

[2], que actua por iniciar a apoptose e inibir o crescimento de várias linhas de células malignas [3]. Estudos epidemiológicos mostram que a menor exposição à luz solar e as consequentes níveis mais baixos de calcitriol aumentar o risco de cancro e de mediar a progressão de vários cancros, incluindo cancros da mama, dos ovários, do cólon, do esófago, do recto, do pâncreas e do sangue [4,5]. A ampla variedade de células malignas que respondem a flutuações nos níveis de calcitriol indica o papel alargado de calcitriol na mediação de efeitos anti-cancro. No entanto, o mecanismo exato pelo qual efeitos anti-câncer de calcitriol são efectuadas permanece desconhecida.

Uma das características de malignidade é a elevação dos níveis de cobre [6-8]. O cobre é um ião de metal importante encontrado para ser associado com o ADN da cromatina, particularmente com guanina [9]. Sabe-se que, em células malignas, as concentrações de cobre pode ser elevada de duas a cinco vezes, em comparação com os relatados em células normais [10]. Embora a razão exata para a elevação dos níveis de cobre durante a malignidade permanece incerto, aumento da angiogênese é pensado para ser uma possível razão [11].

Neste estudo, propomos uma ligação fisiológica entre calcitriol e cobre nas células malignas. Descrevemos uma via putativo, Cu (II) induzida por, mediada por radicais livres, o que explica a acção citotóxica selectiva de calcitriol contra células malignas. Para ilustrar a atividade calcitriol, temos utilizado um sistema celular de linfócitos calcitriol sobrecarregado (cols). Nós demonstramos que cols, quando expostos a Cu (II) iões para simular o ambiente de uma célula maligna, sofrer danos oxidativos e quebra do ADN, o que eventualmente leva à morte celular. Desde calcitriol, uma espécie essencialmente hidrofóbico, afeta DNA, uma molécula altamente polar, apresentamos uma hipótese para explicar a interação entre calcitriol e DNA. Com base na mutagénese, bioquímica e dados relacionados com a estrutura [12-18], discute-se a possibilidade de que o receptor da vitamina D (VDR) serve como uma “proteína adaptadora” que medeia este processo. Nós utilizamos a estrutura recentemente elucidados de VDR e seu parceiro de ligação de RXR (receptor X de retinóico) [19] para explicar a nossa hipótese. Para o melhor de nosso conhecimento, a presente pesquisa é o primeiro relatório que mostra que Cu (II) desempenha um papel na morte celular mediada por calcitriol.

Material e Métodos

Chemicals

Todos os químicos e enzimas utilizados foram obtidos a partir de Sigma Aldrich (EUA). Todas as soluções foram preparadas no mesmo dia e utilizado imediatamente.

Declaração éticos na experimentação animal

experimentações animais foram autorizados pelo Ministério do Meio Ambiente e Florestas, Governo da Índia sob o registro nº 714/02 /a /CPCSEA emitido pelo Comité para efeitos de controlo e supervisão de experiências com animais (CPCSEA), datado de 16 de novembro de 2002 e aprovado pelo comitê de ética institucional do Departamento de Bioquímica da Universidade muçulmana Aligarh, Aligarh, Índia (Despacho n.º: DNo1).

Preparação de Calcitriol Sobrecarregado linfócitos (cols)

Quinze coelhos albinos, machos, pesando 1 + 0,1 kg foram comprados e divididos aleatoriamente em três grupos de cinco coelhos cada um. Os coelhos foram alojados em gaiolas de aço individuais, e mantido em ração para coelhos padrão e água, forneceu

ad libitum

, com luz de 12 h e os ciclos de escuro a 25 ° C. Os animais foram aclimatizados durante um mês antes do início da experiência. Os animais do grupo recebeu um 200 ng /g de peso corporal de colecalciferol dissolvido em 1 ml de etanol, por via intraperitoneal a cada dia durante um período de duas semanas. Os animais do grupo dois receberam injecções intraperitoneal de 1 ml de etanol (controlo do veículo) e os animais no grupo de três serviram como controlos. Após duas semanas, os animais foram sacrificados e o sangue foi recolhido em tubos heparinizados e diluída em fosfato livre de iões de solução salina tamponada (pH 7,0). Os linfócitos foram isolados utilizando Histopaque 1077 e as células foram suspensas em meio RPMI 1640. linfócitos isolados de fresco foram utilizados para todas as experiências.

A determinação de níveis intracelulares calcitriol cols

isolados linfócitos foram lisadas e a célula lisado foi ainda utilizado para determinar os níveis de calcitriol, utilizando um USCN Life Sciences Inc. (Huston, Texas, EUA) kit de acordo com as instruções do fabricante.

Tratamento de linfócitos

os linfócitos foram suspensos em um volume total de 3 ml de PBS e incubadas na presença de Cu (II) (25 uM) durante 2 horas. A reacção foi também realizada na presença de agentes quelantes de iões de metal específicos. A desferoxamina (50 uM) foi usada para quelar Fe (II), iões, histidina (50 mM) foi utilizado para quelar o Zn (II) e bathocuprione e neucuprione (50 uM cada) foram usadas para quelar Cu extracelular e intracelular (II) iões. varredores de radicais livres (catalase 20 ug /ml, superóxido dismutase (SOD), 20 ug /ml, e tioureia 0,1 mM) foram usadas num conjunto separado de reacções; para implicar o papel de ROS em Cu (II) estresse oxidativo mediado. Igualdade número de linfócitos (1 x 10

8 + 10

3) foram utilizados em todos os experimentos.

Cu (II) a peroxidação lipídica induzida em Cols

substâncias reativas

ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram estimados em linfócitos através do método de Ramanathan et al. [20], com modificações menores. A 1,5 ml de uma mistura reaccional, 0,5 ml de TCA a 10% (ácido tricloroacético) e 0,5 ml de 0,6 M de TBA (ácido 2-tiobarbitúrico) foram adicionados e a mistura foi incubada num banho de água a ferver durante 20 minutos. A absorvância foi lida a 532 nm e convertido em nano-moles de substâncias reactivas TBA utilizando o coeficiente de extinção molar.

Cu (II) induzida carbonilação de proteínas em cols

linfócitos tratadas foram lisadas eo foi determinada quantidade de grupos de carbonilo formado [21]. Uma mistura de reacção após o tratamento ml foi misturado com 0,5 ml de 10 mM de 2,4-dinitrofenil-hidrazina em HCl 2,5 M. A mistura foi deixada durante 1 hora à temperatura ambiente e adicionou-se ao tubo 0,5 ml de ácido tricloroacético a 20%. O tubo foi deixado em um balde de gelo durante 10 minutos seguido de centrifugação a 12.000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de proteína foi lavado com etanol /acetato de etilo (1: 1 v /v) e dissolveu-se em 2 ml de 6 M guanidina (pH 2,3) e agitadas. O conteúdo de carbonil foi calculada utilizando o coeficiente de absorção molar de 22.000 M

-1 cm

-1

Comet, Assay (Single Cell Alkaline eletroforese em gel) de Cols

Ensaio Cometa foi realizada utilizando o método utilizado por Singh et al. [22], com modificações menores. lâminas foscas totalmente foram pré-revestidas com 1,0% de agarose de fusão normal. Os linfócitos foram misturados com 90 ul de 1,0% de agarose de baixo ponto de fusão para formar uma suspensão de células e pipetadas sobre a primeira camada e coberta com uma lamela de cobertura. As lâminas foram colocadas em sacos de gelo durante 10 minutos para solidificar a agarose. As lamelas de cobertura foram removidas cuidadosamente e uma terceira camada de 0,5% de agarose de baixo ponto de fusão foi pipetado. As lâminas foram cobertas com lamelas e foram colocados em sacos de gelo para solidificar. As lamelas foram então removidas e as lâminas foram imersas em tampão de lise frio de gelo durante uma hora. Após a lise, o ADN foi deixado a relaxar em solução electroforética alcalina (NaOH a 300 mM, EDTA 1 mM, pH 13). A electroforese foi realizada a 4 ° C, numa intensidade de campo de 0,7 V /cm e 300 mA de corrente. As lâminas foram neutralizado com gelo frio de Tris 400 mM (pH 7,5), e coradas com 75 ul de brometo de etídio (20 mg /mL) e cobertos com uma lamela de cobertura. As lâminas foram registados com um sistema de análise de imagem (Komet 5.5, Kinetic Imaging, Liverpool, Reino Unido) ligado a um Olympus (CX41) microscópio de fluorescência (Olympus Optical Co., Tóquio, Japão) e uma câmara COHU integrada CC 4910 (equipado com 510-560 nm de excitação e 590 nm filtros de barreira) (COHU, San Diego, CA, EUA). Imagens de 25 células foram analisados ​​a partir de cada slide triplicado. comprimento da cauda (migração de DNA a partir de núcleo em μmeters) foi o parâmetro utilizado para o dano ao DNA jumentos.

apoptose Cu (II) induzida em Cols

linfócitos tratadas foram manchadas em um ambiente limpo, esterilizado etanol lâmina de vidro, e foram coradas com corante de Leishman. As células apoptóticas foram classificados visualmente em três campos visuais selecionados aleatoriamente de acordo com critérios de Hasan et al. [23] usando uma Nikon binocular microscópio composto.

A análise estatística

Os valores são expressos como média + SEM de três experiências independentes. Os dados foram analisados ​​pelo teste de Tukey após uma análise de variância (ANOVA) utilizando o GraphPad Prism 5.01 (Califórnia, EUA). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P 0,05

Resultados

modelo celular para estudar ex-vivo interação de calcitriol e cobre

Como mencionado acima calcitriol é conhecido por mediar os efeitos anti-câncer. Tem sido relatado que o Cu (II) também é significativamente elevados em células malignas. Para estudar os efeitos de interacção calcitriol-Cu (II), temos desenvolvido um sistema modelo baseado em linfócitos. Calcitriol sobrecarga de linfócitos foi conseguida por meio de injecção intraperitoneal de colecalciferol do calcitriol precursor, o qual foi submetido a conversão em calcitriol, dentro do sistema animal. Após a injecção colecalciferol, observou-se que os níveis de calcitriol em linfócitos isolados foram elevados por 25,52% (Figura 1). níveis de Cu (II) foram aumentadas em

in vitro

suplementação de isolado, Cols com Cu (II). Os ensaios para a peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e danos no DNA como consequência de calcitriol-Cu interação (II) foram realizados no sistema de linfócitos isolado.

Os níveis de calcitriol em calcitriol sobrecarregado de linfócitos (cols) lisados ​​e linfócitos controle. Valores expressos em média + SEM (n = 3) * P . 0.001, em comparação ao controle e controle do veículo

Cu (II) a peroxidação lipídica induzida em Cols

Calcitriol tem foi mostrado para causar o stress oxidativo. Uma das consequências do estresse oxidativo é a peroxidação de lipídios celulares [20]. Assim, a peroxidação lipídica foi utilizado como um marcador para avaliar o stress oxidativo como uma função dos níveis de calcitriol. A elevação dos níveis de calcitriol não conduziu a peroxidação lipídica significativa em Cols (Figura 2). No entanto, a exposição de Cols a Cu (II), iões levou a um aumento acentuado na peroxidação de lípidos (Figura 2). Para determinar se a peroxidação lipídica é um Cu (II) efeito -específica, ou se outros iões metálicos divalentes redox-activo, tais como Fe (II) e Zn (II) medeiam a peroxidação de lípidos na presença de calcitriol, quelantes de Fe (II iões) e Zn (II) (desferoxamine e histidina, respectivamente) foram adicionados a cols isolado. Observou-se que a remoção de Fe (II) e Zn (II) não causou inibição significativa da peroxidação de lípidos (Figura 2). Como um controlo, quelantes de Cu (II) foram introduzidos para testar o papel específico de Cu (II) em causar o stress oxidativo em cols. Observou-se que a inibição significativa da peroxidação de lípidos foi obtida após a remoção de Cu (II) (Figura 2). Para identificar a localização do conjunto de Cu (II) (intra-celular contra extracelular) que medeia a peroxidação lipídica, o efeito de Cu (II) quelantes com diferentes permeabilidades de membrana foi testado em peroxidação lipídica em cols isolado. É significativo notar que bathocuprione, que é um de Cu (II) quelante de membrana impermeável, não inibiram a peroxidação lipídica de forma tão eficaz como neucuprione, um quelante de cobre membrana permeável (Figura 2). Infere-se que a acumulação intracelular de Cu (II) é um mediador da peroxidação lipídica através de interacções com o calcitriol. Observou-se que exogenamente adicionado Cu (II), em linfócitos de controlo (sem carga) não induziram a peroxidação lipídica significativa (Figura 2). Como peroxidação é causada pela actividade dos agentes de danos oxidativos, varredores de radicais livres (SOD, catalase e tioureia) foram utilizados para determinar a identidade dos radicais livres que estão envolvidos em eventos de Cu (II) -calcitriol oxidação induzida. A inibição eficaz de Cu (II) induzida por peroxidação lipídica na cols isolados foi observada com SOD, catalase e tioureia (Figura 2). Depreende-se que o anião superóxido, peróxido de hidrogénio e os radicais hidroxilo, respectivamente eliminado pela SOD, catalase e tioureia, mediar a Cu (II) induzida por peroxidação de lípidos.

controlo de veículo

(A) Controlo (B) (C ) Cu (II) (25 uM) [adicionado para não calcitriol carregado, linfócitos de controlo] (D) sobrecarga calcitriol (E) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) (F) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (membrana impermeável de Cu (II) quelante) (L) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (membrana permeável de Cu (II) quelante) (H) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + desferoxamina (50 uM) (Fe (II) quelante) (I), a sobrecarga de calcitriol + Cu (II) (25 uM) + Histidina (50 uM) (Zn (II) quelante) (J) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + catalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + tioureia (0,1 mM). Os valores expressos como média + EPM (n = 3). P 0,05 quando comparado com o controlo e cols com Cu (II) (25 uM). Todas as incubações foram realizadas durante 2 horas a 37º C.

Cu (II) induzida carbonilação de proteínas no cols

carbonilação de proteínas é uma conseqüência do estresse oxidativo e da interação de radicais livres com cadeias laterais de aminoácidos. Assim carbonilação proteína serve como um marcador para o stress oxidativo encontrado por um sistema biológico. Expondo a cols de Cu (II), iões resultou num aumento acentuado da carbonilação de proteína total. Quelantes intracelular de Zn (II) e Fe (II) não afectou a carbonilação de proteína enquanto que complexar Cu (II) a partir do sistema resultou numa diminuição acentuada no teor total de carbonilo. A presença de captadores de radicais livres (SOD, catalase e tioureia) no sistema resultou numa diminuição acentuada no teor de carbonilo proteína total (Figura 3).

(A) controlo (B) de controle do veículo (C) Cu (II) (25 uM) [adicionado para não calcitriol carregado, linfócitos de controlo] (D) sobrecarga calcitriol (E) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) (F) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (membrana impermeável de Cu (II) quelante) (L) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (membrana permeável de Cu (II) quelante) (H) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) ( 25 uM) + desferoxamina (50 uM) (Fe (II) quelante) (I), a sobrecarga de calcitriol + Cu (II) (25 uM) + Histidina (50 uM) (Zn (II) quelante) (J) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) ( 25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + catalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + tioureia (0,1 mM). Os valores expressos como média + EPM (n = 3). P 0,05 quando comparado com o controlo e cols com Cu (II) (25 uM). Todas as incubações foram realizadas durante 2 horas a 37º C.

Cu (II) danos no DNA celular induzida em cols

A geração de radicais livres provoca danos no DNA, o que leva a apoptose [ ,,,0],24]. Uma das características da apoptose é a quebra do ADN em fragmentos, que é detectada por um ensaio de cometa. Observou-se que a sobrecarga de calcitriol em linfócitos resultaram em danos no ADN, o qual foi significativamente reforçada após a incubação de Cols com Cu (II) (Figura 4A, 4D). Para determinar adicionalmente a especificidade de Cu (II) na mediação de danos no ADN, utilizou-se a membrana permeável a Cu (II) -chelator neucuprione. A incubação de Cols isoladas com neucuprione danos no DNA inibiu significativamente, implicando Cu intracelular (II) como participante em danos de DNA mediada por calcitriol (Figura 4B, 4D). O envolvimento de outros catiões divalentes em danos de ADN mediada por calcitriol nos linfócitos foi testada com desferoxamine e histidina, que não inibem os danos de ADN, o que exclui o envolvimento de Fe (II) e Zn (II) no processo (Figura 4B, 4D ). Inibição de danos no ADN pela SOD, catalase e tioureia implica que os danos de ADN é causado pelo anião de superóxido, peróxido de hidrogénio e radicais hidroxilo (Figura 4C, 4D).

(A) danos no DNA de linfócitos de controlo, controlo de veículo linfócitos, cols e cols com Cu (II) (25 uM). Os valores expressos como média + EPM (n = 3) ** P 0.001as comparado com o controlo e o controlo de veículo, P 0,001 quando * e ** são comparados). (B) A remoção de Cu (II) e danos no ADN. Cols com Cu (II) (25 uM) + neucuprione (Neo) (50 uM) (membrana permeável de Cu (II) quelante), desferroxamine (Desf) (50 uM) (Fe (II) quelante), histidina (His) (50 uM) ( Zn (II) quelante) Valores expressos como média + EPM (n = 3) * P 0,001 quando comparado com o controlo e cols com Cu (II) (25 uM). (C) cols com Cu (II) (25 uM) foram incubados juntamente com superóxido dismutase (SOD) (20 ug /ml), catalase (CAT) (20 ug /ml), e tioureia (tio) (0,1 mM) Valores expressos como média + SEM (n = 3). (D) Imagens representativas de cometa de Ensaio (1) Controlo (2) veículo de controlo (3) cols (4) cols + Cu (II) (25 uM) (5) cols + Cu (II) (25 uM) + Neo (50 uM) (6) cols + Cu (II) (25 uM) + Desf (50 uM) (7) cols + Cu (II) (25 uM) + A (50 uM) (8) cols + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (9) cols + Cu (II) (25 uM) + Cat (20 ug /ml) (10) cols + Cu (II) (25 uM) + tio (0,1 mM). * P 0,001 quando comparado com o controlo e cols com Cu (II) (25 uM). Todas as incubações foram realizadas durante 2 horas a 37º C.

Cu (II) induziu apoptose em cols

A apoptose é caracterizada por alterações morfológicas no interior da célula. Núcleos de células apoptóticas são caracterizadas pela formação de corpos apoptóticos e fragmentação nuclear distintas. Exposição de Cols a Cu (II), iões resultou num aumento significativo no número de células apoptóticas. A remoção do cobre a partir do sistema de diminuição do número total de células apoptóticas, ao passo que a quelação de outros iões metálicos divalentes redox activas (Zn (II) e Cu (II)) não afectou significativamente a apoptose. varredores de radicais livres decresceu com sucesso o número de células apoptóticas, assim, implicando claramente o papel de espécies de oxigénio reactivas em Cu (II) de apoptose induzida cols (Figura 5).

(A) controlo (B) de controle de veículos (C ) Cu (II) (25 uM) [adicionado para não calcitriol carregado, linfócitos de controlo] (D) sobrecarga calcitriol (E) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) (F) calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (membrana impermeável de Cu (II) quelante) (L) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (membrana permeável de Cu (II) quelante) (H) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + desferoxamina (50 uM) (Fe (II) quelante) (I), a sobrecarga de calcitriol + Cu (II) (25 uM) + Histidina (50 uM) (Zn (II) quelante) (J) sobrecarga Calcitriol + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + catalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol sobrecarga + Cu (II) (25 uM) + tioureia (0,1 mM). Os valores expressos como média + EPM (n = 3). P 0,05 quando comparado com o controlo e cols com Cu (II) (25 uM). Todas as incubações foram realizadas durante 2 horas a 37º C.

Discussão

Neste estudo, nós fornecemos evidências preliminares de que o calcitriol-Cu (II) interação é significativa em causar danos ao DNA , o que pode conduzir a apoptose. Uma vez que foi demonstrado que o Cu (II) está presente ligado ao DNA genômico [9] e é elevada em células malignas [6-8], Cu (II) foi testado como metal candidato para activar química calcitriol.

os estudos descritos aqui testar o papel de calcitriol-Cu (II) em interacção peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e danos no ADN, três indicadores de stress oxidativo e consequente apoptose. Para a atividade pró-oxidante, a geração de espécies reativas de oxigênio, de calcitriol é necessária. Várias drogas pró-apoptóticos [25,26], derivados de plantas moléculas [24,27], e vitamina C [28], agir para danificar o DNA por iões metálicos mediada química Fenton.

Propomos um mecanismo putativo ( Figura 6 a), através da qual o calcitriol podem interagir com o ADN ligado de Cu (II), para exercer os seus efeitos pró-oxidantes. O grupo de metileno do calcitriol aceita um electrão de Cu (II) e por uma série de rearranjos ligação dupla e a autólise de água forma radicais hidroxilo. Estes radicais hidroxilo podem combinar quer um com o outro e conduzir à produção de peróxido de hidrogénio ou, alternativamente, podem interagir com Cu (I) e conduzir à produção de Cu (II), estabelecendo assim um ciclo redox.

( A) A produção de radicais hydroxl, superóxido e hidrogênio lead peroxide a danos no DNA e morte celular consequente. (B) A hetero-dímero de VDR (verde) e de RXR (laranja) que mostra a separação entre o local de ligação de calcitriol e o DNA ligado. Painel superior: vista normal ao eixo de DNA ligado. painel inferior: Vista ao longo do eixo de DNA ligado. O calcitriol (varas verdes escuras e esferas) ligada ao VDR, constitui o local de produção de radicais livres, é separada a partir da molécula de ADN por ~ 39-A. Para referência, o ácido retinóico ligado aos RXR também é mostrada. A molécula de ADN de cadeia dupla é mostrada como varas preto /azul finas. medidas de distância e figura preparação foram realizadas em PyMOL (www.pymol.org) usando coordenadas do hetero-dímero VDR /RXR [Orlov et al. EMBO J. 2012] gentilmente fornecida por B. Klaholz.

de peróxido de hidrogénio uma vez formado, pode ainda reagir com Cu (II), que conduz à sua homolítica /hetrolytic repartição, que formas ainda mais radicais hidroxilo, e Cu (II) é reduzida a Cu (I). Alternativamente, o anião superóxido pode reagir com a água e formar ainda mais peróxido de hidrogénio.

Dado que o cobre é intracelular ligado ao ADN, o calcitriol e é conhecido por entrar no núcleo, a produção de radicais livres e de peróxido de hidrogénio por o mecanismo proposto, que com toda a probabilidade, ter lugar nas imediações de DNA levando a danos no DNA. Os radicais hidroxilo parecem desempenhar um papel importante na geração de estresse oxidativo, uma vez que tioureia, um sequestrante poderoso de radicais hidroxilo podem prevenir tanto a peroxidação lipídica e danos no ADN de forma significativa. É também significativo notar que a membrana permeável de Cu (II) quelante, neucuprione também inibe a peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, danos no ADN e apoptose, possivelmente por quelação e, desse modo, fazendo com que o cobre ligado de ADN disponível para reagir com o calcitriol.

Para excluir a participação das outras principais metais redox-activo presentes em sistemas biológicos, Fe (II) e Zn (II) foram testados. Experiências com quelantes de Fe (II) e Zn (II) não causar a inibição da peroxidação lipídica mediada por calcitriol, carbonilação de proteínas, danos no ADN e apoptose em cols. Por conseguinte, conclui-se que o Cu (II) interage especificamente com o calcitriol para mediar danos no DNA que leva a apoptose. O calcitriol é inferida a desempenhar um papel na activação de apoptose em um ambiente rico em Cu (II), tal como a observada em células malignas, que pode actuar como um mecanismo de defesa para controlar o crescimento de células malignas.

Resultados descrito no presente estudo fornecer insights sobre calcitriol-Cu interações -DNA (II). A este respeito, é importante notar que o calcitriol, uma molécula hidrófoba, interage com Cu (II) e de ADN, que são ambos altamente polar. Como um derivado lipídico, as partições de calcitriol em bicamadas lipídicas. No caso de uma interacção directa entre o calcitriol e as espécies polares, é imperativo que uma molécula de adaptador traz o calcitriol nas imediações do ADN e ADN ligado Cu (II). Uma tal molécula é o receptor da vitamina D (VDR). Está bem documentado que VDR localises no núcleo [29], e liga-se selectivamente a ambos calcitriol e ADN. Para proximidade espacial dano oxidativo eficiente entre o calcitriol e o ADN (junto com os iões ligados Cu (II)) é necessário. Em segundo lugar ratinhos knockout VDR demonstraram ser extremamente sensíveis a agentes cancerígenos químicos. Dentro de 60 dias de exposição, 88% dos ratinhos nulos VDR expostos ao químico cancerígeno DMBA desenvolveram câncer [30]. ratinhos nulos VDR foram mostrados para ser muito sensível para lukemia induzida quimicamente e experimentais de ablação causas VDR aumentada da pele e da glândula mamaria tumuroginesis [30], que indica um papel claro do VDR em controlar o processo de carcinogénese. Provou-se que a expressão de VDR se correlaciona positivamente com a supressão do tumor [30]. Um modelo de estrutura de VDR de comprimento completo, em combinação com o receptor do ácido retinóico parceiro de ligação (RXR) foi avaliado através de reconstrução Cryo-electron microscópica (Cryo-EM) recentemente [12]. É de importância notar que a região de charneira do VDR foi mostrado para ser flexível, e esta flexibilidade é crucial para a função do polipéptido de comprimento completo [13-16]. molécula de calcitriol é encontrado para ser separada da molécula de DNA ligado por uma distância de aproximadamente 39 Å na estrutura VDR (Figura 6B). Nós hipótese de que a molécula de VDR pode sofrer uma mudança conformacional ao longo da dobradiça, Figura 6B (painel superior), que traz o DNA ligado próximo ao calcitriol [18].

O facto de calcitriol é um proxidant em células malignas tem sido demonstrado por Koren et ai. [31] que demonstraram que na linha celular MCF-7, aumentar os níveis de glutationa após exposição ao calcitriol, que é um indicador do aumento da produção de ROS. Narvaez e galeses [32] têm demonstrado que o calcitriol apoptose induceded de células malignas é dependente de geração de radicais livres. O compromisso de células malignas para a apoptose mediada por calcitriol foi mostrado para ser independente de caspase, indicando que a apoptose mediada por células malignas de calcitriol é executado por vias não clássicos. O nosso não enzimático, cobre induzida, mecanismo de ROS mediada levando à fragmentação do DNA irreparável pode ser um dos vários fatores que contribuem para a morte apoptótica de células malignas após a exposição a calcitriol.

Reconhecimentos

SSH graças as Universidade de Purdue para as instalações. Os autores são gratos ao Prof. M. Mushfiq e Dr. Saltanat Raza do Departamento de Química da AMU, que ajudou a elaborar o mecanismo de reação. AR deseja graças Khursid Alam Khan (Departamento de Ciências Naturais, AMU) por seu apoio, enquanto que este trabalho estava em andamento. Prof. de Bruno Klaholz do IGBMC (França) desde que as coordenadas utilizadas para gerar a estrutura de VDR.