Sumário
A linha de células de cancro do ovário resistente a cisplatina IGROVCDDP também é resistente ao paclitaxel e modela o fenótipo de resistência de pacientes com câncer ovariano recidiva após quimioterapia de primeira linha platina /taxano. Uma matriz de baixa densidade TaqMan (TLDA) foi usada para caracterizar a expressão de 380 genes associados com a resistência à quimioterapia em células IGROVCDDP. O paclitaxel em resistência IGROVCDDP é mediada pelo gene e proteína de sobre-expressão de P-glicoproteína e a proteína é funcionalmente activa. resistência Cisplatina não foi revertida por elacridar, confirmando que a cisplatina não é um substrato de P-glicoproteína. resistência à cisplatina em IGROVCDDP é multifactorial e é mediada, em parte, pela via de glutationa e diminuiu a acumulação de fármaco. glutationa celular total não foi aumentado. No entanto, a actividade da enzima de GSR e GGT1 foram sobre-reguladas. A localização celular de cobre transportador CTR1 alterado de membrana associada em IGROV-1 para citoplasmático em IGROVCDDP. Este defeito pode mediar a acumulação previamente relatado. Não foi a diminuição da expressão da bomba de potássio e sódio (ATP1A), de MRP1 e FBP que todos tenham sido previamente associadas com defeitos de acumulação de platina em linhas de células resistente à platina. Localização celular da MRP1 também foi alterado em IGROVCDDP deslocando basolateralmente, em comparação com IGROV-1. BRCA1 foi também sobre-regulada ao nível do gene e proteína. A sobre-expressão de P-glicoproteína em um modelo resistente desenvolvida com cisplatina é incomum. Isto demonstra que a P-glicoproteína pode ser regulada para cima como resposta ao stress generalizado e não como uma resposta específica a um substrato. Mecanismos caracterizados em células IGROVCDDP pode ser aplicável a pacientes com câncer de ovário recorrente tratados com quimioterapia de primeira linha platina /taxano
Citation:. Stordal B, Hamon M, McEneaney V, Roche S, Gillet JP, O’Leary JJ, et ai. (2012) Resistência à Paclitaxel em um ovário linhagem de células cancerosas resistentes à cisplatina é mediada pela P-glicoproteína. PLoS ONE 7 (7): e40717. doi: 10.1371 /journal.pone.0040717
editor: Alexander James Roy Bishop, Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 12 de junho de 2012; Publicado: 11 Julho 2012 |
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Esta pesquisa foi financiada por um Marie Curie internacionais de entrada Fellowship do programa da União Europeia FP7, e um Irish Cancer Society pós-doutorado (BS) . A colaboração entre Britta Stordal e do Instituto Nacional do Câncer foi apoiado por uma bolsa de viagem da Associação Europeia de Pesquisa do Câncer. Esta pesquisa também foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer (JPG, MG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e uma nálise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
introdução
O prognóstico para as mulheres com câncer de ovário é muito pobre. A maioria dos pacientes apresentam doença avançada e a sobrevivência a longo prazo nesses pacientes é de 10-30% [1]. O tratamento atual do câncer de ovário é a cirurgia seguida por combinação de platina /taxano quimioterapia [1]. A cisplatina e paclitaxel fármacos quimioterapêuticos são utilizados no tratamento de diversos tumores sólidos, incluindo o carcinoma do ovário. A cisplatina liga-se à cadeia de ADN, impedindo tanto a replicação do ADN e a tradução de ARN e, eventualmente, provocando apoptose. O paclitaxel provoca a citotoxicidade através da ligação e estabilização de microtúbulos polimerizados. Devido aos seus mecanismos diferentes de ação, platinas e taxanos são muitas vezes combinados na terapia do cancro. resposta inicial à quimioterapia no cancro do ovário é elevado, mas até 80% dos pacientes irá eventualmente recaída e tornam-se resistentes a platina /taxano.
A linha de células de ovário resistente a cisplatina IGROVCDDP é um modelo resistente a cisplatina não usual, como também é multi-resistente a paclitaxel. Quando a resistência adquirida cisplatina é produzida em linhas de células, apenas 17% são também resistentes ao paclitaxel [2]. 41% de modelos fármaco-resistentes cisplatina não são resistentes ao paclitaxel e 28% de modelos celulares tornam-se hipersensível ao paclitaxel [2]. Isto sugere que a maioria dos doentes com cancro poderia beneficiar de receber quimioterapia que alterna entre a cisplatina e o paclitaxel, como o desenvolvimento de resistência a uma droga é menos provável que resulte na resistência para o outro. O desafio é como identificar quais os pacientes que respondem bem à terapia alternando entre cisplatina e paclitaxel. Isto porque, enquanto a maioria dos pacientes com câncer podem responder bem a esta estratégia de tratamento, a coorte resistência cruzada, que respondem mal e precisa ser tratado com terapia alternativa.
modelos IGROVCDDP o fenótipo de resistência dos pacientes com câncer ovariano que falharam padrão combinação de primeira linha platina /taxano quimioterapia. quimioterápicos que IGROVCDDP é sensível à podem ser adequados para o tratamento de câncer de ovário resistentes platina /taxano. Estudar o modelo de fármaco-resistente IGROVCDDP nos permitirá entender os mecanismos de resistência cruzada entre o platinas e taxanos. É nosso objectivo para traduzir marcadores moleculares deste fenótipos de resistência cruzada para o tratamento clínico de carcinoma de ovário resistente a medicamentos recaída.
Métodos
Cultura de Células e Citotoxicidade
A a linha de células de cancro humano do ovário IGROV-1 e a sua variante resistente a cisplatina IGROVCDDP foram obtidos a partir de Prof. Janeiro Schellens [3], [4]. As células foram cultivadas em antibiótico e livre de quimioterapia RPMI (Sigma # R8758) com 10% de FCS (Lonza, Bélgica). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C, e foram
mycoplasma-
livre. Para determinar a citotoxicidade de células (1 x 10
4 células /poço) foram plaqueadas em placas, de fundo plano de 96 poços e deixadas fixar durante a noite. Os poços foram tratadas em triplicado com diluições em série de droga em um volume final de 200 uL. controlos sem droga foram incluídos em cada ensaio. As placas foram incubadas durante mais 5 dias e a viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio da fosfatase ácida [5].
Matriz TaqMan Baixa Densidade (TLDA)
As células (1,25 x 10
6 células /placa de 10 cm) foram colocadas em placas e deixadas a aderir e crescer durante 3 dias para chegar a 70-80% de confluência. As células foram então tripsinizadas, lavadas em 10 ml de PBS, centrifugada e o sobrenadante removido. Os sedimentos celulares foram armazenados a -80 ° C antes da análise. O ARN total foi preparado usando um RNeasy Mini Kit (Qiagen, UK). A matriz TLDA foi realizado em amostras em triplicado biológicas, tal como descrito em Gillet
et ai. 2011 [6]. A expressão mediana de cada amostra foi subtraída de todas as expressões de genes para aquela amostra. Os dados foram analisados usando
ArrayTools BRB
, uma ferramenta de análise estatística microarray-dados (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Os genes expressos pelo menos de 50% das amostras foram filtradas para fora e um teste t de duas amostras univariada foi realizada para determinar genes que foram significativamente diferentes entre IGROV-1 e IGROVCDDP baseado em um p . 0,01 corte
Epirrubicina Ensaio de Acumulação
As células foram plaqueadas a uma densidade de 2,5 x 10
5 num balão T25 não ventilada. No dia seguinte, o meio foi removido e as células foram tratadas com 1 uM epirubicina durante 2 horas na presença ou ausência de elacridar 0,25 uM, 0,67 uM, 3,33 uM ou 33,3 uM de cisplatina. As células foram lavadas com 4 ml de PBS frio e tripsinizadas. As células foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de PBS e uma contagem de células realizada (9 mL). As restantes células foram centrifugadas, o sobrenadante removido e o sedimento foi armazenado a -20 ° C antes da análise. epirubicina total foi então quantificada por LC-MS após uma preparação da amostra de extracção líquido-líquido, de acordo com o método de parede
et ai. 2007 [8].
A glutationa celular total Ensaio
As células foram plaqueadas a uma densidade de 1,25 x 10
6 células num prato de 10 cm de diâmetro e deixadas a ligar durante a noite. As células foram tratados com fármaco durante 24 horas, depois tripsinizadas e uma contagem das células realizada. As células foram lavadas em 10 mL de PBS, centrifugada e o sobrenadante removido. Os sedimentos celulares foram armazenados a -20 ° C antes da análise. glutationa total foi determinado utilizando uma modificação de Suzakake
et ai. [9]. As pelotas de células foram lisadas em 150 ul de água e sonicou-se, adicionou-se 12,5 mL de ácido sulfosalicyclic 30% e as amostras foram agitadas. Após 30 minutos em gelo, os sobrenadantes livres de proteínas foram recolhidas por centrifugação (12,000
g
durante 5 minutos a 4 ° C). concentração de glutationa foi determinada utilizando uma mistura de reacção contendo 20 ul de lisado ou padrão, 90 uL de tampão de trietanolamina, pH 8,0 (0,2 M), 30 ul de NADPH (4 mM) e 20 ul de DTNB (6 mM). Após 2 minutos a 30 ° C, a reacção foi iniciada pela adição de 0,3 unidades de glutationa redutase por poço. As placas foram lidas a 405 nm (pré-aquecimento a 30 ° C) com medição cinética por um HT sinergia leitor de placas, Bio-Tek® (MASON Technology). A taxa de variação do ensaio cinético foi depois calculado pelo software KC4
A glutationa redutase (GSR) e Gama-glutamil transpeptidase (GGT1) Enzyme Assays
cultura celular -. As células (6,25 × 10
5 células /placa de 10 cm) foram colocadas em placas e deixadas a ligar durante a noite. As células foram, em seguida, tratado com 0,67? M de cisplatina. células tratadas com a droga e os seus comandos foram tripsinizadas e uma contagem de células realizada. As células foram então lavadas em 10 ml de PBS, centrifugada e o sobrenadante removido. O sedimento foi ressuspenso em 400 ul de tampão de ensaio frio enzima (100 mM de fosfato de potássio monobásico, EDTA 100 mM; pH 7,5). 16 ul de 25 × Inibidor de Protease Completo (Roche, Reino Unido) foi adicionado, e a amostra foi sonicada. Após centrifugação (13000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C) o sobrenadante foi recolhido e congelado a -80 ° C antes da análise
GSR -. GSR foram feitas padrões (Sigma) em tampão de diluição de glutationa redutase ( mM de fosfato de potássio monobásico 100; 100 mM de EDTA; 1 mg /mL de BSA, pH 7,5) variando de 0.3-0.0037 unidades /ml. 40 ul de cada amostra e padrão foram ensaiados em duplicado em placas de 96 poços. A mistura de reacção foi, em seguida, adicionado 160 uL de volume total (2 mM de glutationa oxidada (100 uL); DNTB 3 mM (50 ul); NADPH a 2 mM (10 mL)).
GGT1- Este método foi adaptado a partir de o método de Silber
et al
. [10]. normas GGT1 (Patricell, UK) foram preparados em água variando de 1000-1.6 unidades /L. 30 ul de cada amostra e padrão foi ensaiada em duplicado em placas de 96 poços. 100 ul mistura de reacção foi então adicionada (60 mM de gama-glutamil-p-nitroalinine (10 mL); glyclglycine 55,5 mM em 133,33 mM Tris pH 8.5 Base de dados (90 mL)).
Análise – As placas foram lidas a 412 nm (pré-aquecimento a 30 ° C) e 405 nm (pré-aquecimento a 37 ° C) durante GSR e GGT1 respectivamente, com medição de cinética por um leitor de placas tal como descrito para o ensaio de glutationa.
Western Blots
As células (1,25 × 10
6 células /placa de 10 cm) foram semeadas e autorizados a ligar durante a noite. As células foram, então, droga-tratados com cisplatina e crescidas durante 3 dias. As células foram ressuspensas em 100 ul de tampão de lise (Tris 0,01 M /HCl, pH 7,4) e sonicado. 20 ug de proteína foi diluído em tampão de amostra de Laemmli, fervidas durante 3 minutos, arrefecido em gelo e carregadas em géis de 12% Tris /glicina com um gel de empilhamento a 4%. As amostras e os marcadores de peso molecular foram então electrophoresised durante 90 minutos a 100 V. Os geles foram electrotransferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 um (Biorad) durante 90 minutos a 100 V, utilizando um sistema de transferência húmida (Biorad). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite não gordo desnatado (Biorad) em PBS durante 2 horas, em seguida, incubadas com o anticorpo primário preparado em 3% de leite desnatado /0,1% de Tween /PBS (Tabela 1) durante a noite a 4 ° C [11 ]. As membranas foram lavadas em 0,3% de Tween /PBS 3 x 10 minutos e, em seguida, incubadas durante 1 hora com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Tabela 1). As membranas foram lavadas novamente e expostos a reagente de luminol (Santa Cruz) ou ECL avançada reagente de transferência de Western (GE Healthcare). As membranas foram então expostos a filme de auto-radiografia. β-actina blots foram desenvolvidos utilizando um anticorpo de fosfatase alcalina (Tabela 1) e reagente Sigma fast BICP. A densitometria de um mínimo de n = 3 réplicas biológicas foi realizada utilizando Quantity One Software (Biorad), usando a correcção de fundo local. Abundância de proteína foi normalizada para ponceau para cada amostra e, em seguida, cada série biológica foi normalizado para IGROV-1.
microscopia confocal
As células (1,5 × 10
5 células /poço) foram plaqueadas em lâminas de câmaras de 8 poços e deixadas fixar durante a noite. Todas as lavagens com PBS e foram todas as incubações foram à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. As células foram lavadas duas vezes e fixadas com paraformaldeído a 4% (Sigma) em PBS durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram permabilised com 0,5% de Triton-X-100 (Sigma) durante 10 minutos e lavadas duas vezes. As células foram coradas com um /ml solução fluorescente TRITC 50 ug em PBS durante 40 minutos e depois lavou-se duas vezes. As células foram então incubadas com tampão de bloqueio (BSA a 0,02% em PBS) durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram então incubadas com anticorpo primário (Tabela 1) durante 2 horas numa atmosfera humidificada. As células foram então lavadas 3 vezes durante 5 minutos e incubou-se com anticorpo secundário (Tabela 1) durante 1 hora. As células foram então lavadas 3 vezes durante 5 minutos. As células foram então lamínulas utilizando meio de montagem contendo DAPI (Sigma) e armazenados a 4 ° C antes da microscopia. As imagens foram capturadas com uma ampliação x63 e × 1 zoom. Os exames foram realizados em 1 mm profundezas do intervalo através das células fixas e imagens singulares ou fundidas são apresentados tanto como XY planos individuais através da secção média das células ou vista ortogonal.
Análise Estatística
Todas as experiências foram realizadas no mínimo, em triplicado. De duas amostras, dois testes t de Student bicaudal foram utilizados para determinar diferenças significativas usando p 0,05. Como um corte
Resultados
Resistência taxano em IGROVCDDP é mediada pela glicoproteína-P
O IGROV-1 e IGROVCDDP foram analisadas para 380 genes associados com quimiorresistência por matriz TLDA, a fim de caracterizar os mecanismos de resistência de platina e taxanos. 145 genes foram consideradas significativamente diferentes entre IGROV-1 e IGROVCDDP baseado em um p 0,01 de corte. Os genes escolhidos para posteriores análises foram baseados no mais significativo por p-valor, bem como aquelas vias previamente associados com a resistência de platina e taxanos (Tabela 2). Todos os genes listados na Tabela Dois foram validados no nível de proteína por western blot.
A expressão do gene da P-glicoproteína (P-gp) está aumentada em IGROVCDDP (Tabela 2), e existe um aumento correspondente em a expressão da proteína (Figura 1A). Um tratamento de 3 dias com baixa dose de cisplatina tenderam a aumentar a expressão da P-gp em ambos IGROV-1 e IGROVCDDP mas esta não foi significativa (Figura 1A). P-gp também foi confirmado ser funcionalmente activa no IGROVCDDP com um ensaio de acumulação de epirrubicina (Figura 1B). As células IGROVCDDP têm níveis significativamente mais baixos de P-gp epirubicina substrato após uma exposição de 2 horas em comparação com IGROV-1. Quando IGROVCDDP foi tratado com 0,25? M de o elacridar inibidor da P-gp, que impede a acção da bomba de drogas [12], a massa acumulada de epirubicina e aumento foi significativamente maior do que a de células-mãe as IGROV-1. O aumento acima do nível de IGROV-1 é uma observação interessante, e pode ser devido às células IGROVCDDP sendo assim dependente de P-glicoproteína de efluxo de drogas; eles sofrem mais acúmulo de droga quando ela é inibida.
A) Western blot da P-glicoproteína, IGROV-1 (barras abertas) e IGROVCDDP (barras cinza) com e sem tratamento com 0,67 mM cisplatina por 72 horas (barras listrado). Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 6 repetições biológicas normalizado para p-actina. * Indica diferença significativa a partir de IGROV-1 p 0,05 teste t de estudante. B) Acumulação de epirubicina determinada por LC-MS. IGROV-1 (barras abertas) e IGROVCDDP (barras sombreadas). As células foram tratadas com 1 uM epirubicina durante 2 horas, 0,25 uM elacridar, 0,67 fiM, 3,33 uM ou 33,3 uM cisplatina foram investigados como moduladores da acumulação de epirrubicina. Gráfico mostra quantificação de n = 3 repetições biológicas normalizado para número de celular. * Indica uma diferença significativa entre IGROV-1 e IGROV-CDDP, # Indica uma diferença significativa sobre a adição de um modulador (p 0,05 teste t de Student). C) Citotoxicidade de IGROV-1 e IGROVCDDP para a P-glicoproteína e substratos não P-glicoproteina.
IGROVCDDP células foram rastreadas quanto à sua resposta a uma variedade de agentes quimioterapêuticos (Figura 1C). IGROVCDDP células são significativamente resistentes a substratos não-P-gp cisplatina e carboplatina [13]. IGROVCDDP também é significativamente resistente a substratos da P-gp [14]; taxanos, paclitaxel e taxotere, a antraciclina epirubicina e alcalóide vinca vinblastina. Em contraste, IGROVCDDP é hipersensível ao tratamento com substrato não-P-gp 5-FU [15]. IGROVCDDP é resistente ao metotrexato substrato MRP1 [14], mas não resistente ao substrato BCRP SN-38 (Figura 1C) [16]. O tratamento com 0,25 uM elacridar inverte significativamente a resistência das células IGROVCDDP para todos os substratos da P-gp, mas não a resistência à cisplatina, carboplatina e metotrexato. IGROVCDDP células também são mais sensíveis ao tratamento elacridar de IGROV-1 (Tabela 3). células IGROVCDDP diminuíram ARNm expressão da BCRP (Tabela 2) e que não é detectável por Western blot (dados não mostrados). Isto sugere que os efeitos de reversão observadas com o tratamento elacridar são específicos para a P-gp e não BCRP, que também inibe elacridar.
O impacto de co- ou pré-tratamento com cisplatina na citotoxicidade de paclitaxel foi investigada e nenhuma alteração significativa foi observada (dados não mostrados). Da mesma forma, co- ou pré-tratamento com paclitaxel não inverter a resistência a cisplatina (dados não mostrados).
resistência de platina está associado com uma mudança de captação intracelular de platina transportador CTR1 não resistência mediada por MRP2.
a) da citotoxicidade do IGROV-1 e IGROVCDDP para CuSO
4. B) ATP7A western blot. As barras abertas são IGROV-1, as barras sombreadas são IGROVCDDP e barras listradas indicam o tratamento com 0,67 uM de cisplatina durante 72 horas. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 4 repetições biológicas normalizado para p-actina. C) CTR1 western blot. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 3 repetições biológicas normalizado para p-actina. * Indica diferença significativa a partir de IGROV-1 p 0,05 teste t de estudante. microscopia confocal CTR1 em D) células IGROVCDDP IGROV-1 e E). planos XY são mostrados para DAPI (azul), Golgi (vermelho) e CTR1 (verde), uma imagem mesclada também é mostrada.
MRP2, um transportador que pode efluxo conjugados cisplatina, diminuiu a expressão do gene em IGROVCDDP (Tabela 2), mas não foi detectável por western blot em qualquer linha de células (dados não apresentados). Isto sugere que não existe qualquer papel do MRP2 transportador de efluxo de platina na resistência de platina de IGROVCDDP. transportadores de cobre também podem desempenhar um papel na captação de platina (CTR1) e de efluxo (ATP7A e ATP7B) [17]. Uma diminuição na expressão ou aumento da CTR1 ATP7A ou ATP7B poderia potencialmente mediar a resistência de platina. As células são IGROVCDDP 2,26 vezes mais resistente ao CuSO
4 (Figura 2A), sugerindo que o metabolismo do cobre pode desempenhar algum papel no mecanismo de resistência. Não houve alteração significativa na expressão de ARNm CTR1, ATP7A e ATP7B na matriz TLDA (dados não mostrados). a expressão da proteína ATP7A tenderam a aumentar em IGROVCDDP em resposta à cisplatina, mas esta mudança não é significativa (Figura 2B). No entanto, houve uma diminuição significativa na expressão CTR1, em resposta a tratamento medicamentoso cisplatina nas células IGROVCDDP (Figura 2C). CTR1 está presente na membrana celular em IGROV-1 e se desloca para o citoplasma intracelularmente em IGROVCDDP (Figura 2D, E). Há alguma associação de CTR1 com o Golgi em IGROVCDDP mas a coloração é consistente em todo o citoplasma.
Transportar como biomarcadores da Platinum Acumulação Defeito
Um dos mais genes diferencialmente expressos significativas na IGROVCDDP foi uma diminuição na expressão da na
+ /K
+ bomba (ATP1A1) (Tabela 2), que foi previamente associada com defeitos de acumulação de platina [18]. A cisplatina não é transportado por ATP1A1 e potencial de membrana alteradas podem desempenhar um papel na acumulação passiva do fármaco. Houve um correspondente decréscimo na expressão da proteína de ATP1A1 (Figura 3A) e também uma sensibilidade ao tratamento com o inibidor da ouabaína ATP1A1 [19] (Tabela 3). No entanto, quando a 0,01 nM ouabaína foi co-incubado num ensaio de cisplatina citotoxicidade em vez de inverter a resistência em IGROVCDDP diminuiu o IC
50 de ambas as células de IGROV-1 e IGROVCDDP igualmente, a resistência de dobragem entre as duas linhas de células permaneceram constante (Tabela 3). IGROVCDDP não era resistente à NaCl ou KCl como agentes isolados e a adição de 40 mM de estes sais não alterou significativamente a citotoxicidade de cisplatina (dados não mostrados).
As barras abertas são IGROV-1, as barras sombreadas são IGROVCDDP e barras listradas indicam o tratamento com 0,67 mM cisplatina durante 72 horas. A) ATP1A1 western blot. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 4 repetições biológicas normalizado para p-actina. B) MRP1 western blot. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 3 repetições biológicas normalizado para p-actina. * Indica diferença significativa a partir de IGROV-1 p 0,05 teste t de estudante. microscopia confocal MRP1 em C) células IGROVCDDP IGROV-1 e D). imagens ortogonais são mostrados para uma imagem mesclada de DAPI (azul) e MRP1 (verde), setas nas barras laterais indicam a apical (IGROV-1) e localização basolateral de MRP1 (IGROVCDDP). microscopia confocal FBP em E) células IGROV-1 e F) IGROVCDDP. planos XY são mostrados para DAPI (azul), actina (vermelho) e FBP (verde), uma imagem mesclada também é mostrada.
A pesquisa precedente tem expressão diminuída mostrada e uma mudança intracelular de proteínas de membrana MRP1 e FBP para ser associado com um defeito na acumulação de platina em linhas de células resistentes à cisplatina [20]. Portanto nós examinamos MRP1 e FBP como potenciais biomarcadores de um defeito na acumulação de platina no IGROVCDDP. As células IGROVCDDP ter uma diminuição na expressão do mRNA da MRP1 (Tabela 2), bem como uma pequena diminuição na expressão da proteína MRP1 em resposta ao tratamento com cisplatina (Figura 3B). distribuição MRP1 foi examinada por microscopia confocal (Figura 3C e D). A coloração em ambas as linhas celulares IGROV-1 e IGROVCDDP é evidente no citoplasma e na região perinuclear com algumas acumulações de MRP1 aparente. Em IGROV-1 há mais de MRP1 acima e ao longo da linha azul na vista ortogonal indicando que está no lado apical e secção média nas células. Uma maioria de coloração em IGROVCDDP está abaixo da linha azul é basolateralmente localizado. FBP localiza-se principalmente ao lado do núcleo no interior de vesículas subcelulares discretas; pouca coloração citoplasmática é evidente (Figura 3E, F). Não há nenhuma mudança na distribuição celular da FBP entre IGROV-1 e IGROVCDDP, mas uma diminuição na expressão de FBP em IGROVCDDP resulta das imagens confocal.
bares abertos são IGROV-1, barras sombreadas são IGROVCDDP e barras listradas indicam o tratamento com 0,67 uM de cisplatina. Um) de glutationa intracelular total. Gráfico mostra n = 3 repetições biológicas normalizados para número de celular. B) γGCS western blot. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 4 repetições biológicas normalizado para p-actina. C) western blot GSR. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 3 repetições biológicas normalizado para p-actina. D) Ensaio de enzima GSR. Gráfico mostra n = 4 repetições biológicas normalizados para número de celular. E) GGT1 western blot. Imagem representativa mostrado Gráfico mostra quantificação de n = 3 repetições biológicas normalizada para p-actina. E) GGT1 ensaio de enzima. Gráfico mostra n = 4 repetições biológicas normalizados para número de celular. * Indica diferença significativa a partir de IGROV-1 p 0,05 teste t de estudante. # Indica diferença significativa a partir de IGROVCDDP sobre a adição de cisplatina. G) Modulação da citotoxicidade de cisplatina de IGROV-1 e IGROVCDDP com BSO.
resistência de platina em IGROVCDDP está associada a um aumento nos níveis de glutationa Reciclagem não Aumento da síntese de novo
A expressão de mRNA redutase da glutationa (GSR) e gama-glutamil-transpeptidase (GGT1) aumentaram ambas significativamente no IGROVCDDP (Tabela 2). funções GSR para reciclar glutationa oxidados dentro da célula [21], [22] e recicla GGT1 glutationa a partir do lado de fora da membrana celular [21], [22]. A expressão da proteína de GSR e GGT1 não estavam aumentados nas células IGROVCDDP, GSR foi significativamente diminuído em IGROVCDDP e não houve alteração na GGT1. (Figura 4A e 4B). No entanto, a actividade da enzima de ambos GSR e GGT1 foram significativamente aumentados (Figura 4C e a Figura 4D); sugerindo que a glutationa é ser reciclado mais interior e do exterior da célula.
bares abertos são IGROV-1, barras sombreadas são IGROVCDDP e barras listradas indicam o tratamento com 0,67 mM cisplatina durante 72 horas. A) BRCA1 western blot. Imagem representativa mostrado. O gráfico mostra a quantificação de n = 4 repetições biológicas normalizado para p-actina. * Indica diferença significativa do IGROV-1 p . Teste t de 0,05 aluno
células IGROVCDDP não têm níveis mais elevados de glutationa, e os níveis não são aumentados com o tratamento com cisplatina de baixo nível (Figura 4E) . Os níveis de glutationa também foram mais variáveis nas células IGROVCDDP. O tratamento com 12,5 uM butathione sulfoximina (BSO), um inibidor de γGCS [23] diminuiu significativamente glutationa celular, tanto no IGROV-1 e células IGROVCDDP (dados não mostrados). IGROV-1 e IGROVCDDP também têm expressão de proteína semelhante de γGCS e não é regulado positivamente em resposta ao baixo nível de tratamento com cisplatina (Figura 4F). tratamento BSO também sensibilizados significativamente ambas as linhas de células à cisplatina (Figura 4G). No entanto, o efeito foi equivalente e a resistência à cisplatina dobra permaneceu constante (18,76 vezes). As células IGROVCDDP tendem a ser mais sensíveis ao tratamento BSO sozinho em um ensaio de citotoxicidade, no entanto, este não foi significativa (Figura 4G).
IGROVCDDP Aumentou BRCA1 Expressão
O aumento da expressão de o gene BRCA1 de reparo do DNA tenha sido previamente associadas à resistência a cisplatina [24]. células IGROVCDDP aumentaram mRNA (Tabela 2) e expressão da proteína BRCA1 (Figura 5A).
Discussão
P-gp superexpressão é incomum em um modelo de resistência adquirida Cisplatina
a resistência ao paclitaxel em células IGROVCDDP é mediada por uma sobre-expressão de P-gp em do gene (Tabela 2) e o nível de proteína (Figura 1A). P-gp tem mostrado ser funcionalmente activa por ensaios de citotoxicidade (Figura 1C) e ensaios de acumulação de epirrubicina (Figura 1B). Em contraste com outros estudos [25], o tratamento com cisplatina a curto prazo não modular a expressão de P-gp proteína, actividade ou citotoxicidade de taxano em células IGROVCDDP (Figura 1A, 1B, dados não mostrados). É invulgar mas não sem precedente para ver um modelo de resistência adquirida cisplatina sobre-expressam P-gp (Tabela 4) [26] – [30]. Isto provavelmente representa uma resposta de stress generalizado para o tratamento com cisplatina a longo prazo como a cisplatina não é um substrato de P-gp [13]. P-gp pode ser regulado para cima como parte de uma resposta ao aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro de uma célula [31]. Isto pode ser porque a expressão da P-gp foi induzida em IGROVCDDP como ROS são também produzidos em resposta à cisplatina [32]. No entanto, como as células IGROVCDDP são cultivados sem cisplatina na mídia, não parece haver qualquer outro estímulo que favorece a expressão da P-gp ou P-gp é proporcionar uma vantagem selectiva a IGROVCDDP células.
Muitos modelos de resistência adquirida aos fármacos terá a sobreexpressão de um transportador que efluxos o fármaco que foi usado para desenvolver o modelo. Colchicina, um substrato P-gp [33] selecionada para superexpressão P-gp em células KB-8-5-11 [34] e epirubicina, um substrato MRP1 [35] A expressão de MRP1 induzida em CCRF-CEM /E1000 [36]. No entanto, metotrexato, fluorouracilo, clorambucil, cisplatina, hidroxiureia e têm sido mostrados para induzir de forma transiente a expressão de P-gp em células de leucemia K562 quando estas drogas não são substratos da P-gp [15]. Cabe então à seleção natural, se as células que expressam transitoriamente P-gp têm qualquer outra vantagem de sobrevivência e tornar-se parte da linha de células resistentes aos medicamentos. Em alguns modelos resistentes à cisplatina que sobre-expressam P-gp, o P-gp tem qualquer vantagem de sobrevivência, como não é funcionalmente activo (SNU-601 /Cis10 – Tabela 4) [29]. Dentro de linhas celulares que sobre-expressam P-gp resistente a cisplatina também pode haver heterogeneidade; em SKOV3 /CIS P-gp populações positivas e negativas foram mantidas após o tratamento com cisplatina, indicando que P-gp não tem nenhuma vantagem de sobrevivência para o tratamento com cisplatina [27]. No entanto, o P-gp pode ter efeitos anti-apoptóticos distintas das que estão associadas com o transporte de drogas citotóxicas, e alguns podem ser mediadas através de efluxo de glucosilceramida pró-apoptótica [37], [38]. É também possível que algumas apresentam agroquímicos no FCS utilizado para cultivar as células pode auxiliar na manutenção da expressão da P-gp em IGROVCDDP.
IGROVCDDP é o único modelo resistente a cisplatina desenvolvido a partir de IGROV-1 conhecido para sobre-expressar P-gp e, consequentemente, têm um fenótipo de platina /resistente a taxano. modelos resistentes à cisplatina IGROV-1 /Pt0.5 e IGROV-1 /Pt1 [39] tem o fenótipo inversa platina /resistente a taxano. Outros modelos IGROV-1 resistentes à cisplatina têm sido desenvolvidos (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), mas eles não parecem ter sido examinados para resistência a substratos gp-P ou expressão P-gp. No entanto, P-gp não foi identificado como diferencialmente expressos pelo perfil genômico ou proteômica [40] – [44].
Resistência Platinum é multifatorial
resistência Platinum nas células IGROVCDDP é multifatorial e envolve a via de glutationa e diminuiu a acumulação de fármaco. Isto poderia resultar quer de uma via reguladora complexo que controla diversos mecanismos diferentes para conferir resistência a cisplatina, ou pode reflectir o facto de que as células foram seleccionadas em várias etapas e, por conseguinte, pode ter acumulado mecanismos diferentes em cada passo.
células IGROVCDDP são resistentes de baixo nível para CuSO
4 sugerindo um papel do transporte de cobre na resistência de platina (Figura 2A).