Abstract

O câncer de ovário (OVCA) é a quinta causa mais comum de morte por todos os cânceres entre as mulheres em Estados unidos e a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas. Embora a maioria dos pacientes OVCA respondem inicialmente a citorredução cirúrgica e quimioterapia, 75% dos pacientes depois sucumbir à doença. Assim, existe uma necessidade urgente para testar novos agentes terapêuticos para neutralizar a elevada taxa de mortalidade associada com OVCA. Neste contexto, desenvolveram-se e engenharia Nanoceria (NCE), nanopartículas de óxido de cério, possuindo propriedades anti-oxidante, para ser usada como um agente terapêutico em OVCA. Nós mostramos pela primeira vez que NCE produção significativamente inibido de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em células A2780, fator de crescimento atenuado (sdf1, HB-EGF, VEGF

165 e HGF) mediada migração celular e invasão das células SKOV3, sem afectar a proliferação celular. tratamento NCE também inibiu VEGF

165 induziu a proliferação, a formação do tubo capilar, a activação de VEGFR2 e MMP2 em células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC). NCE (0,1 mg /kg de peso corporal) tratamento de células de cancro do ovário A2780 injectadas intraperitonealmente em ratinhos nus mostraram uma redução significativa (p 0,002) no crescimento do tumor acompanhada pela diminuição da proliferação de células tumorais, como é evidente a partir do tamanho do tumor reduzido e coloração de Ki67. A acumulação de NCE foi encontrada em tumores isoladas do grupo tratado por meio de microscopia electrónica de transmissão (TEM) e espectroscopia de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS). A redução da massa do tumor foi acompanhada pela atenuação da angiogénese, tal como observado por coloração de CD31 reduzida e apoptose específica de células endoteliais vasculares. Colectivamente, estes resultados indicam que, com base de óxido de cério é um romance NCE nanopartículas que podem potencialmente ser usado como um agente terapêutico anti-angiogénico no cancro do ovário

citação:. Giri S, Karakoti A, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, fecho S, et al. (2013) Nanoceria: A-Rare Earth nanopartículas como um Novel Anti-angiogénicos agente terapêutico no cancro do ovário. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10.1371 /journal.pone.0054578

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2011; Aceite: 13 de dezembro de 2012; Publicação: 31 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Giri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é apoiado principalmente por CA123249 e apoio da Mayo Clinic College of Medicine para VS e parcialmente apoiada por Marsh Rivkin concede a SG e RR. Este trabalho foi parcialmente financiado pela NSF CBET, 0708172 e 0930170 para SS (para o desenvolvimento de nanopartículas em aplicações biomédicas). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos Estados Unidos, 27.000 mulheres são diagnosticadas e cerca de 14, 000 mulheres morrem de OVCA anualmente [1]. Tais taxas de mortalidade elevadas são devidos a maioria dos pacientes (75%) apresentando avançado (fase III ou superior) doença no momento do diagnóstico [2]. Mais de 90% dos pacientes têm melhor prognóstico se o cancro for detectado na sua fase inicial. O tratamento do cancro de ovário epitelial envolve geralmente a citorredução cirúrgica seguida pela quimioterapia com uma combinação de platina e um agente contendo taxano. No entanto, a maioria dos pacientes se repetem e, finalmente sucumbir ao seu câncer. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver novas terapias que podem ser mais eficazes no tratamento do cancro do ovário e retardar ou prevenir recidivas. Os novos tratamentos que visam tumorigênese ovário amplamente estão sendo pesquisados, mas ainda temos de chegar a uma droga promissora.

ferramentas e técnicas baseadas em nanotecnologia estão a emergir rapidamente nas áreas de imagiologia médica e orientada entrega da droga. óxido de cério é um óxido de terras raras, que é encontrada na série dos lantanídeos da tabela periódica. óxido de cério nanocristalino (nanoceria) apresenta um deslocamento para o azul no espectro de absorção ultravioleta, o deslocamento e ampliação de Raman permitiu modos e expansão da estrutura, em comparação com óxido de cério granel indicando suas propriedades únicas. NCE emergiu como um material lucrativo em ciências biomédicas devido à sua capacidade única para alternar entre os estados de oxidação (III) e (IV) dependendo do ambiente. A capacidade de alternar entre estados de oxidação mistos de nanoceria é comparável com antioxidantes biológicos. Isto dá nanoceria com uma propriedade biológica muito importante de eliminação de radicais que podem ser ajustados com base na retenção de vacâncias de oxigênio (defeitos) e concentração de Ce3 espécies + em nanoceria. A reversibilidade do estado de oxidação é a propriedade chave para tornar nanoceria um potente antioxidante, reduzindo deste modo a necessidade de uma dosagem repetida frequente. Estudos anteriores demonstraram que as nanopartículas de óxido de cério possuem excelentes propriedades antioxidantes e actuam como potentes, regenerativos varredores de radicais livres em sistemas biológicos [3], [4], [5]. Estas propriedades antioxidantes regenerativos são devidos, em parte, para a estrutura de valência do átomo de cério combinado com defeitos inerentes na estrutura de rede cristalina, as quais são ampliados à escala nano. Tem sido sugerido que a estrutura original de nanopartículas de óxido de cério modificadas no que respeita aos defeitos de valência e de oxigénio, promove a longevidade celular e diminui insultos tóxicos em virtude dos seus efeitos antioxidantes que ocorrem quando as nanopartículas de entrar nas células [6], que impedem a acumulação de espécies de oxigénio reactivas (ROS) na célula [3].

angiogénese tumoral é caracterizada pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma irregular rede vascular pré-existente. Este angiogénese anormal é necessário para o crescimento, a sobrevivência e metástases de tumores sólidos maioria [7], [8]. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos mais importantes factores pró-angiogénicos, que actua como um agente mitogénico para células endoteliais vasculares in

in vitro

e como um factor angiogénico

In vivo

[9 ]. É mais expressos em vários cancros humanos [10], [11], [12], [13] incluindo OVCA. Recentemente, tem sido sugerido que as ROS desempenha um papel importante na regulação do tumor angiogénese induzida por controlo da produção de VEGF. aumento da produção de VEGF tem sido demonstrado estar correlacionado com um mau resultado para pacientes com ambos OVCA precoce e avançado. Vários agentes anti-angiogénicos foram e são submetidos a avaliações nos ensaios clínicos de cancro do ovário. Um estudo de fase II de bevacizumab com agente único (um anticorpo monoclonal dirigido contra o VEGF) mostraram resultados promissores [14]. Portanto, a sinalização VEGF está se tornando o foco da terapia anti-angiogénico-alvo de OVCA.

No presente estudo, nós testamos nanopartículas de óxido de cério como um agente terapêutico ambos

em

vitro

e

in vivo

em células OVCA. Os nossos dados demonstram que NCE foi capaz de inibir o factor de crescimento mediado, migração e invasão de células SKOV3, VEGF

165 induziu a proliferação, a formação do tubo capilar e a activação de VEGFR2 e MMP2 em células HUVEC. Mais importante do tratamento NCE crescimento do tumor inibida

in vivo

por inibir a angiogênese, especificamente alvejando células endoteliais vasculares.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

azul de tripano, MTT brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio) e HB-EGF foram da Sigma. SDF1, VEGF

165 e HGF foram adquiridos a partir de R D Systems (MN, USA). anticorpos de Ki-67 e VEGF eram de Dako (Glostrup, Dinamarca) e Abcam (MA, EUA), respectivamente. CD31 (PECAM) foi da Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA).

Cultura celular

humano linha celular de cancro do ovário SKOV3 e HUVEC foram da American Type Culture Collection. linhas celulares A2780 e C200 foram um presente amável do Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center). OVCA linhas celulares foram mantidas e cultivadas em meio RPMI completo contendo 10% de FBS, antibióticos. As células HUVEC foram mantidas em EBM-2 media comprados a partir de Lonza (Dinamarca).

nanopartículas síntese |

nanopartículas de óxido de cério foram preparados por síntese química molhada como descrito anteriormente [15], [16], [17]. Resumidamente, hexa-hidrato de nitrato de cério foram dissolvidos em água desionizada e, em seguida, filtrada utilizando um filtro de 200 nm, para se livrar de quaisquer partículas em suspensão livremente. Os iões de cério contendo solução foi depois oxidado com peróxido de hidrogénio e hidróxido de amónio. O pH da solução foi ajustado entre 3,5-4,0 usando ácido nítrico ou hidróxido de amónio. Todos os utensílios de vidro foram autoclavados antes de ser utilizado para a síntese. O pH e o potencial zeta da suspensão foi monitorizada como a solução foi deixada envelhecer à temperatura ambiente durante vários dias seguintes, até a formação de nanopartículas com predominantemente Ce

3+ concentração foi observada utilizando espectrofotometria de UV-Visível.

nanopartículas Caracterização

Mudança nos estados de oxidação das nanopartículas como preparadas em solução foi monitorado usando espectrofotometria de UV-visível. Alíquotas da amostra-mãe foram colhidas para medições de absorvância utilizando Perkin Elmer 750 S espectrofotómetro. A distribuição morfologia e tamanho de partícula foi estudado utilizando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM). O tamanho das nanoparticulas em solução, como preparado antes da sua utilização em

In-vitro

e

in vivo

estudos foi também monitorizada usando dispersão dinâmica de luz (DLS). Os estados de oxidação do cério inthe partículas foram confirmados usando raios-X espectroscopia de fotoelétrons (XPS). Para alta resolução Microscopia Eletrônica de Transmissão (HRTEM) uma gota de suspensão de nanopartículas foi escalado na grelha de cobre revestido de carbono. As imagens HRTEM das partículas como preparados foram obtidos com um Philips (Tecnai Série) operado a 300 keV. Os dados de XPS foram obtidos utilizando um espectrómetro de 5400 PHI ESCA (XPS). As amostras foram gota fundido sobre uma bolacha de silício e secou-se dentro de uma caixa de luvas de azoto para evitar a oxidação de cério de oxigénio atmosférico e usando transferido de uma câmara de transferência de amostras, sem expor as amostras para a atmosfera. Apenas scans limitados foram obtidos para evitar danos de raios-x de cério. Uma varredura inicial foi salvo separadamente para comparar com os resultados da verificação 5 combinadas e não mostrou nenhuma diferença no Ce

3 + /Ce

4+ ratio. A pressão de base durante a análise XPS foi de 10

-9 Torr e Mg-K

radiação α

de raios-X (1253,6 eV) a uma potência de 200 W foi usado como fonte de raios-x. A energia de ligação de Au (4-F

7/2) a 84,0 ± 0,1 eV foi usada para calibrar a escala de energia de ligação do aparelho. Qualquer mudança de carga produzidas no espectro foi corrigido fazendo referência à posição C (1 s) a (284,6 eV) [13]. XPS espectros de alisamento e subtracção da linha de base foi realizada utilizando software PeakFit (4 Version).

migração e invasão Ensaios

células SKOV3 foram cultivadas em meio isento de soro durante a noite. A migração celular e invasão foram medidos tal como descrito [18], com modificações. Resumidamente, suspensões de células (500 ul, 2,5 × 10

4 células) foram semeadas sobre o topo de (ensaio de migração) revestido e não revestido Matrigel (ensaio de invasão placas Transwell) (diâmetro do poro de 8 uM; BD Biosciences). As suspensões de células (500 ul) isento de soro foram adicionadas à câmara superior do Transwell. As câmaras inferiores continha meio livre de soro contendo vários factores de crescimento incluindo SDF1, HB-EGF, VEGF

165 e o HGF na concentração de 25 ng /ml. Células invasoras da câmara inferior foram corados com 0,5% de violeta de cristal (60% de PBS, 40% de EtOH) e contados com um microscópio invertido. Os resultados de pelo menos duas experiências independentes em triplicado são apresentados

Proliferação Ensaios

ensaio

(i) MTT:.

2,5-5,0 × 10

4 células foram plaqueadas em placas de 24 poços em triplicado e foi tratada com concentrações indicadas de NCE durante 72 h. ensaio de MTT foi realizado como descrito anteriormente [19], para determinar o número de células vivas.

(ii) a incorporação de timidina:

A proliferação de células foi também determinada por [

3H] -timidina no ADN, tal como descrito antes [20]. Em breve, 2,5-5,0 × 10

4 células foram plaqueadas em placas de 24 poços em triplicado e foi tratada com concentrações indicadas de NCE durante 72 h. Cada grupo foi tratado com 1 ^ Ci de [

3H] timidina no mesmo meio durante 6 h. As células aderentes foram fixadas com ácido tricloroacético a 5% e lisaram-se em tampão de lise de SDS /NaOH. A radioactividade foi medida por contador Beckman LS3801 líquido de cintilação (Canadá).

Ensaio de Formação de Colónias

2000 células foram plaqueadas em triplicado em placas de 6 poços e tratadas com as concentrações indicadas de NCE. As células foram deixadas a formar colónias por até 2-4 semanas (dependendo da linha celular) e o meio foi substituído a cada quatro dias. As colónias foram coradas com MTT e contadas como descrito anteriormente [19].

Medição de ROS

ROS foi determinada utilizando a membrana permeável ao corante fluorescente 6-carboxi 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) em meio isento de soro como descrito anteriormente [21], [22]. As células de cultura, com ou sem tratamento com NCE, foram tratadas com 5 uM DCF corante em PBS e as alterações na fluorescência foi registado com excitação a 485 nm e de emissão de 530 nm para diferentes período de tempo de 10 a 60 min, utilizando um pro espectrofluorómetro macio Max ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

análise de imunotransferência

Após o tempo estipulado de incubação na presença ou ausência de quantidades indicadas de NCE, análise de imunotransf erência com anticorpos específicos foi efectuado tal como anteriormente descrito [19 ], [20], [21], [22]. Em células HUVEC breves, tratados e não tratados com VEGF

165 (25 ng /ml) e /ou em vários NCE período de tempo (5-30 min) foram lisadas em tampão de lise (Tris-HCl a 50 (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 mM e 0,5% de 40 ug de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose de Nonidet P-40] contendo um cocktail inibidor de protease (Sigma).. A membrana foi então bloqueada durante 1 h em 5% TTBS leite em pó desnatado (Tris 20 mM, NaCl 500 mM e 0,1% de Tween 20, pH 7,5) e incubadas durante a noite em anti-soros primários (pVEGFR (Y1175), pVEGFR (Y951), VEGFR2 ou actina β) contendo 5% de leite em pó desnatado ou BSA a 5% no caso de fosfo-anticorpos. Após a incubação com Ab secundário conjugado com HRP, blots foram desenvolvidos com um sistema de detecção de ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

em formação do tubo vitro Vascular Ensaio

In vitro

ensaios de formação do tubo foram realizados como descrito por Melinda

et. al.

[23]. Em resumo, a matriz matrigel foi uniformemente banhado sobre lâminas de câmara de 8 poços (0,15 ml) e incubou-se a 37 C durante 30 min. 2 × 10

5 /ml de células HUVEC foram tratadas com NCE (25-50 uM) e misturou-se com as células na presença ou ausência de VEGF

165 (25 ng /ml) e transferido para cada poço (200 ul ) revestido com matrigel. As placas ou lâminas foram incubadas a 37 ° C durante 16 h e fotografada com um microscópio invertido de contraste de fase pelo aumento de 10x objectivo.

zimografia Ensaio

Para a actividade de MMP2, as células HUVEC foram tratadas com VEGF

165 (25 ng /ml) na presença ou ausência de NCE (25-50 uM). Pós 18 h, o sobrenadante celular foi recolhido, centrifugado a 12000 g e 25 ul de volume foi misturado com 5 × tampão de carga de SDS sem agente redutor e correu em 10% de gelatina contendo gel de Tris-glicina. Gel foi lavado duas vezes durante 1 h com uma solução de renaturating (2,5% tritonX100 em Tris 50 mM, pH 7,4, CaCl 5 mM, ZnCl2 a 1 mM) para remover o SDS e renaturar MMPs. Depois de se enxaguar o gel com água desionizada, gel foi incubado durante a noite a 37 ° C com tampão contendo Tris 50 mM, pH 7,4, CaCl 5 mM, ZnCl 1

2. No dia seguinte, gel foi corado com 0,5% de Coomassie G250 seguido pelo de-coloração para ver a atividade MMP2 em gel.

Animais

declaração

Ética.

6-8 semanas de idade ratinhos nus femininos foram adquiridos a partir da Cancer Research Cancer Institute-Frederick e Desenvolvimento Centro Nacional (Frederick, MD). Todos os ratos foram alojados e mantidos em condições específicas em instalações da Clínica Mayo de Rochester, MN. As instalações são aprovados e inspecionados pela Associação Americana de Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC acreditação # 000717) e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura dos EUA, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, e NIH EUA atuais. Todos os estudos foram aprovados e supervisionados pela Institutional Animal Care e Use Committee da Mayo Clinic (IACUC), sob o número de protocolo A11309. Após a indução do tumor, os ratinhos foram monitorizados diariamente para sinais de qualquer sofrimento. exames regulares de saúde também são realizados pelo pessoal veterinário Mayo. Os ratos foram humanamente sacrificados quando a carga tumoral atingiram o peso mandato em camundongos não tratados.

Os ratos foram mantidos de acordo com o protocolo institucional IACUC-aprovado. 2 × 10

6/200 ul de células suspensas em PBS foram injectadas na cavidade intraperitoneal (dia 0) de 6-7 semanas de idade ratinhos nus, como descrito anteriormente [24]. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos. NCE tratamento na dose de 0,1 mg /kg de peso corporal começou 3 dias após a inoculação das células e foi dada intraperitonealmente a cada 3

dias Rd até final do estudo. O grupo controle recebeu injeções de PBS. Os ratinhos foram sacrificados a 4 semanas e os tumores foram fixadas em formalina para seccionamento. O sangue foi recolhido em tubos revestidos de heparina para obter plasma. Fígado, rim, coração e baço de todos os animais foram fixadas em formalina e processados. Um slide tumor e órgão de cada ratinho foi corada com H . E

Os ensaios de citotoxicidade

O sangue foi recolhido em tubos revestidos de heparina pouco antes de ratos foram sacrificados.. O plasma separado a partir de sangue de seis murganhos de cada grupo foi submetido a análise de um painel de testes da função hepática (aspartato aminotransferase; alanina aminotransferase; albumina) e testes de função renal (creatinina, ureia, albumina) como descrito anteriormente [24]. Todos os ensaios foram realizados utilizando kits de Bioensaio seguintes sistemas de instruções do fabricante (CA, EUA).

Determinação de NCE em tecidos.

No final do estudo, incluindo vários tecidos de tumor, do fígado , baço e rim de NCE grupo tratado foram colocados em ácido nítrico a 70% durante a noite para iniciar o processo de digestão. As amostras foram, em seguida, digerido microondas. A temperatura foi aumentada até 200 ° C ao longo de 20 min e manteve-se durante mais 20 min. As amostras foram, em seguida, fervida para baixo para menos de 1 ml de cada vez e reconstituída em água para um volume exacto de 10 ml. níveis de cério foram avaliadas utilizando espectroscopia de massa acoplada indutivamente de plasma (ICP-MS), tal como descrito antes [25].

Para a microscopia electrónica de transmissão (TEM), tumor do ovário isolados a partir de ratinhos tratados com NCE foram fixados em fixador de Trump (1 % de glutaraldeído e formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2). Tumor foi incluído em resina de Spurr e finas (90 nm) As secções foram cortadas num ultramicrotomo Reichert Ultracut E, colocadas em grelhas de cobre de malha 200 e coradas com citrato de chumbo. Micrografias foram tiradas em um Tecnai 12 operando em 120kV.

IHC.

tumores fixos excisadas de ratos foram processadas para imunohistoquímica para CD31, Ki-67 e TUNEL (Millipore) como descrito anteriormente [24 ]. H E foi realizada a coloração por imuno-histoquímica Mayo instalações do núcleo. Ki-67 e H E secções foram examinadas ao microscópio de luz e pictogramas representativos foram tomadas a partir de 5 lâminas diferentes de cada grupo. Para a coloração de CD31, utilizou-se anticorpo secundário marcado com TRITC-e visualizada utilizando microscopia fluorescente. Para a coloração dupla, as lâminas foram primeiro processados ​​para coloração CD31 seguido por imunofluorescência TUNEL, de acordo com as instruções do fabricante.

medições do tumor Live.

O diâmetro máximo de tumor viável foi calculada pela RPG pela soma o maior diâmetro uni-dimensional de cada fragmento de tumor usando a Olympus BX-41 microscópio e um micrômetro. Do mesmo modo, as áreas necróticas foram medidos e o tamanho do tumor ao vivo composto foi calculada a partir de cada lâmina.

formação do tubo endotelial.

Para examinar o efeito de NCE na formação do tubo em células HUVEC, matriz de matrigel foi uniformemente plaqueadas em lâminas de câmaras de 8 poços (0,15 ml) e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. As células HUVEC foram contadas e diluídas até 2 x 10

5 /ml em meio. As células foram tratadas com NCE (25-50 uM) foi misturada com as células na presença ou ausência de VEGF

165 (25 ng /ml) e transferido para cada poço (200 ul) revestido com matrigel. As placas ou lâminas foram incubadas a 37 ° C durante 16 h e fotografada com um microscópio invertido de contraste de fase a 10 × ampliação objectivo.

Análise estatística.

Os dados foram analisados ​​estatisticamente por meio de dois teste t de Student atados (Prism). *** P 0,001; ** P 0,01, * P 0,05; NS:. Não é significativo em comparação com não tratada

Resultados

Síntese e Caracterização de cério nanopartículas de óxido de

nanopartículas de óxido de cério utilizados neste estudo contém cristais individuais de 3-5 nm que são frouxamente aglomeradas para 15-25 nm. À medida que o processo de síntese é livre de qualquer agente tensioactivo orgânico, a aglomeração difícil de nanopartículas é controlada através do controlo apertado do pH das nanopartículas inferior a 3,5, durante a síntese para mantê-los na gama coloidal. As nanopartículas podem ser diluídas em meios aquosos ou celulares após a síntese. Figura 1 A e B mostra a resolução micrografias eletrônicas de transmissão elevadas (HRTEM) de nanopartículas NCE. É evidente a partir da imagem que nanopartículas são fracamente aglomeradas para cerca de 15-25 nm agregados que também poderia ser induzida pelo processo de secagem. O raio hidrodinâmico (37,8 ± 0,8 nm) a partir da distribuição multimodal de tamanho (volume%) análise de medições DLS está de acordo com o tamanho do aglomerado solto da análise HRTEM. Imagem de alta ampliação confirma os planos da rede de NCE em 3-5 crystallites nm individuais. espectroscopia de UV-Visível foi utilizado para analisar os estados de oxidação de nanopartículas de óxido de cério antes e após o tratamento de envelhecimento. A Figura 1 mostra o espectro de UV-Visível de nanopartículas frescos e envelhecidos de óxido de cério, indicando claramente a predominância de Ce

3 estado de oxidação a partir do pico de absorção a 252 nm em comparação com o pico de absorção a 298 nm para Ce

4+ . A confirmação adicional sobre os estados de oxidação de nanopartículas foi obtido a partir de análise de XPS. O espectro XPS de cério é muito complexo que contém vários picos do acoplamento spin órbita de orbitais 3d [26]. Vários picos na região de Ce3d que têm sido atribuídas a 3d

3/2 (899,5, 900,9, 903,5, 906,4 e 916,6) e 3d

5/2 (880,2, 882,1, 8885, 888,1 e 898) decorrentes de múltiplos estados de valência de cério. O espectro de NCE mostra uma predominância de cério no estado de oxidação +3 como representado pelos picos característicos em 880,2, 885,0, 899,5 e 903,5 eV. Tomados em conjunto os dados de caracterização de NCE é consistente com relatórios anteriores em que o cério pode ser retida na oxidação trivalente, diminuindo o tamanho das nanopartículas [15], [16], [17], [26].

alta resolução micrografias eletrônicas de transmissão mostram a presença de um aglomerados soltos de 15-20 nm a baixa ampliação B individuais 3-5 crystallites nm. O espaçamento d de 0,31 nm mostra a presença de aviões de ceria enquanto o padrão selecionado difração de elétrons área (SAED) confirma a presença de estrutura fluorite de óxido de cério. A tendência no estado de oxidação de nanoceria em C mostra que as nanopartículas têm sintetizados predominância de estado de oxidação trivalente, que sofre uma transformação lenta a Ce

3 estado de oxidação durante um período de 28 dias de raios-X D espectro fotoeletrônico a partir de uma referência céria amostra em que o cério é predominantemente no estado de oxidação 4 é comparado com o espectro de uma amostra de 4 semanas nanoceria demonstrando a elevada concentração de Ce em estados de oxidação +3 envelhecida. E. basais níveis de ROS na linha de células de cancro do ovário. As células A2780 foram tratados com NCE (50-100 uM) durante 48 h. As células foram lavadas com PBS e carregada com DCF-DA corante (5 uM) e a fluorescência foi registado com excitação a 485 nm e emissão 530 nm durante vários períodos de tempo (5-60 min). Os poços contendo apenas células sem DCFDA corante (cruz) ou sem células contendo corante DCFDA (preenchido diamante) foram utilizados como branco. gráfico F. Bar representa níveis de ROS no 60 min do tratamento com DCF-DA corante. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de 4 amostras. *** P 0,001 NCE a 100 uM; * P . 0,05 NCE comparação com células não tratadas usando bicaudal teste t de Student (Prism)

NCE Tratamento inibe a produção de níveis de ROS em A2780 celular Linha

nanopartículas de óxido de cério foi demonstrado que actuam como sequestrantes de radicais livres por inibição da produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS) [3], [4], [5]. Uma vez que, está bem estabelecido que a acumulação de ROS desempenha um papel importante na iniciação e progressão da tumorigénese em cancro do ovário humano [27], [28], [29], examinámos o efeito de NCE na geração de ROS na linha celular de cancro do ovário A2780. linha de células A2780 foi tratado com NCE (50-100 mM) e pós 48 h de tratamento, a geração de ROS foi medido utilizando corante DCFH2-DA seguida da leitura de fluorescência. Tal como mostrado na figura 1E-F, tratamento NCE inibiu significativamente os níveis de ROS na linha de células A2780, sugerindo que o tratamento NCE inibe os níveis basais de stress oxidativo na linha de células A2780 OVCA.

NCE não afectou a proliferação celular no cancro do ovário Linhas celulares

Para determinar se o tratamento NCE inibiu a proliferação celular, A2780, C200 e SKOV3 foram plaqueadas em placas de 96 poços a 4 x 10

3 células /cavidade e tratados com várias concentrações de NCE (25-200 uM). A viabilidade celular foi determinada às 72 horas por ensaio MTT. Como mostrado na Figura 2A, o tratamento NCE não teve nenhum efeito significativo sobre a proliferação ou a sobrevivência das linhas de células do cancro do ovário. Consistente com esta observação, os nossos ensaios clonogénicos também não mostrou qualquer alteração na taxa de proliferação com concentrações crescentes NCE (Fig. 2B). [3H] timidina em células A2780, C200 e células SKOV3 (Fig. S1), também confirmou que o tratamento NCE não alterou a velocidade de proliferação. Resultados semelhantes foram obtidos em linhas celulares de cancro do ovário adicionais incluindo CaOV3 e TOV21G (dados não mostrados). Colectivamente, estes resultados indicam que o tratamento NCE não inibiu significativamente o crescimento de células de câncer de ovário linhas

in vitro

.

A. Percentagem de viabilidade A2780, células C200 e SKOV3 tratados com doses indicadas de NCE (25-200 uM), como determinado pelo ensaio de MTT. Os dados são de três experiências individuais representa feitas em triplicado. NS: não significativo, em comparação com células não tratadas no respectivo ponto de tempo utilizando o teste t de Student bicaudal (prisma). B. Para a formação de colónias, 2000 células /poço (A2780, C200 e SKOV3) foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas com as concentrações indicadas de nce, a cada terceiro dia durante 2 semanas, até que as colónias foram formadas. As colónias foram coradas com MTT e contadas. Os dados representam três experiências separadas realizadas em triplicado. NS:. Não é significativo em comparação com células não tratadas, utilizando o teste t de Student bicaudal (Prism)

Migração e celular NCE inibiu o crescimento do Fator mediada Invasion

in vitro

Uma vez que, o tratamento NCE não afectou a proliferação das células, foi avaliado o efeito de NCE no factor de crescimento mediado migração celular e invasão. células SKOV3 crescidas durante a noite em baixo teor de soro (0,2%) contendo o meio foram riscados utilizando um filtro estéril de 200 ul ponta da pipeta, uma vez que atingiu 90% de confluência. Vários factores de crescimento incluindo SDF1, HB-EGF, VEGF

165 e HGF (25 ng /ml) foram adicionados individualmente ao meio na presença ou ausência de NCE (100 uM). 24 horas mais tarde, foi calculada a taxa de encerramento de feridas. Como mostrado na Figura 3A, NCE inibiram todos a migração celular mediada por factor de crescimento na linha celular SKOV3. Resultados semelhantes foram obtidos para as linhas celulares A2780 e C200 (dados não mostrados). Em seguida avaliamos o efeito de NCE na inibição da invasão mediada por GF de células SKOV3 usando ensaio de migração câmara de Boyden (BD Bioscience), como descrito anteriormente [18]. A Figura 3B demonstra claramente que o tratamento de 100 uM NCE inibiu significativamente toda invasão induzida pelo factor de crescimento de células SKOV3 em comparação com células não tratadas. Estes resultados indicam que, NCE tem a capacidade de inibir a migração e a invasão de células de cancro do ovário, sem afectar a proliferação celular.

. Efeito de NCE de vários factores de crescimento mediadas migração celular foi examinada utilizando um ensaio de encerramento de feridas, tal como descrito em Material e Métodos. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de n = 7. B. Para examinar efeito de NCE na invasão, 1 × 10

5 SKOV3 células foram semeadas em poços superiores, com 100 uM NCE na câmara FIA em meio de cultura 500 ul. Vários factores de crescimento (EGF, VEGF

165 e SDF1) (25 ng /ml) foi adicionado aos meios subjacentes. 24 horas mais tarde, a invasão foi determinada seguintes instruções do fabricante. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de triplicados. *** P 0,001 tratada fator de crescimento em relação ao controle. $$$ P 0,001 NCE tratados em comparação com o factor de crescimento usando bicaudal teste t de Student (Prism)

NCE Tratamento atenuada Tumor de crescimento em linha celular A2780 Humano ovário Carcinoma Tendo Nude Modelo rato

Para determinar o efeito de NCE

in vivo

, ratinhos nus foram intraperitonealmente injectados com células A2780. Os ratinhos foram tratados com NCE (0,1 mg /kg de peso corporal) administrado intraperitonealmente, a cada terceiro dia até ao final do estudo (dia 30) tal como descrito em materiais e métodos. Figura 4A (painel superior) mostra uma fotografia representativa de um ratinho tratado NCE e não tratados portadores do xenoenxerto A2780 no final do estudo (dia 30). A circunferência abdominal, indicativo da carga de tumor no peritoneu (Fig. 4B) e o peso do tumor (Fig. 4C) nos ratos tratados NCE foram significativamente (p 0,002) reduzido em comparação com ratinhos não tratados. O peso médio dos tumores excisados ​​foi de aproximadamente 33% em menos NCE (4,56 + 0,345 g) ratos tratados em comparação com veículo (PBS), ratinhos (6,79 + 0,53 g) (Fig. 4C). Estes dados indicam claramente que NCE tem a capacidade de restringir o crescimento de tumores do ovário e

in vivo quando administrados

mesmo a uma dose muito baixa (0,1 mg /kg).

. morfologia de rato representativo com tumores no dia 30 (n = 6). B. circunferência abdominal cumulativa no final do estudo. C. excisado peso do tumor a partir de veículo (PBS) e tratadas NCE (0,1 mg /kg de peso BD; cada terceiro dia). Os resultados são apresentados como a média ± S.D. de seis animais individuais. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.