andrógeno-independentes

Abstract

Nós temos mostrado previamente que as células cancerosas da próstata humana são capazes de adquirir atributos malignas através da interação com células estromais em o microambiente do tumor, enquanto que as células estromais que interagem também podem tornar-se afectados com ambos fenotípica e alterações genotípicas. Este estudo utilizou um modelo de co-cultura de investigar o mecanismo subjacente a co-evolução das células cancerosas e do estroma. células cancerosas vermelhas fluorescentes dependentes de androgénio da próstata LNCaP foram cultivadas com um par correspondente de células da próstata normais e miofibroblastos associadas a cancro, para simular a interacção câncer-estromal, e alterações celulares na co-cultura foram documentados por rastreamento da fluorescência vermelha. Encontrámos fusões espontâneas frequentes entre o cancro e as células do estroma durante todo o co-cultura. Em ensaios de formação de colónias avaliação do destino das células híbridas, a maior parte dos híbridos de fusão de cancro-estromal permaneceu preso-crescimento e eventualmente morreram. No entanto, alguns dos híbridos sobreviveram para formar colónias de co-cultura com células estromais associadas a cancro. Estes clones derivados mostraram alterações genômicas em conjunto com fenótipo independente de androgénios. Os resultados deste estudo revelam que as células de cancro da próstata estão fusogénico, e interacção de cancro do estroma podem conduzir à fusão espontânea entre os dois tipos de células. Enquanto uma estratégia de fusão câncer do estroma pode permitir compartimento estromal para aniquilar invadir células cancerosas, certos híbridos câncer estromal com aumento da capacidade de sobrevivência pode escapar à aniquilação para formar uma população de células de câncer derivado com um genótipo alterada e aumentada malignidade. fusion Cancer-estromal estabelece, assim, uma base para uma co-evolução incessante entre o cancro e as células estromais associadas a cancro no microambiente do tumor

Citation:. Wang R, Sun X, Wang CY, Hu P, Chu CY , Liu S, et al. (2012) Fusão Cancer Cell-estromal espontânea como mecanismo de progressão do cancro da próstata andrógeno-independente. PLoS ONE 7 (8): e42653. doi: 10.1371 /journal.pone.0042653

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 29 de maio de 2012; Aceito: 09 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação R21CA112330 e CA132388 do NCI /NIH (National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos.) e PC040578 do DoD para Ruoxiang Wang; e NCI /NIH concessão CA98912-02 para Leland W. K. Chung. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tratamento do câncer de próstata é frequentemente um atraso de progressão independente de androgénios e metástase óssea. Considerando câncer primário é inicialmente andrógeno-dependentes e podem ser curável pela privação de andrógeno, andrógeno-independência é comum ao câncer recorrente e metástases, que são muitas vezes incurável. Junto com a progressão do primário para o estado metastático, as células cancerosas tenham adquirido certas características favoráveis ​​para a sobrevivência na ausência de andrógenos [1], [2].

A causa da independência de androgénio continua a ser elucidado. receptor de andrógeno elevada actividade (AR) e sobrevivência melhorada nas células cancerosas podem ser fatores contribuintes [3], [4], mas células estromais no microambiente do tumor também desempenham um papel importante [5]. Em próstata normal, a camada epitelial glandular é estruturalmente separado do estroma circundante por uma membrana basal laminar. No cancro da próstata, infiltrando-se as células cancerosas se formar contactos directos com as células do estroma, colocando o processo de progressão do cancro no contexto de um microambiente estromal. Delinear o mecanismo de interação cancer-estromal é uma prioridade para a melhoria do tratamento do câncer de próstata.

Nós definimos um papel obrigatório do estroma mesenquimal na progressão do cancro da próstata para a independência de androgénio com a modelagem da interação entre células cancerosas e estromais [6], [7], [8], [9]. células de cancro da próstata humano LNCaP, por exemplo, são andrógeno-dependente, quando ensaiadas para a formação de tumores em ratinhos atímicos machos castrados. Estas células, no entanto, poderia formar tumores frequentes quando co-inoculado com células de medula óssea estromais linhagem mesenquimal [9], [10]. Curiosamente, as células cancerosas recuperados a partir dos tumores resultantes foram independente de androgénios, constitutivamente produzindo elevados níveis de antigénio específico da próstata (PSA), de forma reprodutível formando tumores de xenoenxerto independente de androgénio, e, frequentemente, que mostra a capacidade metastática de osso [9], [10]. Para simular o

in vivo

cancer-estromal interação, nós co-cultivadas do câncer e células estromais em condições convencionais e 3-dimensionais. Ao entrar em contacto directo, as células de miofibroblastos do estroma poderia salvar células LNCaP de morte induzida pela inanição de androgénios [11], enquanto que o co-cultura 3-dimensional resultou em alterações Expressional constitutivas em ambos o cancro e as células do estroma [12], [13], reflectindo a co-evolução entre células cancerosas e do estroma mesenquimal observados na progressão do cancro da próstata e metástases ósseas. Curiosamente, as células cancerosas recuperados a partir da co-cultura suportaram alterações genómicas permanentes, detectado pelo aparecimento de cromossomas marcadores. alteração genômica pode ser a base para a aneuploidia, a anormalidade mais conspícuo em cancros metastáticos [14], [15]. Investigação sobre o contato direto entre as células cancerosas e do estroma pode desvendar o mecanismo pelo qual a interação câncer estroma promove a progressão do câncer de próstata e metástases ósseas.

Neste relatório, foram empregados métodos de co-cultura para investigar a causa da independência de androgénio. células LNCaP marcadas com uma proteína de fluorescência vermelha foram sobrepostos sobre uma monocamada de células de próstata de miofibroblastos para facilitar o contacto directo entre os dois tipos de células. Ao rastrear a fluorescência vermelha, descobrimos que as células cancerosas poderia espontaneamente fundir-se com células estromais. Ao seguir o destino dos híbridos cancerosas-estromal, verificou-se que a maior parte das células fundidas morreu, enquanto alguns poderiam sobreviver para formar clones. Os clones derivados exibiu perda cromossómica, com um crescimento acelerado e de produção elevado de PSA de uma forma independente de androgénios. fusão das células do cancro da-estromal é, assim, um mecanismo que contribui para a progressão do cancro da próstata independente de androgénios.

Métodos

Células e condições de cultura de células

A origem do cancro da próstata humano LNCaP a linha de células utilizada neste estudo foi previamente relatada [16]. O estabelecimento de RL-1, um clone de LNCaP que expressam uma proteína de fluorescência AsRed2, em conjunto com o isolamento e caracterização de um par correspondente de SHP-14 normal e SHP-15 da próstata humana clones miofibroblastos do estroma associadas a cancro foi previamente relatada [11]. O nas linhas celulares MRC-9 estromais fetais humanas de pulmão MRC-5 e foram adquiridos à American Type Culture Collection (Manassas, VA). CARP, uma linha de células primárias normais do estroma humano da próstata, foi adquirido a partir de Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD). Todas estas células foram mantidas a 37 ° C em t-forma (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), ampicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /ml), com ar humidificada suplementada com 5% de CO

2. medula óssea humana células mesenquimais multipotentes normais do estroma transfectadas com um lentivírus proteína de fluorescência verde (hMSC-GFP) foram adquiridos a partir do centro de Tulane para Gene Therapy (Tulane University, Nova Orleans, LA) e cultivadas em α Meio Essencial Mínimo (Invitrogen) contendo 16,5 % de FBS e 2 mM de L-glutamina [17].

co-cultura

co-cultura directa das células de cancro e do estroma foi previamente relatada [11]. Para formar uma monocamada de células do estroma, 5 × 10

5 células estromais, em meio de 2 ml foram plaqueados em cada poço de uma placa de 6 poços, e deixou-se crescer em confluência completa. O meio foi removido e 5 × 10

5 células do vermelho fluorescente LNCaP RL-1 clone em 4 ml de meio fresco foram vertidos na monocamada. O meio de co-cultura foi mudado de três em três dias.

Colónia ensaio de formação de

Células de serem estudados foram recolhidas após tratamento com tripsina-EDTA e diluiu-se a uma suspensão de uma única célula de baixa densidade (4 células /ml). A cada poço de uma placa de 96 poços, 100 ul da suspensão foi aplicada. Após 24 horas de incubação, as placas foram examinadas ao microscópio e cavidades que continham uma única célula foram marcados. Após 8 semanas de cultura, as colónias formadas nas cavidades marcadas foram amplificados para posterior caracterização.

andrógeno tratamento

O protocolo para o tratamento de células em cultura com androgénio foi previamente relatada [18]. Resumidamente, números iguais de células (5 × 10

5 /poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após a fixação, de privação de androgênio foi realizado através da cultura das células com meio RPMI vermelho de fenol livre de 1640 (Invitrogen) durante 48 horas. O meio foi alterado para vermelho de fenol livre de RPMI 1640 contendo 1% de dextrano-carvão despojado de FBS. metiltrienolona androgénio sintético (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA) foi adicionado ao grupo de tratamento de 5 nM. Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura foi recolhido para a medição de PSA e as células foram recolhidas para preparação lisado de células inteiras.

PSA ELISA

meio de cultura celular foi utilizado para detectar a produção de PSA utilizando o nosso protocolo previamente relatada [11]. A PSA ELISA comercial kit (United Biotech Inc., Mountain View, CA) foi usado e ensaios triplicados foram realizadas em cada amostra.

A proliferação celular ensaio

O protocolo utilizado para o ensaio de proliferação celular com conversão de MTT foi relatado anteriormente [11]. Resumidamente, números iguais de células (5 × 10

5 /ml) foram plaqueadas numa placa de 96 poços. Após o tratamento de androgénio, tal como descrito acima, as células foram sujeitas a um ensaio de proliferação. ensaios triplicados foram realizadas em cada grupo.

Western blot

O protocolo de transferência de Western foi relatado anteriormente [18]. Neste estudo, 20 ug de proteína de lisado de células inteiras foi fraccionado e transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana foi detectado com anticorpos específicos para AR (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). O nível da β-actina foi utilizado como controlo de carga.

análise de PCR

As condições para a amplificação de ADN genómico foram relatados anteriormente [18]. Neste estudo, os cromossomas sexuais foram detectados com o método de sexagem forense [19]. O par de iniciadores utilizado para a detecção de genes amelogenina foi 5′- CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 ‘e 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3’ [20]. Este par detecta tanto o ligado ao X e Y-linked genes amelogenina, produzindo um produto de 977 pares de bases (pb) do intrão 3 ‘do gene ligado ao X e um produto de 788 pb do gene Y-ligada em uma única análise de PCR. Um par de iniciadores de 5’-ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC-3 ‘e 5′-CTACAGCTTTGTCCAGTGGCTGTAGCGGTC-3’ foi usada para detectar a região codificadora (615 pb) do gene SRY-Y específicos. O produto da reacção foi fraccionado por electroforese em gel de agarose a 1% e visualizado por coloração com brometo de etídio.

de células activadas por fluorescência (FACS)

O protocolo para o ensaio FACS foi descrito anteriormente [11]. Neste estudo, as células cultivadas foram separadas por tripsina-EDTA. Depois de ser lavado em solução salina tamponada com fosfato e fixadas em álcool etílico a 75%, as células foram coradas com iodeto de propidio na presença de RNase A durante 30 minutos, e sujeitas a análise de FACS para perfis do ciclo celular. células mononucleares do sangue periférico de dois homens saudáveis ​​foram utilizados como controle normal para o conteúdo genômico. Uso de amostra de doadores foi aprovada por um Conselho da Escola Emory University of Medicine (número IRB 278-2006) Institutional Review, com o consentimento informado por escrito dos participantes.

A microscopia de fluorescência

O protocolo para imagens de fluorescência vermelha foi previamente relatada [11]. Neste estudo, para fins de comparação de todas as imagens fluorescentes vermelhas foram tiradas com definições fixas: 4.15 segundos para a imagem latente a 40 × ampliação, 2.075 segundos para imagens em 100 vezes, e 1.0375 segundos para imagens em 200 × ampliação

resultados

1. Características do cancro da próstata e células do estroma no sistema de co-cultura

Utilizou-se uma proteína de fluorescência vermelha para rastrear as células LNCaP em co-cultura [11]. Um clone representativo LNCaP vermelho fluorescente, RL-1, foi utilizada neste estudo. células RL-1 indicadas as taxas de crescimento (Figura 1A), a produção de PSA (Figura 1B) e o nível de AR (Figura 1C) semelhante à das células LNCaP parentais. Ao nível genómico, células RL-1 continha o cromossoma Y (Figura 1D), um recurso genómico que foi perdido em caso independente de androgénios progressão [21]. Ambos RL-1 e as células LNCaP parentais exibido um conteúdo genómico quase tetraplóide idêntica (Figura 1E), indicando um cariótipo XXYY [21]. Quando ensaiado para a formação de tumor de xenoenxerto, células RL-1 não formam tumores subcutâneos em murganhos atímicos, retendo assim a propriedade de não-tumorigénico das células LNCaP parentais.

A, resposta de crescimento diferencial para androgénio. As células originais LNCaP eo fluorescente vermelha RL-1 clone, juntamente com um par combinado de células estromais da próstata, HPS-14 (normal) e HPS-15 (cancro-associados), foram comparados para a proliferação pela conversão MTT. Após a privação de soro de 48 horas, as células foram tratadas, em meio de cultura normal (controlo), o meio de privação de androgénio (privação), e meio de privação de androgénio contendo 5 nM de androgénio sintético R1881 (R1881). ensaios MTT foram realizados 48 horas mais tarde. Os dados representam a média ± SD de um ensaio em triplicado. B, a produção de PSA Diferencial. O meio de cultura a partir das células tratadas foi detectada por ELISA com concentração de PSA. Cada ponto de dados representa a média ± DP de ensaios em triplicado. C, expressão AR Diferencial. As células foram submetidas a transferência de Western para a expressão de AR. A linha celular CARP estroma humano normal foi utilizado na comparação. O nível de expressão β-actina foi utilizado como um controlo de carga. O resultado foi representativos de duas experiências separadas. D, cariótipo Diferencial. Genomic DNA PCR foi utilizado para detectar cromossomos sexuais com um método de sexagem forense [20]. células MRC-5 e MRC-9 eram do sexo masculino e para preparar DNA genómico do sexo feminino, respectivamente. No painel superior (Amelogenina), do cromossomo X foi detectado como a banda superior, enquanto o cromossomo Y foi detectado como a banda mais baixa. No painel inferior (SRY), lócus SRY específicas do cromossoma foi usado para confirmar a presença do cromossomo Y. E, conteúdos genómicos diferencial. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de um macho saudáveis, foram utilizados para mostrar o conteúdo genómico diplóide normal, tal como medido por FACS. células RL-1 tinha um teor genómico quase tetraplóide, semelhante às células LNCaP parentais [21]. HPS-14 e células HPS-15 apresentou teores genômicos similares ao PBMC normal.

Anteriormente, caracterizado pares combinados de HPS-14 normais e HPS-15 clones do estroma da próstata humanos associados ao câncer [11] , que eram grandes e de crescimento lento, miofibroblastos (Figura 1A) que não expressam PSA (Figura 1B). Interessantemente, nenhum dos clones de estroma expressaram níveis detectáveis ​​de AR por Western blotting (Figura 1C) ou por RT-PCR (dados não mostrados). células SHP-14 continha o cromossoma Y, que foi perdida na contraparte associada a cancro (Figura 1D). A citometria de fluxo revelou que ambos HPS-14 e SHP-15 mantido um teor genómica próxima da de células mononucleares do sangue periférico humano normal (Figura 1E).

2. fusão espontânea de células cancerosas e do estroma

Para investigar a interacção do cancro-estromal em co-cultura, as células RL-1 foram sobrepostas sobre uma monocamada confluente de SHP-14 ou SHP-15 células, de modo que o cancro em células eram contato direto com as células estromais. células RL-1 mostrou uma dimensão de cerca de 15 um x 50 um (Figura 2A), enquanto que as células estromais eram em muito maior e mais formas expandidas mas sem qualquer fluorescência vermelha (Figura 2B).

RL-1 As células (a) e células de SHP-15 (B) são mostrados na cultura separada. Após 7 dias de co-cultura, a fusão pode ser visto espontânea (C). Na maior ampliação, a célula fundida continha dois núcleos, um fluorescente vermelho e outro pálido fluorescente (D). fusion Cancer-estromal foi visto freqüentemente em áreas onde RL-1 e HPS-15 formados contato próximo (E). Em alguns casos, as células no meio de uma fusão pode ser visto (F). Os dois núcleos pode ser visto perto um do outro (G) ou separado (H). Para cada ponto de vista, uma imagem de contraste de fase (topo) e imagem de fluorescência vermelha (parte inferior) são mostrados. Setas são usados ​​para indicar núcleos.

Inspeção diária revelaram que as células do estroma monocamada poderia ficar vermelha fluorescente durante a co-cultura (Figuras 2C e 2D). Que as células estromais de fluorescência vermelha resultante da fusão com as células cancerosas RL-1 foi determinada com base nas seguintes observações. Primeiro, as células do estroma vermelhas fluorescentes foram encontradas na maior parte adjacente para as células cancerosas (Figura 2E). Em segundo lugar, embora a tecnologia em tempo real não tinha sido utilizado para registar a dinâmica do processo de fusão, não foi difícil encontrar casos em que uma célula de cancro foi a meio caminho fundidos com uma célula do estroma (Figura 2F). Terceiro, muitas destas células estromais continha dois núcleos, um vermelho fluorescente, indicando a sua derivação a partir de uma célula de cancro, e o outro pálido fluorescentemente o que implica a sua origem estromal (Figuras 2C para 2H). Os glóbulos vermelhos em monocamada estromal com uma aparência estroma eram híbridos de fusão citoplasmáticos entre o câncer e as células estromais.

células estromais adicionais co-cultivadas para observar a fusão cancer-estromal. Um dos estudos foi uma co-cultura de células RL-1 com hMSC-GFP, as células mesenquimais da medula óssea humana do estroma normais que expressam uma proteína de fluorescência verde [17]. A co-cultura foi observada em 4 semanas com uma população estimada de 25% como duplamente células fluorescentes, as células fluorescentes verdes com morfologia distinta do estroma emitindo fluorescência vermelha, a maioria com um núcleo vermelho fluorescente adicional (figuras 3). Todos estes estudos confirmaram que a que as células vermelhas fluorescentes de cancro da próstata LNCaP foram fusogénico. Uma vez em contacto directo, as células RL-1 poderia se fundir com as células estromais.

eventos de fusão de células cancerosas-estromal representativos da co-cultura de células RL-1 com células hMSC-GFP são mostrados. Um, um evento de fusão único a 7 dias é mostrado no campo luminoso, fluorescência verde, e vermelho de fluorescência. As imagens de fluorescência verde e vermelho são mesclados (fluorescência resultante da fusão) para mostrar os dois núcleos de fluorescência diferente. B, imagens de fluorescência intercaladas para 4 eventos de fusão adicionais são apresentados, com eventos 1 e 2 registados no dia 7, e 3 e 4 no dia 14. As setas são utilizados para indicar os núcleos. Todas as imagens são mostradas em 200 × ampliação.

3. Características da fusão de células do cancro

-estromal

Uma vez que o par de células do estroma foi de crescimento lento e inibia o crescimento das células RL-1 [11], um co-cultura pode ser mantido durante 8 semanas para documentação periódica em 4 experiências repetidas. fusão celular Pouco foi visto nas primeiras 48 horas de co-cultura. células vermelhas fluorescentes na camada estromal começaram a aparecer depois com o aumento do número diário para um patamar de cerca de 4 semanas, altura em que um máximo de 20% da população estromal estava envolvido na fusão (Figura 4). A fusão do cancro do estroma-se assim uma espontânea e um processo crónico.

Co-culturas de RL-1 e SHP-15 células foram observados semanalmente para frequência de fusão celular. Para cada ponto de vista, uma imagem de contraste de fase (topo) e imagem de fluorescência vermelha (parte inferior) são mostrados. Setas são usados ​​para indicar eventos de fusão de células cancerosas-estromal. Todas as imagens são mostradas na ampliação de 40 ×.

fusão Cancer-estromal só ocorreu quando foram utilizadas células cancerosas viáveis. Co-cultura com células mortas RL-1, morto por privação de andrógeno, a radiação ultravioleta germicida, pressão congelamento ou dessecação a vácuo, foi incapaz de fazer as células do estroma fluorescente vermelho em 8 semanas. Além disso, a incubação com o ADN genómico purificado a partir de células RL-1 (10 ug /ml) ou o ADN de plasmídeo pAsRed2 (10 ug /ml) não causar fluorescência vermelha em células estromais. A fusão câncer de-estromal espontânea parecia um processo ativo, requerendo a participação de ambos o câncer e as células estromais.

Nos 4 experimentos co-cultura separada, não encontramos uma diferença entre as HPS-14 normais e as HPS-15 células estromais associadas a cancro em termos de frequência de fusão com as células cancerosas. RL-1 pode também fundir-se com outros pares correspondentes de células estromais da próstata humanos estabelecidos no nosso laboratório [11] e com células estromais derivadas de outros tecidos, incluindo células de medula óssea estromais mesenquimais (Figura 3). As células cancerosas fusog�icas parecia ter o potencial para fundir-se com uma grande variedade de outras células.

Na co-cultura com células estromais da próstata, percebemos que as células híbridas progênies que mantiveram a morfologia do estroma raramente produziu. Ao seguir 32 células híbridas de dia 7 ao dia 28 em uma co-cultura, por exemplo, não encontramos qualquer um dos híbridos dividem em grupos clonais com morfologia estromal, nem da co-cultura com as células hMSC-GFP (Figura 3). Os híbridos parecia ter um destino interessante: eles nem tinham a divisão celular dificuldade em iniciar ou sua prole tinha adquirido morfologia divergentes

4.. Fate of the híbridos

A fusão de células de cancro do estroma é um processo biológico que serve funções essenciais [22], [23], [24], [25]. Enquanto fusão citoplasmática

per se

é um mecanismo de sinergismo, ele também fornece uma oportunidade para a fusão nuclear, levando à produção de células filhas heterogêneos de ambos os pais. Nós rastreamos o destino das células híbridas câncer estromal para avaliar o significado patológico. células RL-1 foram co-cultivadas com SHP-14 e células SHP-15 durante 4 semanas, e foram, em seguida, tratada com G418 (200 ug /ml) durante 7 dias para remover as células do estroma não envolvidas na fusão. células RL-1 associados a estas células estromais foram removidos simultaneamente. As células híbridas enriquecidas foram recolhidas em suspensão de célula única, banhados por diluição limitante, e submeteu-se a formação de colónias por mais 8 semanas.

O híbridos morfológica partilhada e as características de comportamento ao longo do ensaio de formação de colónia. No início, os híbridos singulares exibiram tamanhos expandidas dramaticamente, a maioria contendo dois núcleos, ambos mostrando semelhante fluorescência vermelha (Figura 5A). Um híbrido poderia sobreviver durante mais de 4 semanas sob as condições de ensaio, concordando com o potencial de sobrevivência de células do estroma marcado parental [11]. Notavelmente, células híbridas apareceu quiescente, uma vez que nenhuma divisão celular foi observada durante as primeiras 4 semanas de formação de colónias. Em comparação, as células parentais RL-1 e do estroma por este tempo formou colónias substanciais em tamanhos substanciais em ensaios de controlo em paralelo. Após 4 semanas de formação de colónias, muitas das células híbridas aprovadas morfologias atípicas e núcleos adicionais acumulados (Figura 5B). A incapacidade de divisão parecia ser devido a deficiências na citocinese, em vez de na replicação do ADN.

morfologias representativas das células híbridas durante a formação de colónias são mostrados. Uma, duas semanas após a cultura, a maioria dos híbridos continha dois núcleos de fluorescência semelhante. Não foi observada a divisão celular. B, quatro semanas de co-cultura, as células híbridas adotada morfologia atípica com múltiplos núcleos. Não foi observada a divisão celular. C, seis semanas em cultura, as células híbridas restantes tornou-se fina ou estreita, com múltiplos núcleos em segmentos da célula. D, oito semanas para a cultura, a divisão celular tornou-se predominante. A divisão celular anormal porque produzia células filhas em formas variadas e com viabilidade reduzida. Para cada ponto de vista, uma imagem de contraste de fase (topo) e imagem de fluorescência vermelha (parte inferior) são mostrados. Quando necessário, são usadas setas para indicar núcleos. Todas as imagens são mostradas em 200 × ampliação.

Cerca de metade dos híbridos pereceram 6 semanas para a formação de colónias. Embora a causa da morte celular ainda tem de ser definida, sabe-se que a fusão entre células com diferentes taxas de proliferação leva a catástrofe mitótica [26], [27]. Dentro de um híbrido de cancro do estroma, o controlo contrária da mitose pelos dois núcleos não sincronizada pode resultar quer numa falha na iniciação da divisão celular, ou mitose, numa divisão anormal e assimétrica. Uma célula em catástrofe mitótica morre por meio de mecanismos geneticamente programados [28]. A causa da morte celular híbrido era catástrofe mitótico provável.

As células restantes no momento tornou-se encolhido, exibindo uma forma alongada, que contém vários núcleos em diferentes segmentos da célula (Figura 5C). Nenhuma destas células sobreviveram a crescer em colónias. Notavelmente, a divisão celular parecia ser iniciada em menos de 5% dos híbridos restantes, porque as células plurais começou a aparecer em alguns poços de cultura.

A divisão celular só se tornaram evidentes após 8 semanas. Dado que apenas uma pequena fracção de híbridos sobreviveram a este tempo, a divisão celular foi predominante. A divisão, no entanto, apareceram anormal porque as células filhas mostrou morfologias mutuamente divergentes (Figura 5D), e, eventualmente, a maior parte morreu. Com base nestas observações e rastreando 2.800 híbridos em 4 estudos repetidos (Tabela 1), concluiu-se que o principal destino dos híbridos câncer estroma era a morte. As células estromais da próstata, depois de ter sido fundido por células cancerosas, pode funcionar como uma barreira contra a sobrevivência das células cancerosas.

Em comparação com contrapartida normal, a função de barreira em SHP-15 células do estroma associadas a cancro poderia ser deficiente, porque alguns híbridos a partir da fusão com HPS-15 sobreviveram e cresceram em colônias. A partir de 4 estudos de RL-1 e co-cultura HPS-15, fomos capazes de estabelecer 9, 6, 12 e 14 clones de cada estudo, respectivamente (Tabela 1). A morfologia e crescimento das células derivadas alterada ao longo do processo de clonagem. Em geral, as células com núcleos plural iria desaparecer, aqueles com morfologia atípica pereceria, tamanhos de células iria diminuir, ea taxa de crescimento aumentaria. No momento em que os clones cresceram em um 1 × 10

6 população, o que levou cerca de 20 divisões, as células de um clone derivado iria aparecer em uma morfologia uniforme que era quase indistinguível das células cancerosas parentais (Figura 6). Parecia que a descendência imediata de híbridos câncer estroma eram instáveis. A instabilidade, no entanto, foi gradualmente perdida durante o processo de proliferação.

A morfologia da colónia um derivado foi seguido durante o processo de clonagem, que cresce a partir de um único poço de uma placa de 96 poços para um único poço de 24- bem placa, a um único poço de uma placa de 6 poços, e para uma placa de 10 cm. Para cada ponto de vista, uma imagem de contraste de fase (topo) e imagem de fluorescência vermelha (parte inferior) são mostrados. Todas as imagens são mostradas em 100 × ampliação.

5. independência de androgénio dos clones derivados de fusão cancer-estromal

Nós caracterizou os primeiros 9 clones derivados obtidos a partir de RL-1 fusão com as células HPS-15 (Tabela 1), os quais foram nomeados a partir RLH15-1 para RLH15 -9. Ao nível genómico, todos os clones perdeu completamente a cromossomas Y (Figura 7A). Em vez do cariótipo XXYY conhecido às células parentais RL-1, estes clones deu um cariótipo XX semelhante ao das células derivadas C4-2 independente de androgénios na linhagem LNCaP [21]. Embora esses clones expressaram níveis similares de proteína AR às células parentais RL-1, alguns (

ou seja

, clones 1, 6, 8 e 9) os níveis de AR exibido sofridos durante a privação de andrógeno (Figura 7b), sugestivo de insensibilidade androgênica. É importante ressaltar que todos esses clones expressaram níveis marcadamente elevados de PSA, a maioria dos quais mal foi reduzida em cima da privação do andrógeno (Figura 7C), indicando a independência de androgénio. Em ensaios de proliferação celular, todos os clones mostraram um aumento significativamente as taxas de crescimento em comparação com as células parentais RL-1, enquanto que a privação de androgénio inibiu apenas parcialmente o crescimento destes clones (Figura 7D). Aumento do nível AR, a produção de PSA e taxa de proliferação, juntamente com insensibilidade à privação de andrógeno, são geralmente associados com o estado maligno. Parecia que os clones derivados tinha adquirido características malignas adicionais.

parâmetros genéticos e fenotípicos dos primeiros 9 clones dos híbridos de fusão RL-1 e SHP-15 foram comparadas com as dos primeiros 12 clones de clonagem controle . Em comparação com RL-1 clones, todos os clones derivados perdeu cromossomos Y (A versus B). Detectada por transferência Western, alguns dos clones derivados mostrou expressão do AR persistente mesmo sob androgénio-deprivaton (C em função D). Nestes estudos, as células foram cultivadas durante 48 horas em meio de cultura normal (C), meio de privação de androgénio (-), e meio de privação de androgénio contendo 5 nM R1881 (+). Os clones derivados foram detectados para expressar aumento dos níveis de PSA, mesmo durante de privação de androgênio (E versus F). Quando a taxa de crescimento foi ensaiada por conversão MTT, clones derivados de fusão cancer-estromal exibido o crescimento acelerado de forma independente de androgénios (G contra H). Os dados representam a média de ensaios em triplicado. Para todos os pontos de dados, o desvio padrão foi inferior a 5% da média e não é mostrado.

Um estudo semelhante foi realizado com o de uma única célula RL-1 clones isolados a partir de uma colónia de controlo paralelo ensaio de formação (Tabela 1). Foram examinados os primeiros 12 clones. Nenhum destes clones perdeu cromossomos Y (Figura 7e), e nenhum nível AR sustentada foi detectada em cima da privação do andrógeno (Figura 7F). Todos esses clones de produção exibida dependentes de androgénio PSA (Figura 7G) e de crescimento (Figura 7H). Os resultados deste estudo sugerem que o controlo do desenvolvimento de independência de androgénio nos clones derivados a partir de híbridos de cancro-estromal foi o resultado da fusão-cancro do estroma, em vez de desvio clonal nas células RL-1

per se

.

Discussões

Este estudo exposta fusão espontânea entre câncer de próstata e células do estroma (Figuras 1, 2 e 3), e descobriu fusogenecity e sua espontaneidade como características inerentes às células cancerosas. Considerando que o presente relatório descreve a fusão espontânea entre um único RL-1 clone e um par de células estromais da próstata, temos observado fusão cancer-estromal frequente a partir da co-cultura de 5 clones LNCaP fluorescentes vermelhas adicionais com 3 pares de células do estroma da próstata linhas que foram estabelecidas e caracterizadas anteriormente [11];