Human células

Abstract

Fundo

Cancro apresentar uma síntese de ácido sustentado de novo gordo com uma aumento de ácidos graxos saturados e monoinsaturados produção (MUFA). Esta alteração no metabolismo do ácido gordo está associada com sobre-expressão de estearoil-CoA dessaturase 1 (SCD1), que catalisa a transformação de ácidos gordos saturados em ácidos gordos mono-insaturados (e.g., ácido oleico). Vários relatórios demonstraram que a inibição de SCD1 levou ao bloqueio da proliferação e indução de apoptose em células cancerosas. No entanto, mecanismos de ativação da morte celular ainda precisam ser melhor compreendidas.

principais conclusões

Neste estudo, demonstramos que SCD1 extinção por siRNA desencadeada abolição da síntese de novo MUFA no câncer e não células cancerosas. a morte de células activadas por inibição de SCD1 foi apenas observada em células cancerosas com a indução da actividade da caspase 3 e PARP-clivagem. suplementação exógena com ácido oleico não reverter a morte celular SCD1 ablação mediada. Além disso, a depleção de SCD1 induzida características de resposta de proteínas desdobradas (UPR), tais como ARNm XBP1 splicing, fosforilação de eIF2α e aumento da expressão de CHOP. No entanto, a expressão acompanhante GRP78, outra marca registrada UPR, não foi afetada pela SCD1 knockdown nestas células cancerosas indicando uma ativação UPR peculiar. Finalmente, mostrámos que a indução CHOP participou a célula activação morte por SCD1 extinção. Na verdade, a superexpressão de construção CHOP dominante negativo e extinção de CHOP parcialmente restaurada viabilidade em células cancerosas SCD1-empobrecido.

Conclusão

Estes resultados sugerem que a inibição da síntese de novo MUFA por SCD1 extinção poderia ser um alvo anti-câncer promissor através da indução de morte celular através UPR e ativação CHOP

Citation:. Minville-Walz M, Pierre AS, Pichon L, Bellenger S, Fevre C, Bellenger J, et al. (2010) Inibição da estearoil-CoA dessaturase 1 Expressão Induz CHOP dependente de morte celular em células cancerosas humanas. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10.1371 /journal.pone.0014363

Autor: Michael Polymenis, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de julho de 2010; Aceito: 26 de novembro de 2010; Publicação: 16 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Minville-Walz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do INSERM, Região Bourgogne e do Centro Nacional Interprofissional de l’Economie Laitiare. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células cancerosas apresentam alterações do metabolismo caracterizado pelo aumento da glicólise e lipogênese [1], [2]. Ativos proliferação de células cancerosas presentes não só mudanças quantitativas em

de novo

biossíntese de lipídios, mas também modificações de composição membrana lipídica que afectam a fluidez da membrana, transdução de sinal e expressão do gene [3], [4]. Alterações na composição da membrana lipídica são observados em uma ampla variedade de cancros, caracterizada principalmente por saturados (AGS) e de ácidos gordos monoinsaturados (MUFA) acumulação que parece ser menos devido ao aumento da captação de SFA e MUFA do que para a síntese de ácidos gordos endógena exacerbada, independentemente oferta nutricional adequada lipídico [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Estas modificações de SFA e teor de MUFAs estão associadas com a modulação da expressão e actividade de enzimas lipogênicas. Assim, a sobreexpressão de acetil-Co-A α carboxilase e ácido gordo sintase, envolvidos nos primeiros passos na biossíntese de ácidos gordos, foram descritas em vários cancros [12], [13], [14], [15], [16], [17].

o aumento no teor MUFA pode ser também devido a uma sobre-regulação da Co-a estearoil dessaturase (SCD, a delta-9 dessaturase) expressão, a enzima que limita a taxa de síntese de MUFA. Na verdade, Scd catalisa a introdução de uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10 de vários ácidos graxos saturados, tais como ácido palmítico (16:00) e ácidos para produzir palmitoléico (16:01) e oleico esteárico (18:00) (18:01 ) ácidos, respectivamente. Esta enzima residente retículo endoplasmático existe sob duas isoformas em seres humanos, SCD1 e Scd5 [18]. SCD1 é encontrado em quase todos os tecidos com uma expressão maior no fígado enquanto que a expressão Scd5 é restrito para pâncreas e cérebro. expressão de SCD1, correlacionado com o teor MUFA, é aumentada em adenoma hepatocelular, carcinoma do cólon e esofágico, bem como em tumores genetically- e quimicamente induzidos por [19], [20], [21]. Para o câncer de próstata, dois estudos apresentam resultados contraditórios sobre nível de SCD1 expressão [22], [23]. Assim, a expressão de SCD1 pode ser relacionada com os processos de carcinogénese que envolvem a alteração de equilíbrio proliferação /apoptose. Na verdade, SCD1 células sobre-expressando apresentar uma vantagem de crescimento, enquanto SCD1 knock-down leva a taxas mais lentas de proliferação celular e morte celular

in vivo

e

in vitro

[24], [25] , [26], [27]. O mecanismo de morte celular observada em células de cancro de pulmão de SCD1 deficientes parece envolver a modificação de um rácio de SFA /MUFA que provoca a inibição da via de Akt e a activação da via AMPK [24], [28]. Com efeito, na ausência de SCD1, o teor de AGS aumenta o que alivia a activação de Akt, normalmente obtido por MUFA (por exemplo, ácido oleico) para sustentar a sobrevivência e proliferação das células [29]. Além disso, diferentes células cancerígenas falta actividade de SCD1 reduzir

de novo lipogénese

através da activação da via de AMPK [22], [24]. A alteração da produção de lípidos nas células de SCD1 com deficiência diz respeito, principalmente, uma redução da biossíntese de fosfolípido, o que desencadeia o stress celular e expressão da proteína de proteína relacionada com apoptose C /EBP homóloga (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP pertence a uma via do estresse peculiar chamado retículo (ER) estresse endoplasmático que podem induzir a apoptose.

ER stress é desencadeada por diferentes condições de estresse, tais como alterações no estado pós-tradução de proteínas e síntese de lipídios, hipoxia, perturbação do homeostase do cálcio e privação de nutrientes, e conduz à activação de um programa de adaptação, conhecido como a resposta a proteínas desdobrado (UPR), para re-estabelecer o equilíbrio [32]. A ativação do UPR canônica envolve três ramos de sinalização concertadas distintas mediadas por sensores membrana ER ancorados: dependentes de ARN proteína quinase (PKR) -como ER quinase (PERK), fator ativador de transcrição 6 (ATF6) e inositol exigindo 1α enzima (IRE1α) [ ,,,0],33]. Em células estressadas, o GRP78 proteína acompanhante dissocia sensores UPR Perk, ATF6 e IRE1α levando a sua activação para a primeira aliviar o stress do ER. PERK fosforila o 2α eucariótica fator de iniciação da tradução (FEI), inibindo assim a síntese de proteínas global. ATF6 activo transloca-se para o Golgi e é clivado a partir da membrana por local 1 e -2-proteases. ATF6 então clivado concentra em o núcleo e induz a transcrição de chaperonas XBP1 e ER, tais como GRP78. IRE1α dispõe de uma atividade endoribonuclease que, alternativamente, emendas do mRNA XBP1 (sXbp1), que se traduz em um fator de transcrição ativa. No entanto, num grave stress ou prolongada, a RPU pode provocar sinais pró-apoptóticas através da activação do CHOP factor de transcrição, que actua de modo a reprimir a expressão do gene bcl-2, assim regulação negativa da proteína anti-apoptótica de Bcl-2 e tornando as células sensíveis aos efeitos pró-apoptóticos de BH3-somente proteínas [34], [35], [36].

Embora estes dados apoiam claramente o envolvimento de SCD1 como um regulador central da lipogênese em células cancerosas, o ligação entre SCD1 e a indução do stress ER e morte celular em células de cancro continua a ser melhor compreendida. Neste estudo, foram consequentemente interessado em procurar para a indução UPR em células cancerosas sem expressão de SCD1 e na investigação do papel desta via do estresse sobre a viabilidade da célula cancerosa durante SCD1 extinção. Nós demonstramos que a depleção de SCD1 em células cancerosas activado marcadores UPR e cancro morte celular induzida com nenhum efeito sobre a viabilidade non célula cancerosa. Além disso, constatou-se que CHOP participou à morte celular SCD1 mediada.

Resultados

inibição eficiente de expressão SCD1 e supressão do

de novo

MUFA síntese |

neste estudo investigou o efeito da SCD1 silenciamento utilizando siRNA em diferentes linhas celulares de cancro humanos (U2OS, SW480 e HCT116). As células cancerosas foram transfectadas com 75 nM siRNA alvo mRNA humano não relacionado (siRNA SCR) e mRNA SCD1 (siRNA Scd1.A e Scd1.B). Ambos ARNsi dirigido contra SCD1 em comparação com ARNsi de controlo (SCR) expressão drasticamente suprimido de ARNm e proteína de SCD1, logo que 24 h após transfecção (Figuras 1A e 1B).

A) U2OS células foram transfectadas com ARNsi de controlo ( SCR) ou com ARNsi contra SCD1 (Scd1.A e Scd1.B) e recolhido 24 e 48 h pós-transfecção para a expressão de ARNm de SCD1 de tempo real de RT-PCR. a expressão de ARNm de SCD1 foi normalizado para a expressão de p-actina. Os valores representam a média ± SEM relação à expressão de ARNm de SCD1 em células U2OS tratados com SCR às 24 h. *, P 0,05 vs. siRNA células SCR-tratados por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. B) células U2OS e SW480 foram tratados com oligofectamine (-), ARNsi de controlo (SCR) ou com ARNsi contra SCD1 (Scd1.A e Scd1.B). As células foram colhidas 24 h após a transfecção para análise de expressão de SCD1 por Western-blotting. C) células U2OS e SW480 tratados 72 h com siRNA foram incubadas durante mais 6 h com [

14 C] ácido esteárico e extração de lipídios totais foi realizada. a actividade de SCD foi avaliada por HPLC como a taxa de [

14C] a conversão do ácido esteárico em [

14C] ácido oleico em células tratadas com ARNsi durante 72 h. a actividade de SCD foi expressa como a proporção de% [

14C] oleico a ácido [

14C] oleico e esteárico. Os valores representam a média ± SEM de pelo menos duas experiências separadas. *, P 0,05 vs. siRNA células SCR-tratados por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Um representante expressão de proteína de SCD1 foi mostrado por 72 h de tratamento de siARN. D) As células U2OS foram expostas a DMSO como veículo, inibidores de SCD1 (CVT-11127 ou MF-438) em 10 | iM, durante 24 h e preparadas como acima C) para medir a actividade de SCD. Os valores representam a média ± SEM de três experiências. *, P 0,05 vs. células tratadas com o veículo por meio de análise Anova, seguido pelo teste de Tukey

Como SCD1 catalisa a conversão de ácido esteárico em ácido oleico, uma diminuição na produção de ácido oleico evidenciaria a abolição. da actividade de SCD1 por siRNA alvejando esta enzima. A fim de abordar a actividade de SCD após 72 h de SCD1 silenciamento, nós ainda tratado U2OS e células SW480 para 6 h com radiomarcado [14C

] ácido esteárico levando para medir a produção de [

14 C] ácido oleico em Scd1- células deficientes em comparação com células de controlo tratadas com SCR. A incorporação de [

14C] de ácido esteárico foi semelhante nos SCR siRNA e células tratadas com SCD1 (dados não mostrados). As células cancerosas transfectadas pela não-alvo humano mRNA siRNA (SCR) apresentou uma taxa de dessaturação de 31,49% para U2OS e 25,66% para SW480. Nas duas linhas celulares, SCD1 extinção conduziu a uma queda na biossíntese de ácido oleico com uma taxa remanescente de dessaturação de 5,135% e 5,28% em U2OS tratada por siARN Scd1.A e Scd1.B, respectivamente, e 5,89% e 7,55% , respectivamente, em SW480 (Figura 1C). Além disso, nós exposta U2OS células durante 24 h para o SCD1 inibidores de CVT-11127 e MF-438 (10 | iM). Obtivemos capacidade semelhante com inibidores de SCD1 que siARN dirigidos contra SCD1 para inibir a produção de ácido oleico de ácido esteárico em células U2OS (Figura 1D).

No seu conjunto, estes resultados demonstraram uma inibição drástica de actividade de SCD em siRNA SCD1 células tenha sido tratada com. Além disso, nestas linhas celulares de cancro, de SCD1 aparece como a principal enzima envolvida na produção endógena de ácido oleico.

SCD1 extinção promove apoptose de células morte

A fim de avaliar efeitos de SCD1 knockdown sobre a viabilidade celular, que determinado primeiro número de células em 24 h, 48 h e 72 h pós-transfecção usando o reagente CyQuant® que quantifica a quantidade de ácidos nucleicos. Assim que 48 h pós-transfecção, o número de células foi significativamente menor em células U2OS SCD1-empobrecido em comparação com células de controlo. Embora a fluorescência relativa (RF) aumentou para células tratadas com siRNA SCR ao longo de todo o 72 h pós-transfecção, RF não se alterou de forma significativa para as células siARN SCD1-silenciados durante o curso de tempo. Observou-se que a RF foi duas vezes vezes superior em células SCR siRNA em comparação com ARNsi de SCD1-empobrecido U2OS 72 h pós-transfecção, indicando a inibição da proliferação ou indução da morte celular em células de SCD1-extirpadas (Figura 2A). Em seguida, foi demonstrado por contagem de células de exclusão de azul de tripano 72 h após transfecção de siRNA que SCD1 knockdown levou a uma diminuição da viabilidade celular, tanto em células U2OS e SW480, mas muito mais drasticamente em células U2OS (Figura 2B). Mais de 30% dos tratados U2OS-siRNA de SCD1 e cerca de 20% de SW480-tratada siARN SCD1 foram positivas para PI que representa um aumento de três e duas dobras comparado com células tratadas com siRNA SCR U2OS e SW480, respectivamente (Figura 2C). A inibição da actividade de SCD1 por ambos os compostos (CVT-11127 e MF-438), também levou a aumentar a morte celular em 48 h de um modo dose-resposta (Figura 2D). No entanto, descobrimos que estes compostos afetadas de forma diferente a viabilidade celular com CVT 11127 mais potente para a indução de morte celular do que MF-438 em U2OS. Além disso, mostrámos que a depleção de SCD1 induz a activação da apoptose, como mostrado pela indução de alto nível de actividade da caspase 3 e a clivagem de PARP (figuras 2E e 2F).

A) U2OS células foram tratadas com siRNA SCR (controlo) e direcionamento SCD1 (Scd1.A e Scd1.B), e recolhidos 24 h, 48 h ou 72 h pós-transfecção. Status A proliferação foi determinada pelo ensaio de proliferação CyQuant®. Cada valor é a média de unidades de fluorescência relativa ± SEM de triplicado e representativos de três experiências independentes. B) células U2OS e SW480 foram cultivadas durante 72 h pós-transfecção siRNA e colhidas para o ensaio de exclusão de corante azul de tripano. Os valores são a média ± SEM de três vias e outros representativos de duas experiências independentes. SW480 células C) ad U2OS tratados 72 h com ARNsi foram recolhidas e a morte celular total foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio (PI). Os dados representam a média ± SEM de três experiências independentes. D) As células U2OS foram tratadas durante 48 h com inibidores de SCD1 nas concentrações indicadas e foram colhidas por coloração com iodeto de propídio. Os dados representam a média ± SEM de três experiências. E) U2OS células foram colhidas 72 h pós-transfecção e preparado para a caspase 3 medição de actividade por citometria de fluxo como pormenorizado em Materiais e Métodos. Os dados são mostrados como vezes de aumento sobre o controlo (SCR siARN) e representam a média ± SEM de duas experiências independentes. F) Os lisados ​​celulares totais foram preparados 72 h pós-transfecção com ARNsi e a clivagem de PARP (nível C-PARP) foi determinada por Western-blot. G) U2OS células foram tratadas durante 72 h com ARNsi de controlo (SCR) e a segmentação de SCD1 na ausência (veículo) ou na presença de 100 uM de ácido oleico ligado a BSA. O número de células foi quantificada por ensaio de proliferação CyQuant® como anteriormente descrito. Os dados são apresentados como a mudança de dobragem ao longo das células tratadas com siRNA SCR veículo e representam a média de unidades de fluorescência relativa ± SEM de triplicado. *, ** P 0,05 vs. siARN SCR-tratadas e células veículo ácido oleico, respectivamente, por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey

então postulado que a morte celular foi desencadeada por redução do oleico. o conteúdo da célula de ácido. Assim, realizamos a completar células siARN SCD1-empobrecido com 100 uM de ácido oleico, a fim de avaliar a capacidade de suplementação exógena para reverter a morte celular. Figura 2G evidenciado que a exposição de células U2OS SCD1 com deficiência ao ácido oleico exógena não alterou a taxa de citotoxicidade.

A inibição da expressão SCD1 ativa resposta proteína parcialmente desdobrado

Perturbações de chumbo ER homeostase para estresse ER pela ativação UPR que poderia desencadear a morte celular. A fim de monitorar a activação da via UPR, investigou-se a nível de GRP78, fosfo-eIF2α e não convencional splicing de ARNm XBP1 expressão. U2OS e SW480 células possuem a maquinaria funcional para responder a tapsigargina induzida por ER stress, como já fizemos notar splicing de XBP1, a sobre-regulação de GRP78 e expressão de fosfo-eIF2α (Figuras 3A e B). Em seguida, analisamos esses marcadores ER estresse em células SCD1 com deficiência. Supressão de SCD1 em células U2OS e SW480 levou a um processamento parcial de ARNm XBP1: spliced- e híbrido-XBP1 espécies de ARNm (S- e H-XBP1) foram aumentadas em células deficientes em SCD1 indicando activação de braço IRE1α em ambas as linhas celulares, de uma forma mais pronunciada em células SW480 (Figura 3A). Tradução de s-XBP1 produz o fator XBP1 transcrição funcional, que participa de um programa de transcrição, a fim de restabelecer a função primeiro ER e sobrevivência celular. O GRP78 acompanhante também regula a via pró-sobrevivência durante o estresse ER através da sua sobre-regulação. No entanto, não foram capazes de observar essa regulamentação no U2OS e células SW480 silenciado por SCD1 48 h pós-transfecção (Figura 3C). Nós não observamos nenhuma mudança no mRNA e nível de proteína para a expressão GRP78 em tempo de pós-transfecção diferentes (24, 48 e 72 h, dados não mostrados). PERK também pertence ao RPU e sua ativação induz a fosforilação da eIF2α desencadeando a repressão da tradução em geral. Observou-se às 48 h pós-transfecção de células que expressa de SCD1 empobrecido em maior quantidade de fosfo-eIF2α em comparação com células de controlo, sugerindo activação do braço PERK (Figura 3D). A fim de atribuir a fosforilação de eiF2αto SCD1 extinção e não a um artefacto devido a activação de PKR por siARN de transfecção, analisámos nível de fosfo-eIF2α em U2OS tratadas com 5 e 10 uM de inibidor de SCD1 (CVT-11127 e MF-438) por 10 e 24 h. Observou-se aumento da expressão de p-eIF2α logo 10 h para ambos os inibidores que demonstram que a fosforilação de eIF2α foi induzida por extinção da actividade de SCD1 (Figura 3E).

e U2OS células SW480 foram tratadas com ARNsi de controlo (SCR ) e ARNsi contra SCD1 durante 72 h. A) As amostras foram preparadas para análises de ARNm de processamento XBP1 por semi-quantitativa por RT-PCR. Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 3% e a XBP1 splicing (sXbp1), não excisado XBP1 (uXbp1) e híbridos espécies XBP1 (hXbp1) de ARNm foi observada em células tratadas com siRNA (CTR) e células tratadas com thapsigargine (Tg) como controle positivo da activação UPR. B) Os lisados ​​de proteínas totais foram preparados a partir de tratados e thapsigargin tratados com células (Tg, 0,2 m, 16 h) e analisados ​​para a fosforilação eiF2α e GRP78 up-regulação por western-blotting. C e D) de SCD1-empobrecido U2OS e células SW480 foram preparadas como no 3B) e analisadas por western-blotting para SCD1, GRP78 e expressão de fosfo-eiF2α. E) U2OS células foram tratadas com 5 e 10 uM de inibidores de SCD1 (MF-438 e CVT-11127) e foram recolhidos após 10 h e 24 h de tratamento, para análise de expressão de fosfo-eiF2α por western-blotting. Borrões são representativos de pelo menos duas experiências independentes.

CHOP participa SCD1 induzida por depleção de morte celular

Em ER apoptose mediada por estresse, CHOP expressão aumenta e aparece como um efetor essencial deste programa de morte celular. Nós primeira dirigida avaliação da expressão CHOP em células cancerosas tratadas com scr siRNA ou contra SCD1. Observou-se um aumento do ARNm de CHOP e a expressão da proteína em células que perderam a expressão de SCD1 em comparação com células de controlo (Figuras 4A e 4B). Para determinar o papel de CHOP na indução de morte celular, que transitoriamente transfectadas vector vazio (CTR) ou forma dominante negativa de CHOP (DN-CHOP) em células U2OS. DN-CHOP construir mutações portos no domínio de fecho de leucina (L134A /L141A) que impede a sua actividade de transcrição [37]. Mostrámos por coloração de PI que DN-CHOP superexpressão reduzida citotoxicidade induzida por inibição de SCD1 em comparação com as células transf ectadas com o de controlo (CTR) (Figura 4C). Além disso, estimou-se o efeito da expressão forçada de DN-CHOP na indução ativa caspase 3 em U2OS SCD1-silenciados. Nós mostrou uma diminuição da ativação da caspase 3 em células-U2OS knockdown SCD1 expressar DN-CHOP e evidenciou um efeito protetor do DN-CHOP contra a apoptose induzida por SCD1 esgotamento (Figura 4D).

) células U2OS e SW480 A foram tratados com o controle siRNA (SCR) e siRNA contra SCD1 por 72h. O ARN total foi isolado e a expressão de ARNm CHOP normalizado para p-actina foi quantificada a expressão de ARNm de tempo real de RT-PCR. Os resultados foram representados indução dobra como média ± SEM relativamente a células tratadas com siRNA SCR a partir de pelo menos três experiências independentes. *, P 0,05 vs. siRNA células SCR-tratados por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. B) extractos de Nuclear U2OS foram preparados 72 h após a adição de siRNA. CHOP expressão foi analisada por western-blotting e lamin A /C estava carregando o controle de amostras de extracto nuclear. C) células U2OS foram transitoriamente transfectadas com vazios (CTR) ou dominante negativo CHOP (DN-CHOP) vetor de expressão e selecionados por três dias em G418. As células resistentes transfectadas por construção CTR ou DN-CHOP foram tratados por ARNsi de controlo ou SCR contra SCD1 (Scd1.A e Scd1.B) durante 72 horas e colhidas para análise de coloração com iodeto de propídio por citometria de fluxo. Os valores foram apresentados como vezes de aumento sobre o controlo (SCR siARN) e representam a média ± SEM de duas experiências independentes. *, **, P 0,05 vs. siARN SCR-tratados células CTR e DN-CHOP, respectivamente, por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. #, P 0,05 por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. D) As células U2OS foram preparados como C) e colhidas para análise de caspase 3 por citometria de fluxo. Os valores foram apresentados como vezes de aumento sobre o controlo (SCR siARN) e representam a média ± SEM de três experiências independentes. *, **, P 0,05 vs. siARN SCR-tratados células CTR e DN-CHOP, respectivamente, por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. #, P . 0,05 por análise Anova, seguido pelo teste de Tukey

CHOP extinção alivia parcialmente SCD1 induzida por depleção de apoptose

A proteção observada pela inibição CHOP contra células U2OS mediada por esgotamento SCD1 a morte foi também avaliado em linha de células tumorais HCT116 do cólon. Neste objetivo, utilizamos as células CHOP knockdown-HCT116 e BA1 transitórias que são células HCT116 estavelmente transfectadas com cDNA CHOP antisense humanos constroem [38]. Esgotamento de SCD1 com siRNA em HCT116 induzida mais de 30% de morte celular como atestado por coloração PI (Figura 5A). Também mostraram a 72 h de que a extinção da actividade de SCD1 por siRNA e inibidores (dados não mostrados) de apoptose induzida em HCT116 evidenciado por caspase 3 activa ou detecção de PARP-clivagem (Figuras 5B e 5C). Nessas células, também descobrimos que a abolição de expressão SCD1 levou a aumento da regulação da expressão de mRNA CHOP como já observado para U2OS e células SW480 (Figura 5D). Além disso, foi confirmada como no U2OS que a redução de expressão CHOP atenuado parcialmente a citotoxicidade induzida por SCD1 silenciamento. Com efeito, observou-se uma diminuição da coloração de PI em células BA1 comparação com a sua HCT116 parental (p-HCT116) vias quando a expressão de SCD1 foi abolida (Figura 5E). Além disso, a proteção contra SCD1 morte celular mediada pelo silenciamento induzido por CHOP extinção parecia ser específica e não uma proteção contra todos os fatores pró-apoptóticos. Com efeito, a extinção de CHOP não modificar a indução de apoptose por etoposido em DN-CHOP ou U2OS BA1 em comparação com as respectivas células de controlo (dados não apresentados). Também se comprometeram a avaliar o efeito da CHOP extinção por tratamento siRNA na apoptose induzida por SCD1 abolição. Para este efeito, foram realizadas co-tratamento de células HCT116 com ARNsi de controlo (SCR) ou dirigidos contra SCD1 (Scd1.A e Scd1.B), e CHOP com ARNsi de controlo ou (-). Nós validado CHOP siRNA em células HCT116 e mostrou que CHOP siRNA não modificar o nível de ARNm de SCD1 extinção induzida por SCD1 ARNic (dados não mostrados). A fim de estimar a função CHOP na apoptose induzida por SCD1, que, em seguida, realizada de co-transfecção de siRNA. Observamos 72 h após transfecção que CHOP silenciar HCT116 protegidos contra a morte de células da apoptose induzida por SCD1 extinção (Figuras 5F e 5G).

Células HCT116

A) tratados 72 h com controle siRNA (SCR) ou dirigida a SCD1 ( Scd1.A e Scd1.B) foram recolhidas e a morte celular total foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. Os resultados obtidos foram a média ± SEM de três experiências realizadas em triplicado. B) Células HCT116 tratados por siRNA foram colhidas 72 h pós-transfecção e preparado para a caspase 3 medição de actividade por citometria de fluxo como descrito nos materiais e métodos. Os dados representam a média ± SEM de três experiências independentes. C) HCT116 foram tratados como em A) e colhidas para análise de expressão de SCD1 e PARP-clivagem por Western-blot. D) HCT116 foram tratados como em A) e colhido para purificação de RNA total. expressão CHOP e mRNA SCD1 foi analisada por tempo real RT-PCR após a normalização para a p-actina. Todos os experimentos representam pelo menos duas repetições em triplicado. ) células HCT116 E foram estavelmente transfectadas com antisense construção de cDNA CHOP humana e seu vazio vetor de controle. BA1 e p-HCT116 são clones HCT116 com construção anti-sentido CHOP e controle de vetores, respectivamente. As células foram silenciados pelo siRNA Scd1.A e Scd1.B durante 72 h, e colhidas para análise total de morte celular por citometria de fluxo após coloração com iodeto de propídio. Os resultados obtidos foram a média das alterações de dobragem para células positivas para PI em relação às correspondentes células HCT116 siARN scr ± SEM de uma experiência representativa de três experiências realizadas em triplicado. *, **, P 0,05 vs. siARN SCR-células tratadas com P-HCT116 e BA1, respectivamente, por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. #, P 0,05 por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey. F) e G) Células HCT116 foram transfectadas com ARNsi SCR, Scd1.A ou Scd1.B a 75 nM, e tanto com 25 nM de ARNsi SCR (-) ou siARN CHOP. As células foram colhidas às 72 h pós-transfecção para a coloração de PI e caspase 3 activa análises por citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram a média ± SEM de uma experiência representativa de duas expericias independentes realizadas em triplicado. *, **, P 0,05 vs. células HCT116-tratados SCR ARNsi por análise ANOVA seguido pelo teste de Tukey correspondente. #, P . 0,05 por análise Anova, seguido pelo teste de Tukey

esgotamento SCD1 não afetou a viabilidade de células não cancerosas

As células cancerosas foram sensíveis a morte celular mediada por esgotamento SCD1 .Nós foram então interessados ​​em analisar o efeito potencial de uma ausência de

de novo

MUFA síntese em células não cancerosas. Neste objectivo, avaliamos o impacto da inibição SCD1 usando siRNA em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). Estas células têm uma taxa de dessaturação basal cerca de 15% mais baixo do que as células U2OS e SW480, como mostrado anteriormente na Figura 1C. O seu tratamento com ARNsi Scd1.A ou Scd1.B conduziu a uma redução de actividade de SCD para alcançar uma actividade remanescente de 8,3% e 6,3%, respectivamente (Figura 6B). A actividade de SCD residual foi semelhante ao obtido para as células cancerosas tratadas com o siRNA de SCD1. Como mostrado acima, a ablação de actividade de SCD em células de cancro levou a citotoxicidade enquanto que a depleção de expressão SCD1 não induziu a morte celular em NHDF mas reduziu ligeiramente o número de células (Figuras 6C e 6D). Então, em células não cancerosas, SCD1 revogação pode bloquear a proliferação sem afetar a viabilidade celular.

fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) foram transfectadas com controle siRNA (SCR) e siRNA segmentação SCD1 (Scd1.A e Scd1.B ). células NHDF foram colhidas 72 h após o tratamento de siARN e colhidas para análises posteriores. A) As proteínas totais foram preparados para análise de expressão SCD1 por western-blotting. B) NHDF tratados 72 h com siRNA foram incubadas durante mais 6 h com [

14 C] ácido esteárico e extração de lipídios totais foi realizada. A conversão de [

14C] de ácido esteárico em ácido oleico foi realizada por HPLC. a actividade de SCD foi expressa como a proporção de% [

14C] oleico a ácido [

14C] oleico e esteárico. Os valores representam a média ± SEM de pelo menos duas experiências separadas. C) estado Proliferação de NHDF-tratada siARN foi determinada pelo tempo indicado pelo ensaio de proliferação CyQuant®. Cada valor é a média de unidades de fluorescência relativa ± SEM de três experiências independentes. D) NHDF foram colhidas 72 h pós-transfecção e análise total de morte celular foi realizada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. Os resultados obtidos foram a média ± SEM de células positivas para PI (%) por um representante de duas experiências realizadas em triplicado. *, P 0,05 vs. siRNA células SCR-tratados por meio de análise Anova, seguido pelo teste de Tukey

Discussão

No presente estudo, demonstramos que a expressão SCD1 silenciamentos levou à indução. de marcadores UPR (XBP1 splicing, p-eIF2α e pique) e morte celular dependente de CHOP em células cancerosas. Também mostrou que a supressão de MUFA de novo por via de síntese de extinção da sua enzima limitante da taxa de SCD1 viabilidade alterado de células cancerosas, sem alterar a sobrevivência de células não cancerosas. Estes dados sugerem necessidades diferentes na síntese de novo MUFA para as células normais e tumorais. No entanto, a adição exógena de ácido oleico, o produto principal MUFA da actividade de SCD1, não impediu a morte celular das células cancerosas em que endógenos MUFA biossíntese foi suprimida.

Neste relatório, estamos de acordo com relatórios anteriores descrevendo que SCD1 extinção levou à morte celular por apoptose em diferentes tipos de células cancerosas [22], [25], [27], [39]. De fato, observamos indução da atividade da caspase 3 e PARP-clivagem (Figuras 2D et 2E) em células SCD1-empobrecido.

Nós também evidenciado neste trabalho que as células normais e cancerosas não respondeu da mesma maneira que a prevenção da síntese de MUFA por SCD1 extinção. De fato, enquanto as células cancerosas foram mortos por exaustão SCD1, células não cancerosas ainda estavam vivos. No entanto, observou-se uma ligeira diminuição no número de células em NHDF-tratados SCD1 que um bloco ou uma menor taxa de proliferação pode explicar. Podemos então a hipótese de que a viabilidade de células não cancerosas permaneceram inalterados, devido ao facto de que eles não necessitam de uma tal síntese rápida e elevada MUFA. Na verdade, eles proliferam a uma taxa inferior (Figura 6C) e, preferencialmente, sustentada síntese de membrana novo a partir de ácidos gordos exógenos up-take enquanto que as células cancerosas proliferam a taxa mais elevada e precisa de síntese de ácidos graxos de novo [10].

e