Abstract

A radioterapia é uma importante modalidade de tratamento para o cancro oral. No entanto, o desenvolvimento de radiorresistência é um grande obstáculo na eficácia da radioterapia em pacientes com câncer bucal. Identificar preditores de radiorresistência é uma tarefa desafiadora e reuniu-se com pouco sucesso. O objetivo do presente estudo foi explorar o diferencial de perfis espectrais dos sublinhas radioresistentes estabelecidas e linhas celulares de cancro orais parental por espectroscopia Raman. Nós estabelecemos sublinhas radioresistentes ou seja, 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: SCC029B de sua UPCI parental: linha de células SCC029B, usando clinicamente admissíveis 2 Gy fracionadas de radiação (FIR) ionizante. O carácter radiorresistente desenvolvido foi validado por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas, e marcadores de proteína relacionadas com a radiorresistência conhecidos como Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 e Survivina. foi observada no número de filopios em células radiorresistentes relativamente às células parentais; morfologia celular alterada, com aumento significativo (p Aceito: 23 de abril de 2014; Publicado: 19 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yasser et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O Raman espectrômetro empregado no estudo foi obtido a partir de projeto de DBT BT /PRI11282 /MED /32/83/2008, intitulado “Desenvolvimento de in vivo a laser métodos de espectroscopia Raman para o diagnóstico de pré-cancerosa oral e doenças cancerosas,” Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. Mohd Yasser é financiado por uma bolsa da Comissão de Bolsas Universitárias (UGC) – Índia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de boca é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo [1]. Na Índia, o uso do tabaco extensiva em várias formas faz com que seja o tipo de líder de câncer em homens e terceiro câncer mais comum em mulheres [2], [3]. Além disso, a prevalência de vestibular tipo de câncer mucosa oral é alta no subcontinente indiano [4]. As modalidades de tratamento de câncer bucal são baseados em vários fatores, incluindo o estágio da doença, o acesso ao site oral, idade e estado físico do paciente. Embora a cirurgia é a escolha do tratamento em fases iniciais; radioterapia ocupa um lugar importante, quer isoladamente ou como adjuvante com quimioterapia [5], [6]. radioterapia protocolo padrão envolve a exposição da dose diária de 2 Gy fracção de algumas semanas, quando os pacientes recebem uma dose cumulativa de 50Gy a 70Gy durante o curso de radioterapia [7], [8], [9]. radioterapia fracionada mata rápido dividindo população de células tumorais com efeitos reduzidos sobre tecidos normais circundantes. Assim, este método proporciona um tempo para as células normais para repovoar e recuperar a diminuir enquanto que as células tumorais têm aberrantemente activadas vias de transdução de sinal [10], [11]. No entanto, às vezes tumor reaparece com um fenótipo radiorresistente adquiriu posando como uma obstrução para a eficácia da radioterapia. A fim de tornar mais eficaz a radioterapia; é importante para explorar o fenótipo radiorresistente em células cancerosas. Associação de várias proteínas tais como p53 [12], a COX-2 [13], Ras [14], pAKT [15], MDM2 [16], Clusterina [17], Survivina [18], a Bcl-2 [19] e Mcl-1 [20] com radiorresistência foram relatados anteriormente. No entanto, até agora não há nenhuma ferramenta disponível que pode prever a resposta à radioterapia em pacientes com câncer bucal conducentes a um melhor tratamento.

aplicação biomédica de técnicas espectroscópicas ópticos como fluorescência, Fourier transferência de infravermelho (FTIR), reflectância difusa e espectroscopia de Raman (RS) para a classificação de diferentes condições patológicas e detecção do cancro já tenha sido relatada [21] – [24]. Entre essas técnicas, RS adicionou vantagens, como é de etiqueta livre, sensível às variações bioquímicas, aplicável a

in vitro

In vivo

condições, tem um mínimo de interferência água e fornece impressões digitais moleculares [Comprar e ,,,0],25] – [27]. Nossos estudos anteriores tenham demonstrado a eficácia da RS na classificação saudável, pré-malignas e malignas de submucosa oral [28] – [29]; classificação das células esfoliadas normais e anormais [30] e na predição de resposta do tumor em relação simultânea quimio-radioterapia em cânceres cervicais [31]. Nós mostramos o potencial do RS na identificação de alterações de transformação início na mucosa bucal oral [32], a sua viabilidade na detecção de asma e determinar a resposta ao tratamento por meio de soro em pacientes com asma [33], na classificação de soro de câncer normal e oral [34] e, em identificação de múltiplas drogas fenótipo de resistência na leucemia humana [35] e linhas de células de sarcoma uterino [36].

(a) curva de sobrevivência de células clonogénicas. células SCC029B parentais, 50Gy-UPCI:: UPCI células radioresistentes intermediários SCC029B e 70Gy-UPCI: células radioresistentes finais SCC029B. Os dados são representados como percentagem de sobrevivência de células com uma média (± DP) de três experiências independentes. One-way ANOVA análise estatística foi realizada em fracções sobreviventes nas doses indicadas, p 0,01 0,001. (B) Expressão de marcadores radiorresistência em sublinhas orais radiorresistentes. Western blotting para COX-2, Bcl-2, Mcl-1 e proteínas survivina; β-actina é utilizado como controlo de carga. análise de densitometria de Western blot de três experiências separadas é mostrado abaixo, barras representam DP ± média * Representam a expressão da proteína em comparação com linha celular parental, enquanto # representam a expressão da proteína comparada entre 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI:. Sublinhas SCC029B (p 0,05)

RS estudos relacionados à radiação induzida alterações bioquímicas em linhas de células da próstata, do pulmão e cancro da mama irradiados com doses de radiação de 15 a 50Gy são relatados [37], [38]. Estes estudos foram realizados em doses únicas de radiação que objetivou investigar a

in vitro

resposta radiação em linhas celulares de cancro humano. Por outro lado, foi realizado o presente estudo, aproveitando-se da irradiação fracionada dose baixa contínua rotineiramente usado como protocolo de radioterapia padrão em clínicas para o tratamento do câncer oral. O nosso objectivo foi desenvolver

In vitro

radiorresistência carácter na linha de células ao longo de um período de tempo e, em seguida, analisar a viabilidade de espectroscopia Raman para categorizar a característica adquirida a partir de células não tratadas suas parentais. Nós estabelecemos radioresistentes sublinhas de câncer bucal de origem mucosa bucal por dose de radiação fracionada clínica implementável 2 Gy. Depois de estabelecer as sublinhas, o seu carácter radioresistente foi avaliada por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas e perfis espectrais Raman foram obtidos por RS. Para o melhor de nosso conhecimento, é o primeiro a relatar a utilidade da RS em sublinhas orais radioresistentes adquiridos câncer estabelecidas a partir de linha de células de câncer oral parental por radiação ionizante fraccionada clinicamente administrada.

Materiais e Métodos

criação e Caracterização de radioresistentes celular Lines

a) cultura de células e criação de sublinhas radioresistentes pelo tratamento de radiação gama

UPCI:. SCC029B, linha oral humana de células de carcinoma da mucosa bucal foi gentilmente cedido pelo Dr. . Susanne M. Gollin, University of Pittsburgh, EUA [39]. As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal inactivado pelo calor de bovino (FBS, Sigma-Aldrich) e antibióticos (penicilina 100 U /ml e 100 ug /ml de estreptomicina). As células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera humidificada.

(A) análise da morfologia celular. UPCI Pais: células SCC029B, radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B. Barras de escala: 100 mm. (B) imagens Confocal de filamentosa-actina corados com Alexa Fluor-488 phalloidin, as células foram contra-coradas com DAPI. Barras de escala: 20 pm. A seta indica filopios como extensões de superfície de células finas. Análise com base em 50 células por população com média e desvio padrão de três experimentos independentes, plotados no lado inferior direito (p 0,01, 0,001)

Para gerar sublinhas radioresistentes, UPCI:. Células SCC029B (1 × 10

6 células) foram semeadas em placas de cultura de 100 mm (BD-Biosciences) contendo meio completo. As células foram cultivadas em condições padrão e foram irradiados com 2 Gy de radiação ionizante usando

6 ° Co-γ acelerador linear (Bhabhatron-2, ACTREC, Memorial Tata Center) a 60% de confluência. Imediatamente após a irradiação, o meio de cultura foi renovado e células foram colocadas na incubadora até atingirem 90% de confluência. As células foram então tripsinizadas, contadas e passagem em novas placas de cultura. As células foram tratadas novamente com 2 Gy de radiação ionizante de cerca de 60% de confluência. Este procedimento foi repetido 25 vezes para a geração de intermediário 50Gy-UPCI: SCC029B radioresistente sublinha e ainda continuou até 35 vezes durante um período de 5 a 6 meses até geração de final de 70Gy-UPCI:. SCC029B sublinha radioresistente

( A) UPCI parental: linha de células SCC029B (b) 50Gy-UPCI: SCC029B sublinha (C) 70Gy-UPCI:.. SCC029B sublinha

b) ensaio de sobrevivência de células clonogénicas

Resumidamente , número conhecido de ambas as células parentais e radioresistentes de UPCI: SCC029B foram semeadas em placas de cultura de 100 mm e mantidas em CO

2 incubadora durante a noite para a aderência às placas. No dia seguinte, as células foram irradiadas com doses de até 2 Gy para 8Gy e incubou-se a 37 ° C para a formação de colónias. Após 14 dias, as colónias foram fixadas com etanol absoluto e coradas com violeta de cristal a 0,1%. As colónias consistindo em 50 ou mais células foram contadas como sobreviventes clonogénicas. A eficiência de plaqueamento por cento, valor D0 (dose de radiação à qual 37% da população sobreviva) e fracção sobrevivente a uma dada dose de radiação foram calculados com base na sobrevivência das células não irradiadas, tal como descrito anteriormente [40]. Três experimentos independentes foram realizados, cada vez em duplicatas com sublinhas parentais e radioresistentes e curva de sobrevivência celular foi traçado depois de calcular fração sobreviver em cada dose. Além disso, ANOVA one-way análise estatística foi realizada para determinar a diferença significativa na sobrevida em diferentes doses de radiação

(A) 50Gy-UPCI: SCC029B sublinha – UPCI parental:. Linha celular SCC029B (B) 70Gy- UPCI: SCC029B sublinha – parental UPCI: linha de células SCC029B (C) 50Gy-UPCI: SCC029B sublinha -70Gy-UPCI: SCC029B sublinha

(A) Cargas de fator 1, 2 e 3 (B. ) gráfico de dispersão 3-D para UPCI parental: linha de células SCC029B, radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI:.. sublinhas SCC029B

c) Western blot

As células foram lisadas em tampão de lise de células de mamífero contendo 1% de inibidor da protease (Thermo Scientific, EUA). O lisado celular foi centrifugado a 13000 rpm durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante contendo proteína celular total foi recolhido. A concentração de proteína foi quantificada por ensaio colorimétrico [41]. As amostras contendo 40 jig de proteínas totais foram separadas por 12% SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (PALL laboratório, EUA). As membranas foram bloqueadas em temperatura ambiente por 1 hora de incubação em TBS contendo 0,1% de Tween (TBST, pH 7,4) e 5% (w /v) de leite com baixo teor de gordura. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-IgG humana de Mcl-1 (1:1000, SC-20679); policlonal de cabra de Bcl-2 (1:500, SC-492), Survivina (1:1000, SC-10811), anti-IgG de Cox-2 (1:500, SC-1747) e o serviço de limpeza de coelho policlonal IgG anti-p actina (1:3000, sc-1616); (Santa Cruz Biotech., EUA) durante a noite em tampão de bloqueio. Após lavagem seis vezes em TBST, as membranas foram incubadas com um anticorpo conjugado com HRP de IgG anti-coelho (1:2800) ou anticorpo anti-IgG de cabra (1:2500, Santa Cruz Biotechnology) em tampão de bloqueio durante 1 hora. Após lavagem seis vezes em TBST e duas vezes em TBS, a ligação anticorpo primário foi visualizado por quimioluminescência melhorada sistema de substrato (GE Healthcare, EUA). A transferência de Western foi realizada em três lisados ​​de células independentes de células, e 50Gy 70Gy parentais. A análise de densitometria foi realizada pelo programa Image J (NIH, EUA) contra a expressão da proteína de limpeza β-actina.

d) Avaliação morfológica e coloração F-actina.

As alterações morfológicas observadas durante fracionada ionizante radiação foram fotografados usando o microscópio invertido (Axiovert-200M, Zeiss) acoplado com câmera digital. Imagens representativas de UPCI parental: linha de células SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: sublinhas SCC029B foram processados ​​usando software Axiovision (versão 4.7, Carl Zeiss)

Para a coloração de actina filamentosa, as células foram cultivadas. em lamelas, fixadas com paraformaldeído (a 4%) durante 15 minutos e permeabilizadas em 0,7% de Triton-X. Uma alta afinidade Actina filamentosa (F-actina) sonda Alexa Fluor 488-faloidina (Life Technologies, EUA) foi diluído 1:20 (em 1X PBS) e incubadas com as células em lamelas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as lamelas foram lavadas duas vezes com 1X PBS durante 10 minutos. DAPI (1:20 diluído em 1X PBS) coloração foi feito por cerca de 1 minuto e lamelas foram, então, montado no agente anti-têmpera de montagem (Vectashield, laboratórios Vector, EUA) em uma lâmina de vidro limpa e examinadas com LSM 510 Meta Carl Zeiss confocal sistema (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Alemanha). Cada uma das células parentais, 50Gy e 70Gy foram cultivadas em duplicado em lamelas e imagens aleatórias para 50 células foram adquiridos. Desta maneira, a coloração foi realizada três vezes, independentemente, e foram analisadas 50 células de cada vez a partir de todos os tipos de população de células para contagem de filopios.

Espectroscopia Raman

a) Preparação de amostras e espectral de aquisição.

parental UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B foram cultivadas em placas de cultura de 100 mm. As células em crescimento exponencial (3 × 10

6 células) a partir de 6 culturas independentes de cada uma das células parentais, 50Gy e 70Gy foram colhidas e solução salina de tampão fosfato (PBS) de lavagem foi determinado para os peletes de células antes da gravação de espectros. Aproximadamente sete espectros foram adquiridos a partir de cada pelete de células usando o sistema microssonda Raman de fibra óptica como descrito anteriormente [33]. Assim, um total de ~ 40 Os espectros foram adquiridos por grupo para cada uma das células parentais, 50Gy e 70Gy.

Como acima mencionado, o sistema Raman utilizados para estudo consiste de um laser de diodo (Process Instruments) de 785 nm de comprimento de onda como fonte de excitação e uma alta eficiência (HE-785, Horiba-Jobin-Yvon, França) espectrógrafo juntamente com um CCD (Synapse, Horiba-Jobin-Yvon, França) como elemento de detecção. filtragem óptica do ruído indesejado, incluindo sinais de Rayleigh é conseguida através da ‘Superhead’ o componente auxiliar do sistema. cabeça Super acoplado com um 40 × objectiva microscópica (Nikon, 0,65 NA) foi utilizado para proporcionar uma luz laser, bem como para recolher os sinais de Raman. O espectrógrafo não tem partes móveis com resolução de ralar e espectral 950 gr /mm fixa de acordo com as especificações do fabricante é de aproximadamente 4 cm

-1. Estimado o tamanho do ponto de laser na amostra de pellet celular foi de 5-10 uM. Os espectros foram integrados por 6 segundos com uma média de mais de 3 acumulações. potência do laser típica no espécime foi de 40 + 0,05 mW.

b) Spectral pré-processamento e análise de dados.

Raman foram pré-processados, corrigindo dispositivo casal cobrado (CCD) de resposta por um Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) material de referência certificado padrão 2241 (SRM 2241), seguido por subtração de sinais de fundo a partir de elementos ópticos e CaF

2 janela. Para remover a interferência do fundo em movimento lento, primeiras derivadas de espectros – foram utilizadas (Savitzky método Golay) para análise de dados [42], [43]. Em seguida, espectros foram interpolados no cm

-1 gama 900-1800 e vector normalizado. A análise dos espectros de pré-processada foi efectuada utilizando algoritmos implementados em MATLAB (Mathwork Inc.) APC (análise de componente principal) baseado em software in-house [44]. PCA é sem supervisão ferramenta visão geral dos dados utilizados para analisar as diferenças e semelhanças entre os espectros. Este método revela valores atípicos, grupos e tendências nos dados. Descreve variância dos dados de identificação de um novo conjunto de recursos ortogonais, estes são conhecidos como cargas de factor ou componentes principais (PCs) (p 0,05). Os componentes principais são combinações lineares de variáveis ​​de dados originais. Como o presente estudo é um estudo exploratório, portanto, temos realizado método PCA de análise e também utilizou este método no nosso

in vitro

estudos anteriores sobre linhas de células [35], [36].

a média e o espectro de diferença foram calculados para diferentes populações de células e foram usadas para comparação espectral. Os espectros médios foram calculados a partir do fundo subtraído espectros antes da derivatização pela média variações do eixo Y e manter o eixo X constante para cada classe. A correção de linha de base foi realizada ajustando a 5

th função polinomial ordem. Estes espectros de linha de base corrigido foram utilizados para comparações espectrais de todos os grupos. Os espectros de diferença fosse gerado por subtracção dos espectros médio de células radiorresistentes (50Gy-UPCI: SCC029B 70Gy-UPCI: SCC029B) com células parentais (UPCI: SCC029B), bem como por subtracção espectros de 50Gy-UPCI: SCC029B de 70Gy-UPCI :. células SCC029B

Análise estatística

Os dados foram analisados ​​estatisticamente pelo teste t de One-way ANOVA e Student, utilizando Graph Pad Prism 5 software (versão 5.01). Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística utilizada para o processamento de espectros Raman são descritos sob a respectiva seção.

Resultados e Discussão

a) Desenvolvimento e Validação de radioresistentes sublinhas

Os protocolos de radioterapia para o câncer bucal tratamento consistem em uma 50Gy a 70Gy dose de radiação vide baixa dose de radiação fracionada total de 2 Gy. Assim, duas sublinhas radioresistentes i.e. 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: SCC029B foram estabelecidas pelo total de 25 e 35 fracções de 2 Gy, respectivamente, ao longo de um período de 5-6 meses. O caractere de radiorresistente sublinhas foi demonstrado por ensaio de sobrevivência de células clonogénicas. Temos observado aumento significativo na sobrevivência celular para ambas as sublinhas radiorresistentes, em comparação com a sua linha de células parental através de ensaio clonogénico [Fig-1 (A)]. doses D0 para o parental, 50Gy e 70Gy sublinha foram calculados e encontrados para ser 4,5 Gy, 5.1Gy e 5.6Gy respectivamente. Um aumento no valor D0 para as sublinhas radioresistentes a partir da sua linha de células parental, indica o seu carácter radiorresistência Adquirida. Determinou-se também o estado de marcadores proteicos radioresistentes e anti-apoptóticos conhecidos como Bcl-2 (linfoma de células B-2), Mcl-1 (leucemia mielóide célula-1), Survivina Cox-2 (ciclo-oxigenase-2) por western blotting. Tal como ilustrado na figura 1 (B) um aumento nos níveis destas proteínas foi observada em sublinhas radioresistentes (excepto Mcl-1 em 50Gy-UPCI: SCC029B) em comparação com a linha celular parental. Os Mcl-1 níveis no intermediário 50Gy-UPCI: SCC029B sublinhagem foram embora comparável (análise de densitometria, Figura-1B, inferior) a que a linha celular parental e verificou-se ser ainda mais significativamente regulada positivamente no radiorresistente 70Gy: UPCI-SCC029B sublinhagem . Vale ressaltar que Mcl-1 tem meia-vida curta, devido ao seu volume de negócios rápida através ubiquitination [45] e, apesar de Mcl-1 Estabilidade celular contra diversos fatores de estresse tem sido estudada, mas pouco se sabe sobre seu mecanismo de regulação por conta do tratamento de radiação. O nosso resultado possivelmente indica que as vias incluindo Bcl-2, Survivina e Cox-2 podem contribuir para o aumento da sobrevivência de células radiorresistentes em estágios precoces do desenvolvimento radiorresistência adquiridos enquanto Mcl-1 pode ter um papel na fase posterior. Além disso, como mencionado no ensaio de sobrevivência de células clonogénicas, o 50Gy-UPCI: células SCC029B adquirido o carácter radiorresistência e níveis mais elevados de outras proteínas relacionadas radiorresistência em comparação com as células parentais. Portanto, o desenvolvimento de radiorresistência é um fenómeno complexo que não pode ser associado com um único marcador ou uma proteína dentro da célula. O aumento significativo na expressão destes marcadores corrobora com relatórios anteriores, incluindo os de nosso laboratório em sua associação com radiorresistência em carcinomas de células escamosas orais [13], [18] – [20], [46] – [47].

b) Caracterização morfológica de radioresistentes sublinhas

Temos observado morfologia alterada de sublinhas radioresistentes em comparação com a sua linha de células parental. Os 50Gy-UPCI: células fusiformes SCC029B exibiram morfologia enquanto 70Gy-UPCI: SCC029B células foram encontrados para ser mais alongada e de formato irregular [Fig-2 (A)]. O ganho destas características morfológicas em sublinhas radioresistentes pode sugerir para a sua característica transformado relacionados com a migração e invasão. Além disso, a fim de obter uma visão na sua reorganização da actina; temos realizado coloração filamentosa actina (F-actina) nos, 50Gy e 70Gy UPCI parentais: células SCC029B. coloração de F-actina demonstrou aumento significativo [Fig-2 (B)] no número de filopios em 50Gy (p 0,01) e 70Gy-UPCI: SCC029B (p 0,001), as células em comparação com UPCI parentais: células SCC029B. As alterações morfológicas exibidas pelas células radioresistentes pode ser um fenótipo adicional adquirida devido ao tratamento de radiação fracionada contínua.

c) Espectroscopia Raman de Parental e radioresistentes sublinhas

O espectro normalizado média para UPCI parental : linha de células SCC029B, radioresistente 50Gy e 70Gy-UPCI: sublinhas SCC029B foram computados e apresentado na Figura-3. espectro médio foi usado como um espectro representativo para as respectivas linhas de células na análise espectral. Como, ilustrada na Figura-3, as características espectrais foram dominados por bandas em torno de 1008 (fenilalanina), 1270 (amida III), 1450 (δ CH

2) e 1660 (amida I) cm

-1 e pode ser atribuída às proteínas celulares. Considerando que, bandas em 1310 (CH

3 /CH

2) torcer ou dobrar modos de lípidos), estrutura 1340 (anel de adenina) e 1378 cm

-1 (modos de respiração anel de ácido nucleico) sugerem presença de ácido nucleico celular e lipídios. Os espectros médios para 50Gy-UPCI: células SCC029B [Fig-3 (B)] mostraram deslocar ao redor 1310, 1450 e 1660 cm

-1; enquanto um pico proeminente foi observado em 1550 cm

-1 (triptofano). Da mesma forma, em espectros médios de radioresistente 70Gy-UPCI: células SCC029B [Fig-3 (C)] variações de intensidade relacionada em 1270, 1310, 1340 e 1660 cm

-1, enquanto uma mudança em 1450 cm

-1 foi observado. Assim, pode-se observar que diferenças geral sob a forma de mudanças de bandas de Raman e variações de intensidade foram observadas nos espectros média de ambos os grupos de 50Gy e 70Gy

A fim de trazer as diferenças espectrais entre os grupos.; os espectros de diferença foram calculados a partir de espectros médios. Os espectros de diferença fornecem uma ilustração mais clara para as diferenças entre os grupos. Como mostrado na Figura-4, os espectros de diferença foram computados para 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B subtraindo-los de UPCI parental: células SCC029B [Fig-4 (A, B)] e entre as duas células radiorresistentes [Fig-4 (C)]. O espectro de diferença (50Gy – parental) exibiu picos positivos em 1008, 1340, 1378, 1450, 1550, 1664 cm

-1 e picos negativos em 1240 e 1310 cm

-1; sugerindo alterações nas proteínas e ácidos nucleicos, possivelmente devido a cascatas de sinalização celular alterada causada por irradiação [48]. A alteração perceptível a 1550 cm

-1 em células 50Gy é indicativo de triptofano livre acesso, possivelmente como resultado de enovelamento de proteínas /misfolding por chaperones activados devido ao estresse de radiação. Do mesmo modo, no espectro de diferença (70Gy – parental) foram observados picos positivos em 1340 e 1378 centímetros

-1, que está associada com o ADN, enquanto que foram observadas pico negativo em 1240, 1450 e 1650 cm

-1 proteína associada com mudança

Como mostrado pelo ensaio clonogênica, tanto a 50Gy-UPCI:. SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B ter adquirido carácter radiorresistente em comparação com células parentais. Além disso, as células são relativamente mais 70Gy radiorresistente do que as células e exibem espectros de 50Gy diferença distinta, o que pode ser devido a diferentes propriedades adquiridas por eles. Além disso, o (50Gy-70Gy) diferença espectro mostra picos positivos em 1008, 1450, 1550 e 1664 cm

-1 todos relacionados às proteínas, enquanto pico negativo DNA relacionada foi observada em 1378 cm

-1. A presença de triptofano pico positivo proeminente (1,550 centímetros

-1) em 50Gy dica radiorresistente sub-linha para as porções de triptofano enriquecidas que podem ter propriedades anti-oxidativo por causa do grupo indólico que serve como doador de hidrogénio radical [49]. Uma vez que, a radiação ionizante pode induzir a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) que podem causar ataque endógena no backbone desoxirribosilo de ADN [50], [51]. Para contrariar o efeito de ROS, as células têm vários fatores antioxidantes que podem eliminar ROS e proteger contra a radiação [52]. O pico resíduo triptofano distinta em células radiorresistentes 50Gy pode correlacionar-se com tais factores que são ricas nestes tipos de resíduos que protege a célula contra o stress oxidativo. A sobre-regulação destes factores também foram relatados no contexto de radiorresistência [53] – [55]. Além disso, o espectro gravado pode resultar em um espectro médio e representativo da linha de células, uma vez que reflecte uma informação geral sobre o estado da célula; porque numa pelete de células, o feixe de sondagem encontra uma pilha de células e de dispersão pode ser esperado a partir de diferentes organelas tais como núcleo, mitocôndria e outros compartimentos celulares.

d) Análise multivariada

Como acima mencionado , PCA foi usado para explorar a viabilidade de classificação entre radioresistentes sublinhas 50Gy e 70Gy da linha celular parental. PCA é frequentemente método para compressão de dados e visualização usado para observar o padrão nos dados. É uma análise matemática pela qual os recursos em todo o conjunto de dados de milhares de pontos são resolvidos em poucos autovetores significativos que podem expressar todo o conjunto de dados com as suas pontuações para cada espectro. Isso pode fornecer pistas imperativas sobre as variações bioquímicas entre os diferentes grupos, no nosso caso, diferentes classes de macromoléculas. Além disso, os perfis dos componentes principais, também conhecidos como cargas fatoriais pode fornecer pistas vitais sobre as variações bioquímicas entre as diferentes classes. Carregamento dos factores 1, 2 e 3 que levam à demarcação entre grupos são apresentados na Figura 5 (A). Conformando variabilidade espectral como sugerido por espectros de diferença; as parcelas de carga também indicam diferenças no conteúdo de DNA, aminoácidos e proteína perfis de grupos de pais e radioresistentes. Para a discriminação visual, projetamos cada um dos espectros no espaço de coordenadas recém-formado de PCs selecionados. Primeiras três PCs discriminar significativas foram seleccionados para visualização tridimensional dos dados. Três grupos pertencentes a UPCI parental: células SCC029B e radioresistente 50Gy- UPCI: SCC029B, 70Gy-UPCI: foi observada células SCC029B [Fig-5 (B)]. Enquanto 50Gy-UPCI: células SCC029B formaram um grupo separado, mas ligeira sobreposição entre os grupos de 70Gy-UPCI: Foi observada SCC029B e células parentais. Estes padrão de agrupamento pode ser devido ao diferente perfil bioquímico global adquirida pelos tipos de células. Levando-se em vista que PCA irá revelar uma mudança global, incluindo os vários perfis de celulares, indica que as células radioresistentes adquiriram um perfil molecular alterada diferente de suas células parentais com variações sutis.

Conclusão

no presente trabalho, nós estabelecemos sublinhas radioresistentes da linha celular mucosa bucal oral, parental utilizando dose de radiação fracionada clinicamente admissível. O carácter resistente adquirida foi determinada pelo ensaio de sobrevivência de células clonogénicas padrão. O 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: SCC029B estabelecida sublinhas radioresistentes foram encontrados para ser mais radiorresistente em comparação com seu UPCI parental: linha de células SCC029B. As sublinhas também foram caracterizados por meio de expressão de marcadores de proteína relacionada radiorresistência como Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 e Survivina que suportam o seu fenótipo radiorresistente adquirida. características morfológicas alterados foram observados nestas células irradiadas de longa duração que eram diferentes das células parentais, incluindo aumento significativo do número filopódios em 50Gy-UPCI: células SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B radioresistentes. Além disso, a espectroscopia de Raman foi realizada nestas células radiorresistentes e células parentais para estudar o seu perfil espectral diferencial. Este estudo é o primeiro de seu tipo em relação a utilidade da RS na caracterização de sublinhas radioresistentes adquiridos. Os espectros diferencial observada entre pais e tanto as células radiorresistentes foram majoritariamente devido a alterações no DNA, de lípidos e perfil de proteínas de células. Alterações no conteúdo de DNA destas células pode ser por causa de inúmeros insultos genéticas que ocorrem através de múltiplas frações de radiação pela FIR e mudança em lipídios pode ser predominantemente devido à morfologia alterada dessas células, como mostrado acima. A análise multivariada PCA revelou que o radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B e 70Gy-UPCI: células SCC029B podem ser categorizados de seus UPCI parentais: células SCC029B. Tomados em conjunto, os resultados do nosso trabalho são bastante promissores e sugerem a viabilidade de RS como uma ferramenta não invasiva potencial para pacientes com câncer bucal em predizer resposta a radiação através de marcadores espectrais. Ele pode melhorar as taxas de sobrevivência de pacientes em virtude do diagnóstico óptica de classificá-los em tipos radiossensíveis e resistentes;