Abstract
Um ligante indutor de proliferação (APRIL) é altamente expressa em câncer colorretal (CRC) tecidos e linhas celulares. No entanto, as funções biológicas e sinais precisos induzidos pelo abril no CRC não foram totalmente compreendidos. Aqui, usamos pequeno RNA de interferência para esgotar seletivamente abril e determinar os seus efeitos tumorigênicos em uma linha de células CRC SW480 ambos
in vitro
e
in vivo
. Knockdown de abril em células SW480 foi associada com modulação da proliferação celular, bem como a redução da migração celular e invasão
in vitro
. Além disso células SW480 abril-knockdown exibido o crescimento do tumor marcadamente inibida e diminuiu a metástase para o fígado em ratos imunodeficientes mediante injecção subcutânea. Importante, observou-se que a regulação negativa de abril em células SW480 resultou em grande diminuição da atividade de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt. Além disso, observou-se que humana recombinante abril de activação da via PI3K /Akt em células de CRC resultando na indução da expressão de proteínas importantes do ciclo celular e as metaloproteinases de matriz de uma maneira dependente de PI3K /Akt mediada. Este foi concomitante com viabilidade acentuada do crescimento celular, bem como o aumento da migração celular e invasão. Em conjunto, estes dados sugerem que convincentes tumorigénese induzida por APRIL e metástases de células de CRC pode ser realizada através da activação da via PI3K /Akt. Estes resultados podem levar a uma melhor compreensão dos efeitos biológicos de abril e podem fornecer pistas para a identificação de novos marcadores moleculares terapêuticos e preventivos para CRC
Citation:. Wang G, Wang F, Ding W, Wang J, Jing R, Li H, et al. (2013) abril Induz Tumorigênese e metástase de células de câncer colorretal através da activação da via PI3K /Akt. PLoS ONE 8 (1): e55298. doi: 10.1371 /journal.pone.0055298
editor: Claudio M. Costa-Neto, da Universidade de São Paulo, Brasil
Recebido: 19 de setembro de 2012; Aceito: 20 de dezembro de 2012; Publicação: 29 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (números 81201351 e 81201350). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é um importante problema de saúde pública nos Estados Unidos e no mundo. Nos Estados Unidos, é o terceiro câncer mais comum ea terceira principal causa de mortalidade por câncer se os homens e as mulheres são consideradas separadamente [1]. A ocorrência de metástases devido à progressão do tumor é a causa da maioria das mortes relacionadas com o cancro. Apesar de muito progresso na metodologia de diagnóstico e terapêutica, o prognóstico para pacientes com CCR continua pobre. Recentemente, avanços na biologia molecular têm levado a um aumento do conhecimento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento CRC. Recentes sequenciamento em larga escala e outras análises genômicas de tumores colorretais humanos indicam que há até 80 mutações nonsilent em cada tumor e que os tumores individuais têm diferentes mutações. Embora as mutações são muitos e variados, classificação de mutações comuns e raros revelou que 38 vias são interrompidos com particular frequência, e muitos destes caminhos se cruzam com fosfoinositida 3-quinase (PI3K) de sinalização [2]. A via de sinalização de PI3K desempenha um papel essencial na proliferação de células cancerosas, a sobrevivência, o metabolismo, a motilidade e invasão. É frequentemente desregulado nas células de CRC, tornando-o um alvo terapêutico atractivo [2], [3], [4]. upregulated citocinas, factores de crescimento e seus receptores observados em células de CRC via PI3K, provavelmente, representam uma contribuição principal para a tumorigénese.
APRIL (um ligando indutor de proliferação, também conhecido como TRDL-1, TALL-2, e TNFSF13 ), é um membro da superfamília do factor de necrose tumoral (TNF), com a estrutura e função homóloga a várias outras citocinas nesta família. Foi descoberto como uma citoquina sobre-expresso por células transformadas e pode estimular a proliferação celular [5], [6]. APRIL está predominantemente expresso por tecidos tumorais, tais como carcinoma do cólon, cancro pancreático, cancro gástrico, e por células imunitárias normais, tais como as células B, monócitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células epiteliais, células-T e por algumas células não imunes tais como osteoclastos. Estudos recentes têm analisado o papel de promoção do tumor de abril em pacientes com neoplasias hematológicas ou com tumores sólidos. expressão aberrante de abril ea subsequente activação de vias pró-sobrevivência podem permitir a sobrevivência de várias malignidades hematológicas [6], [7], [8], [9]. Nas células de tumores sólidos, os estudos foram limitados à actividade de proliferação ou sobrevivência implicado no crescimento natural de tumores, o que é consistente com o actual conceito de que as reacções inflamatórias constituem uma parte importante do desenvolvimento do tumor [5], [10], [11 ]. Existem diferentes opiniões sobre a secreção de abril produzido por células de tumor ou por células que se infiltram no tumor. Mhawech-Fauceglia et al [10] demonstraram que os neutrófilos infiltrantes tumorais presentes no estoma, em vez de as células tumorais, foram a principal fonte de abril. Isto está em contraste com um estudo recente por V Lascano et al [12], que demonstraram que abril produzida por ambas as células tumorais e não tumorais teve um efeito indutor de tumores colo-rectal clara na tumorigénese. No entanto, cascatas de sinalização a jusante activados por abril que podem estar envolvidos na formação de tumores ainda não foram caracterizados. Nós confirmou recentemente que abril é sobre-expresso em carcinomas do sistema digestivo, especialmente no cólon e pâncreas [13], [14], [15]. Abril é mais altamente expresso em tumores do que em cólon normal, e APRIL-knockdown inibiu a migração e invasão de células de câncer colorretal in vitro [16]. Além disso, os níveis séricos de ABRIL medidos por ELISA em pacientes com câncer pancreático sugeriu que abril tem um valor diagnóstico e prognóstico positivo para câncer pancreático [15]. Estes estudos preliminares indicam que abril pode ter um papel importante na carcinogênese e progressão tumoral.
O presente estudo investigou o papel de abril na carcinogênese colorretal e caracterizada transdução de sinal mediada abril. linhas celulares de CRC humanos e ratos imunodeficientes foram utilizados para avaliar os efeitos da knockdown de Abril sobre as principais características do processo carcinogênico e metastático. Nós avaliamos o papel de abril na proliferação celular, ciclo celular, migração e invasão em linhas celulares de CRC e identificou os componentes moleculares e celulares relacionadas. Usando essas células CRC e tecidos modelo de xenotransplante, sugerimos que abril pode estar relacionado com tumorigênese e metástase. Além disso, observou-se que a estimulação abril mediada sinais via PI3K /Akt envolvidos na regulação do ciclo celular e invasão de células de carcinoma.
declaração Materiais e Métodos
Ética
A protocolos de estudo foram aprovados pelo animal Care e Investigação Comissão de Ética da faculdade de Medicina da Universidade Nantong. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as orientações pertinentes (Contrato 2010-0089). Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito para participar no estudo.
Pacientes e amostras de tecido
tecidos CRC foram coletados a partir de amostras de ressecção cirúrgica de oito pacientes que não haviam sido submetidos a radioterapia ou quimioterapia no Affiliated Hospital da Universidade de Nantong entre abril de 2008 e maio de 2009. As idades variaram de 45 a 71 anos, com uma média de idade de 56,9 anos. A relação masculino: feminino foi 5: 3. O diagnóstico foi confirmado histologicamente em todos os casos. As amostras de tecido foram processadas imediatamente após a remoção cirúrgica. A proteína foi analisada em oito amostras de tecidos congelados instantaneamente tumorais e não tumorais adjacentes que foram armazenados a -80 ° C.
cultura celular e reagentes
Todas as linhas celulares de CRC humano (SW480, HT-29 , Colo-205, HCT-116) foram obtidos a partir da Academia de Ciências da vida, Xangai, China, e foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, San Diego, CA) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS; Hyclone , Logan, EUA) e antibióticos (100 mg /ml de estreptomicina e penicilina 100 U /ml) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO
2. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram obtidas a partir de Fmgbio, Xangai, China, e foram mantidas em DMEM /F12 (Gibco). GM6001, LY294002 foram adquiridos a Chemicon (Temecula, CA, EUA). A rapamicina foi obtido a partir de Sigma. APRIL humana recombinante (rhAPRIL) foi adquirido a partir de Pepro Tech Inc. (EUA).
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para a detecção de APRIL
linhas celulares de CRC segregadas foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO
2 em DMEM com 0,5% de FBS durante 72 h. Os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos e a concentração de abril foi medida utilizando um kit de ELISA de abril humana (R D, MN, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de abril foi calibrado a partir de uma curva dose-resposta com base em padrões de referência. A experiência foi repetida três vezes.
A transfecção e geração de linhas celulares estáveis
knockdown células SW480 foram gerados usando ARN gancho de cabelo curto dirigido contra abril gene humano (shAPRIL) construído em pGCsi /H1 /Neo /GFP plasmídeo vector (Genechem, Xangai, China). Dois pares de shAPRIL quimicamente sintetizados foram indicados como sh637 sh1750 e [17]. Um plasmídeo que transporta uma sequência de controlo nontargeting (NTC) foi utilizado como um controlo shRNA (shNTC). As transfecções transientes foram realizados como previamente descrito [14]. Às 48 h pós-transfecção, as células foram colhidas e sujeitas a ensaio de proliferação, análise do ciclo celular, ensaios de invasão e de migração e os níveis de ARNm de abril foram determinados por transcrição reversa (RT) -PCR. Para transf ecções estáveis, os vectores recombinantes que foram transfectadas com lipofectamina 2000 (Invitrogen) e os transfectantes estáveis foram seleccionados com 600 ^ g /ml de G418. transfectantes resistentes a G418 foram clonados para estabelecer linhas celulares e analisado por RT-PCR para a expressão de ARNm de APRIL. células SW480 transfectadas estáveis foram preparadas para experiências com animais.
RT-PCR semiquantitativo
Isolamento de ARN total a partir de células cultivadas em 80% de confluência utilizando TRIzol (Invitrogen), geração de ADNc utilizando SuperScript ™ III ( Fermentas, EUA) de acordo com protocolos convencionais, e subsequente PCR foi realizada com os seguintes pares de iniciadores (5′-3 ‘): April, ACTCTCAGTTGCCCTCTGGTTG e GGAACTCTGCTCCGGGAGACTC; MMP-2, e GATGCCGCCTTTAACTGG TCAGCAGCCTAGCCAGTCG; MMP-9, e GCACCACCACAACATCACCTAT CACAACTCGTCATCGTCGAAA; TIMP-1, CAGAAGTCAACCAGACCACCT e ATTCCTCACAGCCAACAGTG; GAPDH, ACGCATTTGGTCGTATTGGG e TGATTTTGGAGGGATCTCGC. GAPDH foi exibido como o gene de controle de limpeza. Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio e visualizados por iluminação UV. Bandas foram quantificados por densitometria usando software ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
A proliferação celular ensaio
ensaios de proliferação celular in vitro foram realizados usando um celular contando Kit-8 (CCK-8; Donjindo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. shAPRIL células SW480, SW480 e células shNTC células SW480 não transfectadas foram semeadas em placas de 96 poços em DMEM com 0,5% de FBS a uma densidade de 4 x 10
3 células /poço. As células HCT-116 abril-estimuladas foram semeadas em placas de 96 poços em DMEM contendo 0,5% de FBS na presença de 100 ng /ml rhAPRIL, 400 ng /ml rhAPRIL, 800 ng /ml ou PBS rhAPRIL (grupo de controlo). As células de cada grupo foram plaqueadas em triplicado. Aos 24, 48, 72 e 96 horas, a densidade óptica a 450 nm de comprimento de onda que se correlaciona com o número de células viáveis foi medida e os resultados foram expressos como média ± SEM de A450.
Análise
ciclo celular
para a análise do ciclo celular, as células abril estimulados foram cultivadas com rhAPRIL durante 24 h, e as células shAPRIL foram colhidas 48 h após a transfecção. As células foram então lavadas com PBS, fixadas em etanol a 70% durante uma hora a 4 ° C e, em seguida, incubadas com 1 mg /ml de RNase A durante 30 min a 37 ° C. Subsequentemente, as células foram coradas com iodeto de propídio (PI, 50 ug /ml) (Becton Dickinson, San José, CA) em PBS, 0,5% de Tween-20, e analisadas utilizando um fluxo Becton Dickinson citómetro BD FACScan (San José, CA) e celular da quest aquisição e análise de programas.
análise Western blot
lisados de proteína foram separadas por 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com TBS contendo 0,1% de Triton X-100 e 5% de leite desnatado incubadas com anticorpos primários. Os anticorpos primários foram anti-humano de abril (BD, NJ, EUA), anti-pAkt, anti-Akt, anti-mTOR, anti-P-mTOR (Cell Signaling), anti-c-myc, anti-ciclina D1, anti -CDK4,-p anti-Rb anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). imunoglobulina conjugado com HRP de rato foi usado como o anticorpo secundário. detecção de sinal foi realizado com um sistema ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Bandas foram quantificadas por densitometria utilizando o software ImageJ. Os valores de densidade integrados de proteínas fosforiladas foram normalizados para proteína total para cada amostra. células não estimuladas ou não transfectadas foram dadas um valor de 1,0, e o nível de fosforilação em todas as outras amostras foi normalizado para este valor.
ensaios
invasão e migração
invasão de células do tumor foi medido através da análise de células invasão através de filtros de policarbonato -Revestido (8 mícrons de tamanho de poro), utilizando câmaras Transwell invasão (Costar, VWR Albertslaund, Dinamarca) Matrigel (BD, EUA). Resumidamente, após 48 h de transfeco, SW480 células, incluindo células transfectadas e células shAPRIL shNTC transfectadas foram tripsinizadas, e 10
5 células em suspensão em 100 ul de DMEM com 0,5% de FBS foram plaqueadas na câmara superior. Para o ensaio de invasão de células HCT-116 abril-estimuladas, experiências paralelas foram realizadas na presença de rhAPRIL a uma concentração de 100 ng /ml em 0,5% de meio de FBS na câmara superior. A câmara inferior continha 600 ul de meio DMEM com FBS a 10%. Após incubação a 37 ° C em 5% de CO
2 incubadora durante 72 h, as células na superfície superior do filtro foram removidas por limpeza com uma mecha de algodão. Os ensaios de migração com 10
6 células por poço incubadas por 48 h foram realizados usando o mesmo procedimento, mas com filtros de policarbonato sem revestimento. Onde indicado, as células foram plaqueadas sobre as pastilhas com o GM6001, ou o mesmo volume de DMSO (Sigma). GM6001 a uma concentração de 10 uM em 0,5% de meio FBS dissolvidos em DMSO foram adicionados ao meio para inibir as MMPs em ensaios de invasão celular. As células que aderem à superfície inferior da membrana foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e em seguida contados por microscopia. As células foram examinadas, contadas e fotografadas com a ampliação de 100 x com um microscópio invertido. Cinco campos diferentes foram contadas por filtro em cada grupo e cada experiência foi repetida em triplicado. Os meios de cinco campos individuais selecionados ao acaso foram obtidos para cada poço.
Medição da MMP-2 e MMP-9 de produção
MMP-2 e MMP-9 actividades foram determinadas usando um quantitativo enzima sanduíche técnica de imunoensaio. CRC células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de 4 × 10
3 células por poço em meio DMEM com FBS a 0,5% durante três dias. Os níveis de MMP-2 segregada e MMP-9 nos sobrenadantes de cultura foram determinados por ELISA. O ensaio foi realizado utilizando os kits de Quantikine MMP-2 e MMP-9 (R D, MN, EUA) de acordo com os manuais de instruções. Os níveis de MMP-2 e MMP-9 foram quantificadas a partir de curvas padrão. O ensaio permite a quantificação de a substância activa, bem como a proteína total. Cada ensaio foi realizado em triplicado. Este método foi validado contra zimografia em R D Systems
Experiências com animais
Todos os experimentos com animais foram realizados com camundongos nu de oito semanas de idade, do sexo feminino atímicos BALB /c nu /.. Os animais foram divididos em três grupos, n = 10 por grupo. células SW480 transfectadas, transfectadas estavelmente shNTC células SW480 e shAPRIL (sh637) transfectadas estavelmente células SW480 (2 × 10
6 em 100 ul de PBS) foram injectadas subcutaneamente no flanco direito de cada ratinho. O crescimento do tumor foi monitorizada externamente utilizando um paquímetro de cinco em cinco dias, até 40 dias pós-injecção. O volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: π /6 x comprimento x largura
2. Sete semanas após a injecção, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os tumores foram removidos e expressão abril de tecidos tumorais foi analisado por transferência de Western e imuno-histoquímica. Os fígados e pulmões foram removidos e fixados em paraformaldeído a 4% durante 24 h. focos metastáticos na superfície hepática macroscopicamente foram contadas auxiliado por um telescópio cirúrgica e foram confirmados microscopicamente. Em seguida, os tecidos tumorais e tecidos metastáticos foram paraformaldeído fixo, embebido em parafina e cortado em fatias. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina ou pela coloração imuno-histoquímica. Os anticorpos primários foram contra abril humano, MMP-2, MMP-9 (BD, NJ, EUA), Ki-67, ciclina D1, CDK4, p-Rb (Santa Cruz Biotechnology), P-Akt, p-mTOR (Cell Signaling ) e Ki-67 (Abcam, Cambridge, UK) para estudos de imuno-histoquímica.
a análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± SEM. A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA). análise de dados metástases do fígado foi realizada utilizando testes de Poisson eventos de distribuição. As diferenças foram consideradas significativas quando
P
. 0,05
Resultados
A expressão de abril é regulada nos tecidos CRC e linhas celulares
Nós investigamos se a expressão abril foi regulada nos tecidos examinando amostras de oito pacientes com câncer CRC usando análise de western blot. expressão de abril, no nível de proteína estava bastante elevada em todos os tecidos CRC testados em comparação com tecidos normais adjacentes (Fig. 1A). Isso sugere um possível papel para abril no desenvolvimento ou progressão do câncer no cólon. abril de ARNm foi detectada em níveis relativamente elevados de uma variedade de linhas celulares de CRC humanos em comparação com as células endoteliais da veia umbilical humana, embora os níveis de abril diferiram. Abril foi detectada em níveis relativamente mais elevados em SW480 e células HT-29 e foi intermediariamente expresso em células Colo-205. expressão abril foi fracamente detectada no HCT-116 células (Fig. 1B). As linhas celulares de cancro de cólon humano HCT-116 e SW480 foram escolhido como um sistema modelo para a investigação. Para reduzir a expressão abril, desenvolvemos duas hairpin RNAs curtos (shRNA) denominado sh637 e sh1750 [17], que foram dirigidos contra o gene APRIL humana (shAPRIL) e provocou redução significativa da expressão de abril em comparação com nontargeting controle transfectadas (shNTC) e as células não transfectadas . Seguindo shRNA transfecção, foi observada knockdown substancial do transcrito de abril em células SW480 no (FIG. 1D), os níveis tanto do ARNm (Fig. 1C) e proteína. expressão abril medida por ELISA em sobrenadantes de cultura de células de CRC demonstraram que as linhas de células segregadas diferentes níveis de abril solúvel, o que confirmou que APRIL é uma proteína segregada (Fig. 1E).
(A) análise de transferência de Western abril em oito pares de tumores colo-rectais (T) e tecidos adjacentes normais (N). # 1-8 indica os números dos pacientes. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (B) Análise de RT-PCR semiquantitativa da expressão abril em quatro linhas de células humanas de CRC (SW480, HT-29, Colo-205 e HCT-116). As HUVECs foram usadas como um controlo negativo e GAPDH foi um controlo interno. (C) As células foram transfectadas com SW480 shRNA controlo dirigido contra nontargeting (shNTC) ou o gene humano abril (sh637, sh1750), e após 48 horas, o nível de ARNm de abril foi determinada por RT-PCR semiquantitativo. GAPDH foi um controlo interno. (D) As células foram transfectadas com SW480 shNTC ou shAPRIL, e após 48 horas, os níveis da proteína de APRIL foram determinados por Western blot. β-actina foi um controlo interno. linhas celulares (E) CRC e células SW480 shAPRIL transfectadas foram cultivadas durante 72 h, e os sobrenadantes foram recolhidos e avaliados para abril secretada por ELISA.
O impacto biológico de abril em células de câncer colorretal
Para analisar as atividades de abril no CRC, que examinou os efeitos de abril knockdown e estimulação de abril, sobre a proliferação celular, migração e invasão nas linhas celulares de CRC humanas HCT-116 e SW480. CCK-8 viabilidade crescimento celular ensaio foi determinada a 24, 48, 72 e 96 h após a transfecção e estimulação APRIL. Observou-se uma diminuição significativa da viabilidade de células em crescimento sh637 SW480 transfectadas células (
P
0,05; Fig. 2A), e um aumento significativo na viabilidade celular em crescimento rhAPRIL (400 ng /ml, 800 ng /mL ) estimuladas células HCT-116 (
P
0,05; Fig. 2B) em comparação com os respectivos controlos. Para explorar o papel de abril na invasão celular CRC e metástase, foi realizada a migração celular e invasão ensaios, que foram considerados importantes
in vitro
propriedades associadas com a doença maligna das células. CRC células transfectadas com sh637 ou estimuladas com rhAPRIL (100 ng /mL) afectaram significativamente o número de células ligadas e migrar para a superfície inferior da membrana invadir, em comparação com células de controlo (
P
0,05; Figs . 2D e e). Knockdown de abril resultou na supressão significativa da migração celular e invasão da célula de uma membrana basal reconstituída (matrigel), enquanto rhAPRIL tratamento (100 ng /ml) aumentou dramaticamente a migração celular e invasão CRC. Os nossos ensaios MTT mostraram que o tratamento com 100 ng /ml rhAPRIL não visivelmente aumentar a proliferação de células HCT-116 (Fig. 2C), o que sugere que a migração celular induzida de Abril não foi associada com a proliferação celular aumentada. Os ensaios de proliferação e invasão também foram realizadas em células SW480 transfectadas sh1750, e os resultados foram consistentes com sh637 células transfectadas (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que abril desempenha um importante papel na tumorigénese e metástases de células de CRC.
(A) transfecção shAPRIL significativamente reduzida viabilidade das células ensaiadas por CCK-8 em células SW480, em comparação com o não transfectadas e shNTC transfectadas controlos. Os dados representam médias ± SEM; *
P Art 0,05 comparado com shNTC. (B) rhAPRIL (400 ng /mL ou 800 ng /ml) a estimulação significativamente melhorada a viabilidade das células em células HCT-116, em comparação com células não estimuladas; *
P Art 0,05. (C) O tratamento com 100 ng /ml rhAPRIL não aumentou significativamente a proliferação de células HCT-116. (D e E) a motilidade celular através de filtros não revestidos (migração) e através de filtros de Matrigel-revestidas (invasão) nas células SW480 transfectadas shAPRIL, rhAPRIL-estimuladas células HCT-116 e os seus respectivos controlos. As células foram coradas com violeta de cristal, visualizada por microscopia, e contadas. (D) O número de células que tinham invadido foi contado em cinco representante de baixa potência (× 100) campos (FMP) por Transwell insere. Todas as determinações foram realizadas pelo menos em triplicado, em três experiências independentes. Os números representam a média ± SEM. *
P Art 0,05 versus controles. (E) Exemplo representativo de Barra de escala D., 40 mm.
abril-knockdown inibe o crescimento de tumores e metástases de células SW480 in vivo
Como abril afetaram o crescimento de células tumorais e invasão
in vitro
, nós próxima examinou se abril influenciado o comportamento dos tumores
in vivo
em ratinhos nus BALB /c, que são imunodeficientes e suscetível à formação de tumores e metástases. Os ratinhos foram injectados por via subcutânea no flanco direito com SW480 não transfectadas, shAPRIL (sh637) SW480 transfectadas ou transfectadas shNTC SW480 células. O crescimento do tumor foi significativamente reduzido em ratinhos injectados com células de ABRIL-knockdown (shAPRIL) SW480 (
P
0,05) em comparação com ratinhos injectados com ARNsi de controlo (shNTC) e as células não transfectadas (controlo) (Fig. 3A, B e C). Os números totais de nódulos metastáticos do fígado ( 0,5 mM) em ratinhos individuais foram contados sob um telescópio cirúrgica. Os números totais de nódulos metastáticos são mostrados na Tabela 1. Os nódulos metastáticos do fígado foram confirmados histologicamente e com hematoxilina e eosina representante imagens manchadas são mostrados na Fig. 3D. Sem metástases pulmonares foram encontrados em qualquer um dos três grupos. Quando comparado com não transfectadas e transfectadas shNTC células SW480, SW480 abril-knockdown células mostraram redução da metástase para o fígado em ratinhos nus (Tabela 1, Fig. 3D). Fígado nódulos metastáticos foram observadas no grupo SW480 não transfectadas (n = 89) e grupo shNTC SW480 (n = 78), ao passo que três nódulos foram encontradas no grupo SW480 abril-knockdown (
P
0,05) ( Tabela 1). Embora o grupo shNTC formada menos nódulos metastáticos que o grupo não transfectadas, isto não foi estatisticamente significativa (
P Art 0,05). Estes resultados sugerem que abril desempenha um papel fundamental no processo cancerígeno e metastático de células SW480
in vivo
.
(A) ratos nus foram injectados por via subcutânea no flanco direito com células de controlo, shNTC As células transfectadas e shAPRIL (sh637) células transfectadas. (B) Um tumor amostra de cada grupo é mostrado. (C) Tendência do crescimento do tumor após injecção em ratinhos nus em diferentes grupos. O volume do tumor foi medida por paquímetro em cm
3. (D) Os números totais de nódulos metastáticos do fígado ( 0,5 mM) em ratinhos individuais foram contados sob um telescópio cirúrgica. hematoxilina Representante e eosina de secções 4 mícrons de fígados de grupos shAPRIL e shNTC são mostrados. A seta indica nódulos tumorais. barra de escala, 100 mm. (E) de transferência de Western e imuno-histoquímica de abril de tumores em ratos pelados a partir de cada grupo. (F) Análise imuno-histoquímica da P-Akt, p-mTOR, Ki-67, ciclina D1, CDK4, p-Rb, MMP-2 e MMP-9 em tumores de ratinhos nus injectados com células shNTC ou shAPRIL SW480. Barra de escala, 40 ^ m.
abril estimula a PI3K /Akt em células CRC
O PI3K /Akt foi avaliado a desempenhar um papel crítico na proliferação celular , migração e invasão de vários tipos de câncer. Além disso, os membros da superfamília de TNF APRIL e B-célula-factor de activação de (FABF), mediante o acoplamento com os seus receptores, foram recentemente mostrado activar a via PI3K /Akt em células B malignas [18], [19]. Assim, determinou-se a via PI3K /Akt estava envolvido na resposta celular mediada abril em células de tumores sólidos. Akt é um substrato para a PI3K, e o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é uma das principais efector a jusante de Akt. Foi avaliado o efeito de abril-knockdown da via PI3K /Akt em células SW480, medindo o perfil de fosforilação de Akt e mTOR. Abril-knockdown reduziu a fosforilação de Akt e mTOR em SW480 células por western blot (Fig. 4A). Nós também examinou se abril influenciado Akt e mTOR fosforilação
in vivo
. No rato tecidos tumorais com abril de derrubar, diminuição da p-Akt e teor de proteína p-mTOR foi observada por imuno-histoquímica (Fig. 3F, painel superior). A seguir, investigou os efeitos da estimulação de Abril sobre a PI3K /Akt em células HCT-116. Concentrações crescentes de rhAPRIL no HCT-116 células estimulado a fosforilação de Akt e mTOR, detectada 3 h após a estimulação abril de um modo dependente da dose (Fig. 4B). Subsequentemente, o pré-tratamento com LY294002, um inibidor sintético da subunidade catalítica p110 de PI3K, foi utilizada para investigar o possível envolvimento de PI3K em abril de Akt mediada por fosforilação e mTOR em células de CRC. Pré-tratamento de HCT-116 células com LY294002 significativamente inibido abril induzida Akt e da atividade da mTOR, sugerindo que Akt e mTOR fosforilação em resposta a abril era dependente PI3K (Fig. 4C).
SW480 células (A) foram transfectadas com shAPRIL (sh637) e shNTC durante 48 h e analisadas por fosforilação de Akt e m-TOR por western blot. (B) HCT-116 células foram tratadas com as concentrações indicadas de rhAPRIL durante três horas e foram analisadas quanto à expressão de fosforilação de Akt e mTOR. (C) HCT-116 células foram tratadas com as doses indicadas de LY294002, durante 24 h, e em seguida estimuladas com rhAPRIL (400 ng /ml) durante três horas, e analisadas para Akt e mTOR fosforilação. A fosforilação de Akt e mTOR foi determinada por SDS-PAGE e Western blotting. Os valores densitométricos estão listados abaixo de cada blot.
ABRIL proliferação celular mediada de células CRC através da indução de Akt e ativação de mTOR através da via PI3K /Akt
Uma vez que a proliferação de células cancerígenas é regulado pela o ciclo celular, que determinado que próxima fase do ciclo celular foi alterada em células abril-knockdown por citometria de fluxo com coloração de PI. Como mostrado na Fig. 5A, células SW480 abril-knockdown foram presos na fase G1 48 h após a transfecção e a percentagem de G0 /células em fase Gl significativamente aumentado, o que sugere que abril-knockdown impedida a entrada das células de G1 para a fase S do ciclo celular. Para entender melhor como abril-knockdown impedido a entrada da fase S de células, examinámos o efeito de shAPRIL transfecção na expressão de c-myc, ciclina D1, CDK4 (reguladores críticos da G1 /S de transição) e p-Rb. Observou-se uma redução de c-myc, ciclina D1, CDK4 e p-RB por knockdown de APRIL (Fig. 5C), o que sugere que estes factores podem estar envolvidos na regulação da proliferação celular abril. No rato tumores com knock down de abril, observou-se diminuição do conteúdo de proteína de Abril, por imunohistoquímica e western blot (Fig. 3E) e diminuição da proliferação celular (ciclina D1, CDK4, p-Rb e Ki-67) (Fig. 3F, menor painel), sugerindo que o crescimento do tumor reduzida observada até abril knockdown poderia ser o resultado de regulação abril de proliferação celular. Porque PI3K /Akt activação em fase G1 é necessária para a estabilização de c-myc e a entrada da fase S de células [20], determinou-se a regulação mediada abril de proteínas reguladoras do ciclo celular foi PI3K e Akt dependentes. Confirmámos rhAPRIL poderia induzir a progressão do ciclo da célula, aumentando significativamente a proporção de células na fase S, G2M e a expressão de c-myc, ciclina D1, CDK4, proteínas p-RB, em comparação com células não tratadas (Fig. 5B e D) . Simultaneamente, foi investigado o efeito de inibição de PI3K /Akt na progressão do ciclo celular induzida por abril de células SW480, que foram pré-tratados com o inibidor de PI3K, LY294002, antes da estimulação APRIL. Verificou-se que a activação de P-Akt e p-mTOR por abril foi completamente bloqueada pelo inibidor de PI3K LY294002, acompanhado com uma inibição significativa de c-myc, ciclina D1, CDK4 e a expressão de p-Rb (Fig. 5E). Isto sugere que abril induzida Akt e da atividade da mTOR está diretamente regulada através da PI3K /Akt. FIG. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.