Abstract

Fundo

Nós determinamos recentemente que a dentina sialophosphoprotein (DSPP), um membro do irmão (ligando pequeno de ligação â integrina glicoproteínas ligadas a N) da família de phosphoglycoproteins, é altamente regulada positivamente em carcinomas de células escamosas orais humanas (carcinoma epidermóide estudados), onde a regulação positiva está associada com a agressividade do tumor. Para investigar os efeitos do

DSPP

-silencing nos perfis tumorigênicos da linha de células de câncer oral, interferência OSC2, RNA curto hairpin (shRNA) foi utilizada para silenciar

DSPP

em OSC2 células.

Metodologia /Principais achados

Várias regiões do DSPP transcrição foram alvo de interferências shRNA usando partículas lentivirais HDSP-shRNA concebidos para silenciar a expressão do gene DSPP. ShRNA controle plasmídeo que codifica uma sequência mexidos incapazes de degradar qualquer ARNm celulares conhecidas foi usada para controlo negativo. Após a selecção puromicina de linhas estáveis ​​de

DSSP

-silenced OSC2 células, características fenotípicas da carcinogênese oral foram analisados ​​por western blot e análise de RT-PCR, MTT (célula-viabilidade), colônia-formação, modificado Boyden-Câmara (migração e invasão) e citometria de fluxo (do ciclo celular e apoptose) analisa.

DSPP

células OSC2 -silenced apresentaram morfologia celular alterada, a viabilidade reduzida, diminuição da capacidade de colónias-formação, diminuição da migração e invasão, G0 /paragem do ciclo celular G1, e aumentou a sensibilidade das células de tumor à apoptose induzida por cisplatina. Além disso, a MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, Ki-67, p53, e EGFR foram regulados negativamente. Havia uma correlação directa entre o grau de

DSPP

-silencing e supressão de MMP, tal como indicado por regressão de mínimos quadrados: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}, MMP-3 {(y = 0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, e MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013)}.

Conclusões /Significado

DSPP

-silencing na célula OSC2 diminuiu características marcantes da tumorigênese oral e fornece a primeira evidência funcional de um papel-chave em potencial para DSPP na biologia do câncer oral. A sub-regulação da MMP-2, MMP-3, MMP-9, p53 e VEGF em

DSPP

células OSC2 -silenced fornece uma estrutura funcional /molecular significativa para decifrar os mecanismos de actividades DSPP na biologia do cancro por via oral .

Citation: Joshi R, Tawfik A, Edeh N, McCloud V, Looney S, Lewis J, et al. (2010) A dentina Sialophosphoprotein (DSPP) gene silenciador inibe chave tumorigenos Actividades em Oral Linha de células cancerosas humanas, OSC2. PLoS ONE 5 (11): e13974. doi: 10.1371 /journal.pone.0013974

editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 01 de junho de 2010; Aceite: 12 de outubro de 2010; Publicação: 12 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Joshi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR) /Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Grant # K23DE017791-01A1 (KUEO); Medical College of Georgia Research Institute (MCGRI), Inc. Grant # STP00105W005 (KUEO); e por Wendy Will Cancer Foundation Case (KUEO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

sialophosphoprotein Dentina (DSPP) é um membro do irmão (pequeno integrina de ligação ao ligando da glicoproteína ligada a N) da família de glycophosphoproteins da matriz extracelular [1]. Outros membros da família são sialoproteina óssea (BSP), proteína da matriz de dentina 1 (DMP1), sialophosphoprotein dentina (DSPP), osteopontina (OPN), e a matriz extracelular fosfoglicoprote�a (EFEM) [1]. Expressão dos irmãos foi originalmente pensado para ser limitada aos ossos e dentes onde funcionam para facilitar a dentina e matriz de mineralização óssea [1] – [3]. Relatórios recentes, contudo, indicam que os irmãos estão também presentes em não-mineralizantes células epiteliais do dueto metabolicamente activas das glândulas salivares, nefrónios, e glândulas sudoríparas ecrinas quando a sua função pode ser associado com a reparação da matriz pericelular e extracelular (ECM) proteínas danificadas pela radicais livres gerados através de intensa atividade metabólica [4] – [6].

os relatórios anteriores identificaram o aumento da regulação de alguns membros dos irmãos em vários cancros, incluindo mama, pulmão e cancros da próstata [7] . OPN no entanto é o irmão para o qual existe uma evidência inequívoca para o seu papel em muitos dos passos de desenvolvimento e progressão do cancro [6] – [8]. dados que se acumulam estão começando a envolver outros membros da família, nomeadamente BSP e DSPP, com papéis em estágios específicos de progressão tumoral, incluindo o crescimento celular, adesão, migração e /ou metástase [6] – [8]. Recentemente, relatou o aumento da regulação do BSP, DSPP, e OPN, em carcinomas de células escamosas orais humanos (epidermóide estudados) [9] e, em alguns displasia epitelial oral humana (DEOs) [10]. Estes relatórios indicam que DSPP é altamente regulado para cima em pouco diferenciado e histologicamente agressivos CCEO [9]. Significativamente, DEOs expressam DSPP com ou sem BSP exibiu uma propensão de 4 vezes para a transição para CEB comparação com DEOs que expressam BSP sozinho, sugerindo que a expressão DSPP aumentou o risco de CEB primária local enquanto expressão BSP diminuiu tal risco [10]. No entanto, existem actualmente existem dados sobre o papel funcional e mecanicista da DSPP no desenvolvimento do câncer oral e progressão.

No presente estudo visa estabelecer correlações funcionais entre a expressão DSPP eo comportamento biológico do CEB, short RNA hairpin (shRNA) interferência foi usado para produzir silenciamento de

DSPP

na linha de células de CCEO OSC2.

DSPP

células OSC2 -silenced foram então avaliados para determinar a extensão em que silenciamento suprime ou anula-chave características fenotípicas malignas de OSC2 células usando vários

in vitro

técnicas padrão.

resultados

DSPP é regulada em linhas celulares de cancro orais, OSC2 e SCC25 e na linha de células epiteliais orais displásicos, DOK

OSC2 e SCC25 são linhas celulares OSSC humanos derivados de linfa cervical nó metástases regionais de um carcinoma de células escamosas primário língua humana, e um carcinoma de células escamosas de língua primária, respectivamente [11] – [13]. DOK é uma linha epitelial oral humana displásico celular derivada de língua dorsal [14]. Para avaliar os níveis de expressão endógenos de proteína e ARNm em DSPP OSC2, SCC25, e células DOK, western blot e semiquantitativa de transcriptase inversa (RT) -PCR análises foram realizadas em lisados ​​de células inteiras e extractos de ARN total, respectivamente, como descrito no material e Métodos. Os controlos positivos e negativos consistiram de lisados ​​de células inteiras e extractos de ARN total a partir de células MCF-7 (derivada de adenocarcinoma mamário) e células HOK (derivadas da cultura primária de queratinócitos humanos por via oral), respectivamente. DSPP é significativamente regulada positivamente em OSC2, SCC25, e em comparação com as células DOK HOK no translação (Figura 1A) e os níveis de transcrição (Figura 1B). Estes

in vitro

resultados são consistentes com os resultados dos nossos estudos recentes que indicam o aumento da regulação do DSPP em CCEO de pacientes, e sua ausência completa em condições normais epitélio da mucosa oral [9].

(a) Western blot (WB) e análises densitométricos mostrar regulação positiva significativa de DSPP em OSC2, SCC25, e as células DOK comparados com os controles HOK negativos. Há uma basal ( 10%) do nível de expressão em células DSPP HOK primárias. A linha celular MCF7 conhecida para expressar DSPP foi utilizado como controlo positivo. A normalização foi com β-actina. (B) Análise semiquantitativa RT-PCR mostra a expressão DSPP-mRNA em OSC2, SCC25, e as células DOK consistentes com resultados WB em (A), com níveis indetectáveis ​​DSPP-mRNA em células HOK. A normalização foi com GAPDH. As células utilizadas no estudo: OSC2, uma linha celular CCEO humano derivados de metástases regionais linfonodo cervical de um carcinoma de células escamosas língua humana primária; SCC25, um carcinoma de células escamosas de língua primária; DOK, uma linha epitelial oral humana displásicos celular derivada de língua dorsal; e MCF7 (sigla de Fundação do Câncer Michigan – 7)., uma linha de células de câncer de mama humano isolado a partir de um 69-year-old mulher caucasiana

Transient DSP-shRNA transfecção resulta em morfologia alterada de OSC2 células

Depois de estabelecer níveis de expressão de linha de base de DSPP em duas linhas de células de CCEO, procedeu-se a investigar como estável

DSPP

-silencing via RNA pequeno hairpin mediada por lentivírus (shRNA) interferência afeta os perfis tumorigênicos de células OSC2. Nós escolhemos OSC2 células ao longo do seu homólogo SCC25 por causa dos níveis comprovadamente mais elevados de expressão de DSPP em OSC2 células a ambos a proteína e os níveis de ARNm (Figura 1) e também porque as células OSC2 exibem muito forte fenótipo invasivo como evidenciado em modelos de ratinho nu experimentais [11 ] – [13]. A fim de avaliar os efeitos imediatos do DSP-shRNA transfecção na morfologia celular OSC2, as células transfectadas, juntamente com controlos foram fotografadas em 24 e 48 horas pós-transfecção (fase transitória) antes do início da selecção puromicina de células transfectadas de forma estável. Como mostrado nas Figuras 2C e 2F (áreas ilustrativos fotografado), DSP-shRNA transfectadas OSC2 células exibiram um, de longe, maior número de células com uma considerável perda do contacto célula-célula e uma mais ovóide e contorno irregulares em comparação com células não transf ectadas OSC2 (Figura 2A) ou controlos de sequência mexidos (Figuras 2B, 2E). A microscopia de fluorescência de clones coGFP-shRNA transitoriamente transfectadas mostrou uma forte fluorescência verde indicativa da percentagem elevada eficiência de transfecção (Figura 2D). Procedeu-se a estabelecer células OSC2 DSP-shRNA-silenciados estáveis ​​através da selecção puromicina, a fim de investigar a extensão de quaisquer mudanças em outras características fenotípicas marcantes da CEB.

(A) células OSC2 antes da transfecção transduzidas-lentiviral com DSP-shRNA exibindo morfologia característica de células tumorais epiteliais viáveis ​​em cultura. (B, E) mexidos OSC2 células transfectadas de sequência (controlo) em 24 e 48 h exibindo células epiteliais viáveis ​​e morfologia comparável a (A). (C, F; áreas ilustrativos) DSP-shRNA células transfecção OSC2 exibindo significativamente aumento do número de células com perda de contacto célula-célula, mais arredondado e contorno irregular, blebbing nuclear proeminente, e desintegração celular consistentes com os de effete e células que morrem em 24 e 48 h, respectivamente. (D) copGFP transfectadas OSC2 células confirmar muito alta eficiência de transfecção (fluorescência verde).

Geração de um estábulo

DSPP

linha de células OSC2 -silenced

linhas estáveis de DSP-silenciadas e controlos de sequência mexidos foram seleccionados por meio de antibióticos puromicina como descrito em Materiais e Métodos. A eficácia do DSP-shRNA Lentivirus construir em silenciamento de forma estável em células DSPP OSC2 foi verificada por Western Blot e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) analisa. Como mostrado na Figura 3, western blot e análises densitométricas de seis diferentes DSP-shRNA transfectadas OSC2 linhas estáveis ​​mostrou DSPP silenciamento variando entre ~ 5% [Linha (L) 4] a -95% em comparação com a sequência de L2 shRNA mexidos-estável (SHC ) de controlo (Figura 3A). Estes resultados foram confirmados por microscopia confocal de imunofluorescência mostrando sinal de DSPP significativamente reduzida (fluorescência verde) em linhas estáveis ​​T2 quando comparados com o controle (Figura 3C).

Stable linhas de seleção de shRNA lentiviral transduzidas foi realizada através da selecção puromycine. (A) WB e densitométrica correspondente análises de nível de DSPP-silenciamento seguinte seleção de seis linhas estáveis ​​mostrar nível de silenciamento variando de ~ 5% (linha [L] 4) para -95% (L2) em comparação com a sequência mexidos (SHC) ao controle. (B) mostra a análise qRT-PCR reduziu significativamente DSPP-mRNA no L1 DSPP-silenciados ( 90%); células (exibindo o mais knockdown em WB) em relação ao controle SHC e L2 (95% 99%) e L2 ( 95%) em comparação com a linha de controlo de shRNA SHC (Figura 3B). O

valores de C T obtidos a partir de análise de qRT-PCR dos níveis relativos de mRNA DSPP no controle SHC e

DSPP

-silenced L1 e L2 foram normalizados com o gene GAPDH de limpeza. Este efeito shRNA mediada era específico, como os níveis de GAPDH não diferiram significativamente entre os DSP-shRNA células e controles transfectadas.

DSPP

-silencing reduz p53, Ki-67 e PCNA, e inibe a proliferação celular e colônias de formação em OSC2 células

os efeitos do

DSPP

-silencing sobre os níveis de marcador proliferativa, Ki-67, PCNA, e o regulador do ciclo celular p53 foram analisados ​​por western blot para todas as seis linhas estáveis ​​OSC2 -silenced

DSPP

. Comparado com a linha de controlo de Shc, os níveis de Ki-67, PCNA e p53 foram significativamente reduzida, indicando que DSPP podem aumentar a proliferação de células cancerosas por via oral por meio de mecanismos que envolvem o p53, Ki-67, e o PCNA (Figura 4A).

(a) WB de Ki-67, PCNA, p53 e a seguir

DSPP

-silencing em OSC2 células mostram a regulação negativa significativa para cada uma destas proteínas. (B) O estado de proliferação de

DSPP

células OSC2 -silenced comparação com OSC2 e controle parental SHC realizada através de programas de ensaio de MTT diminuiu a proliferação celular de 53% para L2 (demonstrando a maior grau de silenciamento) em comparação com 5% de L4 (menos silenciamento), e -30% para L6 (silenciamento moderada) e controlo SHC (p 0,05; n = 3). (C) As células L2 formado menor e um número significativamente menor ( 25%) colónias em agar mole, em comparação com OSC2 e células de controlo parental SHC (* P 0,05).

De modo a determinar a extensão a que

DSPP

silenciamento afeta a proliferação de células OSC2, realizamos ensaios MTT de três das seis

DSPP

-silenced linhas estáveis ​​que incluíam L2 demonstrando o mais alto grau de

DSPP

-silencing, L4 demonstrando a menos silenciamento, e L6 demonstrando silenciamento moderada. Comparado com o controle de SHC e linhas celulares parentais OSC2, silenciamento de

DSPP

foi associada com uma média de 53% de diminuição na proliferação de células no dia 6 em L2 (Figura 4B; P 0,05; n = 3). No que diz respeito à capacidade para formar colónias, células L2 formado colónias em agar mole que eram consideravelmente mais pequena e menos do que as dos controlos de SHC, e a partir de células OSC2 parentais (Figura 4C). O número de colónias formadas em células L2 foi significativamente reduzida ( 25% das células-mãe OSC2 e cerca de 20% do controlo SHC) como mostrado na Figura 4C gráfico de barras. Estes resultados sugerem um papel significativo para DSPP no crescimento de células de câncer oral e proliferação. células L2 demonstrando o grau mais significativo de

DSPP

-silencing de todas as seis linhas foram empregados para investigações sobre os efeitos do silenciamento sobre migração e invasão, e sobre as actividades do ciclo celular.

DSPP

-silencing diminui a migração OSC2 e invasão

Conforme descrito no material e Métodos, realizamos ensaios de invasão e migração usando experimentos Boyden Câmara modificados a fim de determinar em que medida a

DSPP

silenciamento afeta a migração e invasão de OSC2 células. Como mostrado na Figura 5, o silenciamento de

DSPP

(L2) diminuiu invasão (Figura 5A) e migração (Figura 5B) de célula OSC2 em 25% em cada caso, em comparação com o controle de SHC e células OSC2 parentais (p 0,05 para cada comparação utilizando o método de Dunn de comparações múltiplas). Com base nestas descobertas que a hipótese de que DSPP desempenha um papel importante na migração e invasão dentro CEB microambiente para pelo menos ajudar a disseminação local do tumor. Além disso, os resultados destes ensaios in vitro permitem-nos a especular que DSPP podem desempenhar um papel na metástase distante local de carcinoma epidermóide estudados primárias.

(A, B) de modificação de Boyden-câmara experiência mostra que

DSPP

-silencing em (L2) diminuiu invasão (a) e migração (B) de células OSC2 por -25%, respectivamente, comparado com o controlo SHC e OSC2 células parentais (para cada comparação, utilizando métodos de comparações múltiplas de Dunn).

estável

DSPP

-silencing em OSC2 células induz G

0 /G

1 prisão

Para verificar os efeitos do

DSPP

supressão sobre as atividades do ciclo celular OSC2, citometria de fluxo e

DSPP

-silenced OSC2 linha estável, L2, foi levada a cabo. A proporção de células L2 no G

0 /L de fase

1 foi significativamente aumentada em comparação com a do controlo e que Shc de células OSC2 parentais (Figura 6). Como mostrado na Figura 6A, 79,51% de células L2 acumulado no L

0 /L

1 em contraste com a fase de 44,77% e 45,98 de OSC2 parental e controlos SHC, respectivamente. As proporções de células do S e G

2 /M fases de células L2 foram 14,62% ​​e 5,88%, respectivamente, em comparação com 30,74% (S) e 24,49% (L

2 /H) para OSC2 parental células, e 32.92% de (S) e 21,11% (L

2 /H) para as células de controlo SHC. No entanto, não houve diferença detectável na taxa de apoptose entre as células L2 e SHC como controlos ainda confirmada por experiências de DNA laddering (Figura 6B), indicando que

DSPP

-silencing sozinho não aumenta a taxa de apoptose em células OSC2.

(a) Fluxo de análise de citometria mostra proporção de células L2 DSPP-silenciada na G

0 /G

1 fase aumentada significativamente (79,51%) em comparação com OSC2 parental (44,7%) e controles SHC (45,98%). (B) Por outro lado, o DNA laddering experiências não mostra nenhuma diferença significativa na taxa de apoptose entre as células e os controles de L2. Este resultado indica que

DSPP

-silencing sozinho não aumenta a taxa de apoptose em células OSC2.

estável

DSPP

-silencing células OSC2 sensibilizados a cisplatina apoptose induzida

cabeça e pescoço células carcinomas escamosos (CECP), incluindo carcinoma epidermóide estudados, desenvolvem adquiridos ou resistência intrínseca à quimioterapia combinada à base de cisplatina [15], [16]. Tem sido sugerido que o mecanismo de interferência com a apoptose induzida por cisplatina em HNSCCs é por regulação positiva de EGFR [15]. Por isso, procurou determinar o efeito de

DSPP

-silencing na expressão do EGFR, bem como a extensão dos efeitos de

DSPP

-silencing sobre a resposta de OSC2 células para a apoptose induzida por cisplatina.

Após o tratamento de

DSPP

OSC2 -silenced (L2) células e controles (OSC2 parental e SHC) com várias doses de cisplatina em um experimento de tempo de curso, conforme descrito na seção material e Métodos, taxa de apoptose em células de L2 foi analisada por anexina V /FITC citometria de fluxo, e em comparação com as taxas em controlos. Com quase 100% de células fechadas e separadas por FACS, A Figura 7A mostra que a fracção de células apoptóticas foi significativamente aumentado a partir de 41,28% nas células parentais OSC2 (e 43,69% nos controlos SHC) tratados com 50 pM de cisplatina durante 24 horas a 56,19% em L2 células tratadas com a mesma dose de cisplatina. Por outro lado, as fracções de células apoptóticas, sem cisplatina para OSC2 (9,63%), SHC controlo (12,81%), e as células L2 (13,99%) não eram significativamente diferentes. Da mesma forma, os resultados da coloração com azul de tripano indicar um aumento igualmente significativo na taxa de apoptose em células L2 tratados com cisplatina em comparação com o controlo SHC e OSC2 células parentais tratados com cisplatina, em várias doses (Figura 7B).

(A) tratamento de

DSPP

-silenced L2, OSC2 dos pais e SHC células de controlo com 50 uM durante 24 h seguido de anexina V /FITC citometria de fluxo mostram um aumento de 56,19% na taxa de apoptose (medida pelo sub-G1 celular conteúdo de DNA) para células L2 comparação com 41,28% em parental com cisplatina e OSC2 e 43,69% no controle SHC com cisplatina. (B) Trypan azul coloração gráfico de barras quantificação indica taxas apoptóticos comparáveis ​​ao de (A). (C) WB mostrando significativa infra-regulação do EGFR em

DSPP

células OSC2 -silenced, incluindo L2. Símbolos: cis = cisplatina; L2 =

DSPP

células OSC2 -silenced linha 2; OSC2 = parentais (sem knockdown) células OSC2, M1 = células vivas; M2 = células negócio.

Além disso, o nível de EGFR foi significativamente reduzida em células T2 quando comparados com os controlos Shc, o que sugere que a inibição do EGFR é necessária para a apoptose induzida por cisplatina em OSC2 células (Figura 7C). Colectivamente, estes resultados sugerem que DSPP silenciamento em células OSC2, enquanto resultando em L

0 /L

1 prisão (ver Figura 6A) e, portanto, a redução da actividade proliferativa, não aumenta a apoptose; No entanto, a supressão DSPP pode aumentar significativamente a sensibilidade das células à apoptose OSC2 induzida pela cisplatina por meio de mecanismo que envolve a regulação negativa do EGFR.

Estável

DSPP

-silencing em OSC2 células suprime a MMP-2, MMP -3 e MMP-9 expressões

interações específicas

os relatórios anteriores identificaram entre alguns membros da família de proteínas SIBLING com metaloproteinases de matriz (MMP) específicos. Especificamente, os parceiros de BSP com proMPM-2, OPN com proMMP-3, e DMP-1 com proMMP9 de modo a activar as respectivas proteases [4], [17]. No entanto, o parceiro (s) MMP a DSPP e EFEM, se houver, não foram identificados. No entanto, procurou-se determinar o estado de expressão destes três MMPs-parceria entre irmãos conhecidos em todos os seis gerado

DSPP

linhas OSC2 -silenced.

Como demonstrado por análises de Western blot e densitométricos, os níveis de ambos os níveis de pró e MMP-2, MMP-3 e MMP-9 foram reduzidos em todas menos uma das seis

DSPP

linhas OSC2 -silenced em comparação com controlos SHC (Figuras 8A, 8B). Também significativo é uma correlação directa entre o grau de

DSPP

-silencing e supressão de MMP, tal como indicado por análise de regressão dos mínimos quadrados através da origem: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}, MMP-3 {(y = 0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, e MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005 , y 0,809, p = 0,013); Figura 8C)}. No entanto, o nível de supressão de MMP não diferiram significativamente entre as formas pró e clivada. Da mesma forma, diminuição dos níveis de VEGF em estável

DSPP

linhas -silenced variou de 5% (L4) para 86% (L2) com o nível de supressão directamente proporcional ao grau de

DSPP

-silencing (Figura 8D), o que sugere uma relação dependente da dose entre a expressão da actividade angiogénica e DSPP em epidermóide estudados. Colectivamente, estes resultados sugerem um papel regulador para DSPP na regulação positiva e ativação das MMPs-parceria entre irmãos, bem como angiogênese no câncer oral.

(A) WB e (B) análises densitométricos correspondente mostrar jusante significativa regulação da

linhas estáveis ​​DSPP

-silenced pró e ativados MMP-2, MMP-3 e MMP-9 em todos, mas um (L4) dos seis. (C) Pelo menos a regressão quadrado análises mostraram níveis significativamente reduzidos de pró-activado e MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}; MMP-3 {(y = 0.0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, e MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013) }, e uma correlação direta entre o grau de

DSPP

-silencing e supressão de MMP; No entanto, o nível de supressão de MMP não diferiram significativamente entre as formas pró e clivada. (D) A análise densitométrica de WB dos níveis de VEGF mostraram regulação negativa que varia de 5% (L4) para 86% (L2) ao nível de sub-regulação directamente proporcional ao grau de

DSPP

– silenciamento.

In vivo

efeitos anti-tumorais de

DSPP

-silencing em células OSC2

O efeito anti-tumoral de DSPP- silenciamento em OSC2 células foi testado em dois /c ratos pelados Balb subcutaneamente implantados com células OSC2 DSPP-silenciados (linhas L2) no flanco esquerdo, enquanto o controle sequência mexidos (linhas SHC) foi implantado por via subcutânea no flanco direito. Como mostrado na Suplementar Figura S1, observou-se uma tendência para o desenvolvimento do tumor diminuiu e o crescimento, resultando em um volume total do tumor menor para tumor L2 comparação com tumores de controlo SHC ao longo de um período de 6 semanas [Figuras S1A e S1G (gráfico de dispersão]. Histológica avaliação de hematoxylene e eosina (H e) secções mostraram carcinoma de células escamosas, bem diferenciado e agressivo associado com o SHC (controlo) tumores derivados (Figura S1B) em comparação com os tumores menos diferenciadas L2 derivadas (Figura S1C) Além disso, L2. tumores derivados tendem a se formar em pequenas ilhas encolhendo com necrose tumoral mais visível do que tumores derivados SHC (Figura S1C). Significativamente, immuostain para DSPP verificaram redução DSPP em tumores L2 derivados (Figura s1e) em comparação com alto nível DSPP em tumores SHC derivados (Figura S1D). Figura S1F é um controle negativo representante pré-imune IgG. Estes resultados sugerem que os reduzidos marcas tumorigênicos de CEO seguinte

DSPP

-silencing observado em

in vitro

experiências descritas acima são reprodutível

in vivo

.

Discussão

Este estudo, visando a obtenção de conhecimentos sobre o papel funcional do DSPP na biologia do câncer oral, foi concebido como uma continuação lógica para nossos relatórios anteriores que indicam que DSPP é altamente regulada no carcinoma epidermóide estudados humanos agressivos [6] e nesses DEOs com bastante elevada propensão para a transição para a CEB invasiva [10]. Para o melhor de nosso conhecimento, nosso relatório atual representa a primeira demonstração da regulação positiva de DSPP em duas linhas celulares de cancro orais em comparação com, no máximo, nível basal de queratinócitos orais normais primárias (NOK). Mais significativamente, este é o primeiro relatório sobre um estudo que investigou os efeitos do

DSPP

-silencing nos perfis tumorigênicos de uma linha de células de câncer oral.

DSPP

, a maior membro da família de genes irmão, codifica uma proteína ~1300-aminoácido após a tradução clivada em duas proteínas principais, sialoproteina de dentina (DSP) e fosfoproteína da dentina (DPP, também chamado phosphorin) [2], [18] – [ ,,,0],20]. A expressão de DSP e DPP foi originalmente pensado para ser limitada a dentina (e odontoblastos), em que elas desempenham um papel importante na mineralização, com DPP sendo a mais abundante das duas proteínas [2], [19], [21]. No entanto, estudos subsequentes revelaram que menor nível de expressão DSPP está presente no osso [1] – [3]. Estudos recentes também demonstraram níveis significativos de expressão de DSPP (e outros membros da família irmão) em células epiteliais do dueto metabolicamente activas [4] – cancros [6], e a sua regulação positiva em um subconjunto de mama, por via oral, pulmonar, e da próstata [6] – [9]. Porque DSPP contém o motivo MQXDPP altamente conservada que tem sido mostrado em DMP1 para ser envolvido no processamento proteolítico, foi levantada a hipótese de que as mesmas proteases relacionadas com tolloid (particularmente BMP1) clivam DSPP em DSP e DPP [19], [20]. O processamento proteolítico da DSPP por MMP-2, MMP-20, e calicreína-relacionada peptidase 4 tem sido relatada [19].

O anticorpo monoclonal, LF-MB21, utilizado neste estudo reconhece tanto a todo o comprimento (DSPP) e a porção de DPP mas não o DSP. A banda de proteína de 97 kDa na Figura 1A é indicativa de um produto de clivagem, DPP, mas as bandas de baixo peso molecular que representam DSP não estavam presentes. Além disso, faixa de peso molecular que se aproxima do comprimento total DSPP estava ausente. A seguir silenciando com um design construção que tinha como alvo o comprimento total

DSPP

, apenas a níveis muito baixos da banda 97KD foi visto na maioria das linhas estáveis, indicando que o silenciamento de

DPP Comprar e comprimento total

DSPP

. Enquanto é concebível que a nossa estratégia knockdown também pode ter reduzido os níveis de DSP, não podemos determinar, com base em nossos dados atuais, se deve ou não os diversos efeitos da knockdown no perfil tumorigénico do OSC2 células descritos foram o resultado de uma diminuição dos níveis de DPP, DSP, ou ambos (ou mesmo DSPP intacta). No entanto, é altamente sugestiva neste ponto que, no mínimo, DPP ou as suas formas modificadas podem desempenhar um papel nas actividades reguladoras tumorigénicas das células cancerosas por via oral. Outros estudos, incluindo estratégias (por exemplo, a adição de alguns inibidores da furina;. Ver ref [20]) que faz com que as células para segregar única DSPP comprimento completo que poderia ser usado como um padrão vai ser necessária para investigações subsequentes de endereçamento qualquer papel mecanicista específico para DPP, DSP ou o DSPP comprimento total na biologia do câncer oral.

Comentários sobre os produtos genes específicos apresentados nesse estudo, seguindo

DSPP

silenciamento, indicam que nenhum deles tem, até agora, sido associados com o papel potencial do DSPP no câncer oral. Como uma proteína secretada DSPP representa um alvo ideal para um silenciamento shRNA mediada, e analisando os efeitos funcionais do

DSPP

-silencing em OSC2, mostramos que

DSPP

-silencing sub-regula principais proteínas envolvidas na proliferação de células de tumor, angiogénese e invasão local. Especificamente, os nossos dados mostram que silenciamento de

DSPP

em células de câncer bucal está associada a significativa diminuição da regulação das MMPs-parceria irmão, VEGF, p53, e os marcadores de proliferação celular Ki-67 e PCNA. Up-regulamentos de MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, e p53, com níveis que correlacionam com o resultado e parâmetros de prognóstico como o estádio avançado da doença, invasão e metástase de ter sido previamente associado com o cancro oral [22] – [ ,,,0],24]. Assim, os nossos resultados indicam uma regulação negativa significativa de MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, e p53 seguinte estável

DSPP

-silencing em OSC2 células sugere que DSPP pode operar a montante destas proteínas produtos. Além disso, a sub-regulação de p53 indica que DSPP podem directamente ou remotamente, pelo menos, regular aspectos da actividade do ciclo celular.

relatórios recentes sugerem também que a remodelação da matriz extracelular (ECM) é mediada por MMP , de fato, um dos vários eventos que iniciam permitindo que as células de CCEO para invadir o estroma circundante [25]. Postula-se que a expressão precoce de MMP por células do estroma que rodeiam tumor ou facilita a remodelação de ECM, resultando na libertação de factores de crescimento para assegurar um nidus viável para o crescimento do tumor primário [26], [27]. Por sua vez, o crescimento do tumor conduz a angiogénico interruptor durante o qual o equilíbrio de factores pró-angiogénico, como o VEGF supera a expressão de inibidores angiogénicos [28]. angiogénese mediada por VEGF é uma característica da progressão CEB [25], [29], e a MMP-2 e MMP-9 têm ambos sido implicado na indução de o interruptor angiogénica em modelos diferentes [26], [27].