Abstract

densidade microvascular (MVD) como um preditor angiogênese é ineficiente per se no prognóstico do câncer. Foram avaliados os valores prognósticos da combinação de densidade intratumoral alfa-actina de músculo liso (α-SMA) -positivo células do estroma e MVD após a ressecção curativa em carcinoma hypervascular hepatocelular (HCC) e câncer pancreático hipovascular (PC). microarrays de tecido foram construídos a partir de tumores de 305 HCC e 57 pacientes de PC que se submeteram à ressecção curativa e analisados ​​para α-SMA e expressão de CD34 por imunocoloração. Foram examinados os valores de prognóstico destas duas proteínas e outras características clinicopatológicas. Ambos baixa densidade α-SMA e de alta MVD-CD34 foram associados em HCC com a presença de metástase intra-hepática e invasão microvascular, e eles estavam relacionados com comprometimento de linfonodos e invasão microvascular no PC (

p Art 0,05) . Embora CD34 sozinho, mas não α-SMA, foi um fator prognóstico independente para sobrevida global ea sobrevida livre de recorrência, a combinação de baixa α-SMA e de alta CD34 foi um preditor de pior prognóstico para ambos os tipos de tumores e teve um melhor poder para prever a morte do paciente e recidiva precoce (

p Art 0,01). Além disso, os resultados mostram que a distribuição da maior parte das células α-SMA-positivas e células endoteliais vasculares sobrepõem, demonstrando a grande colocalização nas paredes vasculares. integridade microvascular pobre, como indicado pela alta MVD, juntamente com a cobertura perivascular baixa de células α-SMA positivos está associado a recidiva precoce, metástase desfavorável, e sobrevida curta após a ressecção do tumor. Esta descoberta destaca o significado de qualidade vascular na progressão do tumor, o que proporciona um complemento optimizado para quantidade vascular no prognóstico de pacientes no pós-operatório

citação:. WQ Wang, Liu G, Xu HX, Luo GP, Chen T, Wu CT, et ai. (2013) intratumoral α-SMA Melhora o prognóstico potência de CD34 associados à manutenção de microvasos Integridade no carcinoma hepatocelular e cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (8): e71189. doi: 10.1371 /journal.pone.0071189

editor: Johannes Haybaeck, Médico da Universidade de Graz, Áustria

Recebido: 26 Janeiro, 2013; Aceito: 27 de junho de 2013; Publicação: 05 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por a National Science Foundation Natural da China (81172005 e 81172276), a National Science Foundation Natural de Xangai (11ZR1407000), Ph.D. Fundação programas de Ministério da Educação da China (20110071120096), eo Chinesisch-Deutsches Forschungsprojekt (GZ 857). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a desregulação da angiogénese é indispensável para a metástase do tumor, e é uma das marcas de cancro [1]. suprimentos neovascularização não apenas oxigênio e nutrientes para proliferativa células tumorais, mas também serve como canal para migração [2]. a densidade microvascular (MVD) é o indicador mais reconhecido para avaliar a angiogénese de tumores sólidos. A imunocoloração de um marcador vascular das células endoteliais (CE), tal como o CD34, é utilizado para marcar MVD [3] – [6]. Tem sido relatado que MVD é um preditor adverso em vários cancros [7], [8], incluindo carcinoma hepatocelular (HCC) [3], [4] e do cancro do pâncreas (PC) [9]. No entanto, os resultados paradoxais também têm sido observados [10], [11].

O microambiente do tumor desempenha um papel essencial na tumorigênese e progressão. Além de CE vascular, fibroblastos associada a carcinoma (CAF) é o componente principal de células neste meio [12], [13]. Ele permanece controverso se células estromais que são imuno para actina de músculo liso alfa (α-SMA) representam activado CAF nos tecidos intra /peritumorais [14], [15]. Embora já relatado anteriormente que as células α-SMA positivos peritumoral se correlacionam com pior prognóstico de pacientes com HCC [16], a potência prognóstico da intratumoral α-SMA é uma questão em aberto. Recentemente, observou co-localização de α-SMA- e coloração CD34-positiva em ambos os tecidos intra e peritumoral, e acreditamos que a importância do achado é que vale a pena explorar.

Recentemente, alguns estudos clínicos revelaram que o sucesso da monoterapia com antiangiogênico é geralmente inexpressivo, com taxas de resposta objectiva baixos e benefícios de sobrevivência não significativas [17] – [19]. Outros estudos pré-clínicos demonstraram que antiangiogenesis inibe o crescimento tumoral, mas acelera a metástase [20], [21]. Estes resultados foram provavelmente relacionado com um foco na quantidade navio sozinho, ao negligenciar a qualidade da vasculatura, ou seja, a integridade microvascular (MVI). Em outras palavras, pode reduzir antiangiogenesis MVD mas prejudicar MVI, conduzindo assim a metástases [22]. Na verdade, a parede vascular tumoral é composto por um continuum de tipos de células, variando a partir de CE, as células musculares lisas vasculares, e pericitos [23], das quais as duas últimas são classificadas como células perivasculares (PVCs) [19]. Dado que é um marcador de MVD apenas para CE, que não pode representar a vasculatura integrante. Mais importante, verificou-se um padrão de co-localização de α-SMA e CD34, assim como marcadores da CE adicionais descritas por outros grupos [19], [24] – [26]. Nesta base, a hipótese de que a função das células concertada α-SMA positivos perivasculares e ECs na parede vascular é estabilizar vasos tumorais e migração de células tumorais através de bloco intra /extravasamento. Portanto, uma combinação de α-SMA e CD34 como marcadores de previsão (CD34

+ /α-SMA

+) pode ser útil na avaliação de MVI. Grande parte da evidência acumulada sobre MVI no câncer vem de estudos pré-clínicos. Sua importância na clínica, no entanto, é desconhecido.

Dois neoplasias comuns e letais, que contrastam em termos de vasculatura intra /peritumoral, são HCC e PC. Tecidos de HCC são altamente vascularizado com menor teor de estroma [3], ao passo que os de PC são pouco vascularizado, mas com estroma abundante [13]. Neste estudo, foi realizada análise de integridade vascular destes dois tipos de tumores, com representação significativa. Investigou-se o valor prognóstico da α-SMA separadamente e combinatorialmente com MVD após ressecção curativa do tumor primário, inicialmente no carcinoma hepatocelular e, em seguida, no PC. Resultados em PC confirmam aqueles encontrados no HCC.

Materiais e Métodos

Os pacientes, amostras, acompanhamento e pós-operatório Tratamento

Um total de 305 pacientes (grupo 1, tabela S1 em S1 Arquivo) submetidos a ressecção hepática curativa para HCC-comprovada patologia no Instituto do Câncer de fígado de Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan, foram examinados. Nenhum deles recebeu qualquer tratamento anticâncer pré-operatório. Estes pacientes foram observados entre outubro de 2004 e novembro de 2010, com um tempo total de follow-up de 72 meses. Os critérios de ressecabilidade, coleta de amostras, determinação do estágio do tumor e diferenciação, e procedimentos de acompanhamento foram descritos em outros lugares [27] – [29]. A sobrevida global (OS) e livre de recidiva de sobrevivência (RFS) foram definidas como o intervalo entre as datas de cirurgia e morte, e entre as datas de cirurgia e recidiva, respectivamente. Se recorrência era suspeito, tomografia computadorizada ou ressonância magnética foi realizada imediatamente; Se recorrência não tinha sido diagnosticada, os doentes foram observados até a morte ou o último acompanhamento. No último acompanhamento do estudo, 132 pacientes tiveram recorrência do tumor, e 108 foram encontrados para ter morrido. As taxas OS 1-, 3- e 5-ano eram de 88%, 65%, e 64%, respectivamente; as taxas de recorrência ao longo desses mesmos intervalos de tempo foram 25%, 42% e 43%, respectivamente.

De janeiro de 2010 a junho de 2011, 179 pacientes consecutivos com PC-comprovada patologia foi submetido à ressecção curativa no nosso instituto, com cirurgia realizada pela mesma equipe [30]. Os critérios ressecáveis ​​conheceu a Rede Nacional Comprehensive Cancer (NCCN) Diretrizes da Prática Clínica em Oncologia-Pancreatic Cancer Orientação 2010 (https://www.nccn.org). Dos pacientes de PC, 57 casos (grupo 2, Tabela S2 em S1 Arquivo) recuperadas aleatoriamente a partir de um banco de dados coletados prospectivamente foram identificados como não tendo qualquer tumor residual microscopicamente observáveis ​​(R0). Nenhum deles recebeu qualquer tratamento anticâncer pré-operatório. tumores inteiras foram recolhidos. Os tumores foram classificados de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) de classificação [31]. diferenciação do tumor foi classificada pelo NCCN orientação. comprometimento de linfonodos foi determinada a partir diagnóstico patológico pós-operatório. Todos os pacientes foram monitorados até julho de 2012, com um tempo médio de acompanhamento de 15,5 meses. As modalidades de tratamento após recidiva foram administrados também de acordo com o NCCN orientação. As taxas de OS e RFS foram definidos como acima. No último acompanhamento, 33 pacientes tiveram recorrência do tumor, e 22 tinham morrido. As taxas OS 0.5-, 1-, e 2-ano eram de 98%, 86%, e 61%, respectivamente; e os 0,5-, 1- e 2-ano taxas de recorrência durante os mesmos intervalos de tempo foram 21%, 42% e 58%, respectivamente. Outra coorte teste independente 3, incluindo 52 pacientes PC tratados em nosso instituto, também foi recolhida para o estudo (Tabela S3 no arquivo S1).

Este estudo foi aprovado pelos comitês de ética em pesquisa de Zhongshan Hospital eo Fudan Shanghai University Cancer Center. O consentimento informado foi obtido de cada paciente antes de participar neste estudo de acordo com os regulamentos pelos dois comités.

Tissue Microarray Construção, imunohistoquímica e Avaliação

Tissue microarray de construção (TMA) foi tão descrito [28]. Resumidamente, dois núcleos de coorte 1 e três núcleos para grupos 2 e 3, perfurados de cada um, tecido tumoral embebido em parafina fixado em formalina representativa, foram usados ​​para fazer TMA lâminas (Shanghai Biochip Company Ltd, Xangai, China). Dois ou três cilindros de diferentes áreas de amostras de tumor foram obtidas; em conformidade, foram preparadas um total de quatro chips TMA para coorte 1 e dois chips para grupos 2 e 3.

O marcador usado para PVC foi α-SMA [13], [19], e CD34 foi usado como marcador de CE [3], [4]. 1α hipoxia-inducible factor (HIF-1α) e anidrase carbónica IX (IX CA) foram seleccionados como a hipoxia tumoral biomarcador [24], [32], [33]. A análise imuno-histoquímica (IHC) desses marcadores em secções de TMA (4-um de espessura) foi realizado por um método de dois passos, como descrito [29]. O anti-humana anticorpo monoclonal primário de coelho α-SMA (1:100; Abcam, Cambridge, MA), monoclonal de ratinho anti-humano CD34 (1:100; Abcam), anticorpo monoclonal de coelho anti-CA IX humano (1:150; Abcam ), e anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano de HIF-1α (1:100; Sigma, St. Louis, MO) foram usadas. A incubação com os anticorpos primários foi realizada durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. O sistema de detecção Envision-plus com um polímero anti-coelho /rato (EnVision + /HRP /Mo, Dako, Glostrup, Dinamarca) foi empregado. Os produtos da reacção foram visualizadas por incubação com 3,3′-diaminobenzidina. Os controlos negativos foram tratadas de forma idêntica, mas com a omissão do anticorpo primário.

Densidade de coloração positiva em vista todo foi medida utilizando um sistema de imagem computadorizada composto por uma câmara Leica dispositivo de carga acoplada, DFC500, ligado a um Leica DM IRE2 microscópio (Leica, Cambridge, UK). Imagens de cinco campos representativos em × 200 ampliação foram capturados pelo software Leica v3 QWin Plus. Uma configuração idêntica foi usada para todas as imagens. Para a avaliação da densidade vascular, a integridade vascular, e intensidade de hipoxia, e a área de densidade óptica integrada (IOD) de imunocoloração em cada imagem foram medidas usando o software de Imagem-Pro Plus v6.2 [28]. Os resultados foram quantificados como α-SMA- ou área CD34-positivas /área total, e HIF-1α ou CA IX IOD /área total.

imuno-coloração de cortes seriados

Quinze pares (total trinta) de amostras tumorais e peritumorais correspondentes (tecido adjacente ao tumor dentro de uma distância de 10 mm) a partir de doentes com HCC e PC foram recolhidos e utilizados para a preparação de série embebidos em parafina e tecido congelado lâminas. A seção lâminas de parafina foram usados ​​para IHC de α-SMA e CD34. Oito secções transversais de cada amostra foram submetidos à análise qualitativa. O processo de IHC foi descrito anteriormente [29]. Sob × 200 ampliação, imagens de campos representativos no mesmo local de cortes seriados emparelhados com α-SMA e CD34 coloração positiva foram capturados usando um sistema de imagem computadorizada.

imunofluorescência de dupla marcação para α-SMA e CD34

As secções congeladas foram utilizados para a dupla coloração de imunofluorescência de α-SMA e CD34. O protocolo foi como descrito [29]. Após a reacção com os anticorpos primários (1:80) e lavagem subsequente, as secções foram incubadas com ambos Cy3-conjugado de cabra anti-coelho e anticorpos de cabra anti-ratinho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (ambos 1:100; Jackson, West Grove, PA) e contrastadas com 4 ‘, 6-di-hidrocloreto diamidinas-2’-fenilindole (DAPI) para corar os núcleos. Imagens representativas foram adquiridos por microscopia confocal laser.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS 16.0 software. A Pearson qui-quadrado ou teste exato de Fisher foi utilizado para comparar as variáveis ​​qualitativas, e as variáveis ​​quantitativas foram analisadas pelo teste

t-

teste ou Spearman. O ponto de corte de α-SMA ou densidade CD34 para a definição de subgrupos foi o valor médio (Fig. S1 S1 Arquivo). As características clinicopatológicas foram comparados entre os dois grupos de risco usando um teste de Mann-Whitney. Para análise de sobrevivência, as curvas de Kaplan-Meier foram sorteados, e as diferenças entre as curvas foram calculadas pelo teste Log-rank. significado prognóstico independente dos fatores de risco identificados pela análise univariada foi calculado pelo modelo de riscos proporcionais de Cox. Receiver operating análise característica (ROC) foi utilizado para determinar o valor preditivo entre parâmetros. Um valor de

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Patterns de células estromais perivasculares α-SMA positivos e ECs Distribuição

em todos os tumores recolhidos, HCC sempre mostrou um teor muito baixo de estroma, enquanto que continha PC abundante estroma (Fig. 1). Representante de alta e baixa coloração α-SMA /CD34 pode ser visto nesta figura. A densidade celular média α-SMA positivos para HCC foi 0,0540 ± 0,0611 (média de 0,0389; gama, 0,000320-0,563), e foi 0,232 ± 0,111 para PC (mediana, 0,202; intervalo, 0,0494-0,474). (Fig S1A e 1C no S1 Arquivo). A coloração específica dos vasos capilares do tipo de anti-CD34 foi observada em HCC (média MVD-CD34 de 0,116 ± 0,106; mediana, 0,0877; gama, ,00102-,545) e PC (média MVD, 0,0217 ± 0,0212; mediana, 0,0112; gama , ,00103-,0928) (Fig. S1B e 1D em S1 Arquivo). Um conteúdo rico de microvasos foi encontrado no carcinoma hepatocelular, enquanto que o teor de microvasos em PC foi fraca (Fig. 1). Em comparação com o padrão de navio homogênea no tecido do fígado ou pâncreas normal, peritumoral, a morfologia vascular intratumoral foi heterogênea (Figura 1;. A Fig. S2 no arquivo S1). A imuno-histoquímica de secções seriadas revelou uma co-localização de distribuições de coloração CD34 (Fig. 2A e 2B, 2C e 2D) e α-SMA, e uma aparência semelhante também foi encontrado no tecido peritumoral (Fig. S3 no ficheiro S1). Este fenómeno foi confirmada por dupla coloração de imunofluorescência de α-SMA e CD34, onde as células α-SMA positivos foram observados para envolver em torno CE nas paredes vasculares (Fig. S4 no arquivo S1).

Case 85 (HCC ) e do PC dos 36 mostraram alta densidade α-SMA (A, L) e valores de MVD-CD34 (d, J); que, HCC caso 226 e caso PC 19 apresentou baixa densidade de α-SMA (B, H) e MVD (E, K) (× 200). (C, F, I, L) Média Densidade α-SMA e MVD de grupos de alto ou baixo risco de HCC e PC.

* amostras independentes

t

teste mostrou diferença estatística entre os dois grupos.

(emparelhados A e B, C e D) coloração imuno-histoquímica de secções seriadas mostrou uma co-expressão padrão de α-SMA e CD34 (× 200).

Correlações entre o tumor α-SMA positivos densidade celular ou MVD e Recursos clínicopatológicos

Quando o valor médio foi definido como o ponto de corte para densidades CD34 α-SMA e, os pacientes foram divididos em subgrupos de alto ou baixo risco (Fig 1;. a Fig. S1 S1 Arquivo). Como mostrado na Tabela 1 (descrito nos quadros S4 e S5 S1 no ficheiro), em CHC, os doentes com uma baixa densidade α-SMA eram propensos a ter a presença de metástases intra-hepática e invasão microvascular, e baixa diferenciação do tumor; alta MVD foi associada com grande tamanho do tumor, α-fetoproteína alta concentração sérica, presença de metástase intra-hepática e invasão microvascular e estágio de alta TNM. No PC, baixo α-SMA foi relacionado a alta envolvimento ganglionar, invasão microvascular, baixa diferenciação do tumor e estágio de alta TNM; alta MVD correlacionada com grande tamanho do tumor, alta taxa de linfa envolvimento ganglionar, e presença de invasão microvascular. Em pacientes com CHC com cirrose (fase 4;

n

= 72), não foram significativamente menores valores α-SMA do que em pacientes sem cirrose (fases 1 a 3;

n

= 233; 18.30 % vs. 28,95%;

p

= 0,029); MVD foi distribuído igualmente entre os dois subgrupos (22,88% versus 24,34%;

p

= 0,763)

prognóstico Impacto do tumor α-SMA positivos densidade celular ou MVD diante. no pós-operatório de sobrevivência e recorrência

Na análise univariada de HCC, tamanho do tumor, diferenciação do tumor, presença de invasão microvascular e metástase intra-hepática, e estágio TNM estavam associados tanto com OS e RFS; hepatite B e antígeno positivo também foi associado com RFS. No PC, a presença de invasão microvascular foi associado com ambos OS e RFS; diferenciação tumoral também foi associado com OS; e envolvimento ganglionar foi um fator potencial impacto da RFS (Tabela 2). Os valores de α-SMA de ambos HCC e PC não foram associados com OS ou RFS (para HCC:

p

= 0,071 e

p

= 0,079, Fig 3A e 3B, para PC.:

p

= 0,072 e

p

= 0,107, Fig. 3I e 3J). O OS mediana e tempos RFS para pacientes com alta MVD foram 26,5 e 16,0 meses para HCC, e 15,0 e 9,7 meses para PC, respectivamente. Estes períodos foram significativamente menores do que aqueles para os pacientes com baixo MVD (para HCC: 57,4 e 33,1 meses, tanto

p Art 0,001, Fig 3C e 3D; para PC:. 20.0 e 17.8 meses,

p

= 0,046 e

P

= 0,008, Fig. 3K e 3L).

(A, B, I, J) A densidade α-SMA foi associada a nenhum SO nem RFS. (C, D, K, G) Baixa MVD foi correlacionada com OS prolongada e RFS. (E, F, M, N) Os pacientes em cada coorte foram classificados em quatro grupos de acordo com sua intratumoral densidade α-SMA e MVD. (G, H, O, P) Os valores preditivos de combinação de marcador e outros fatores de risco identificados pela análise multivariada foram estudados por meio de análise Receiver Operating Characteristic (ver resultados para detalhes). UICC, União Internacional contra o Câncer

Os fatores de risco identificados pela análise univariada foram reunidas em um Cox análise de risco proporcional multivariada. (Tabela 2, também descrito nos quadros S6 e S7 no S1 Arquivo). Os resultados mostram que em ambos os tipos de tumor, α-SMA não é um factor de risco independente de SO ou RFS. Alta MVD foi um fator de risco independente de OS (para HCC: hazard ratio [HR] = 4.236,

p Art 0,001; para PC: HR = 3,578,

p

= 0,018) e de RFS (para HCC: HR = 2,585,

p Art 0,001; para PC: HR = 2.230,

p

= 0,034)

Tendo em conta a reincidência. características de HCC [34], adotamos 24 meses como o valor de corte para separar precoce versus subgrupos final de recorrência do tumor. Infelizmente, nenhuma diferença foi encontrada entre os pacientes com alta e baixa α-SMA em qualquer recidiva precoce (66 a 153 vs. 89 de 152 pacientes,

p

= 0,528; A Fig. S5A no arquivo S1) ou de reincidência tarde (87 de 153 vs. 63 de 152 pacientes,

p

= 0,665). Mais pacientes com alta MVD (em comparação com os pacientes com baixo MVD) teve uma recidiva precoce (110 de 153 vs. 45 de 152 pacientes,

p

= 0,001; A Fig. S5B em S1 Arquivo) em vez de uma recidiva tardia (43 de 153 vs. 107 de 152 pacientes,

p

= 0,429). Para PC, 6 e 12 meses foram definidos como valores de corte para distinguir precoce versus recidiva tardia [35], respectivamente; nestas condições, nenhuma diferença significativa foi encontrada para α-SMA e MVD entre os subgrupos.

Para eliminar a influência do tamanho do tumor em resultado do paciente, investigamos ainda mais os fatores prognósticos no HCC subgrupo de pequeno tumor (máximo diâmetro de ≤ 5 cm,

n

= 179); no PC, tamanho do tumor não se correlacionou com OS ou RFS. Os valores MVD foram associados com OS e RFS (

p Art 0.001 e

p

= 0,001, respectivamente) neste subgrupo; que, α-SMA foi relacionada a nenhuma OS nem RFS (

p

= 0.520 e

p

= 0,153, respectivamente; A Fig. S6A a 6D em S1 Arquivo). correlações detalhadas de outros fatores com o resultado do paciente para o HCC subgrupo pequeno-tumoral estão resumidos na Tabela S8 em S1 Arquivo.

valor prognóstico da Combinação de densidade de células α-SMA-positivas e MVD e ROC Análise

os pacientes do estudo foram divididos em quatro grupos de acordo com seus valores de densidade e MVD α-SMA intratumorais: grupo I (HCC /PC:

n

= 68/14), baixa α-SMA e baixa MVD; grupo II (HCC /PC:

n

= 84/15), alta α-SMA e baixa MVD; grupo III (HCC /PC:

n

= 86/13), baixa α-SMA e de alta MVD; e grupo IV (HCC /PC:

n

= 67/15), alta α-SMA e de alta MVD (ver Tabela S9 em Arquivo S1, as características clínico-patológicas detalhadas de pacientes de diferentes subgrupos de α-SMA e MVD). análise de prognóstico mostrou diferenças significativas nas taxas de OS (

p Art 0.001 e

p

= 0,026 para HCC e PC, respectivamente) e as taxas de RFS (

p Art 0,001 para ambos), entre os quatro grupos de combinações (Tabela 2). Em HCC coorte 1, as taxas de OS e RFS 5 anos foram de 88,1% e 70,2%, respectivamente, para o grupo II; mas apenas 38,4% e 44,2%, respectivamente, para o grupo III (Fig. 3E e 3F). Em PC coorte 2, as taxas de OS e RFS 2 anos foram de 100% e 86,7%, respectivamente, para o grupo II; mas eles foram apenas 40,0% e 15,4%, respectivamente, para o grupo III (Fig. 3 M e 3N). Os resultados da análise multivariada mostrou que a combinação de α-SMA densidade e MVD foi um fator prognóstico independente para OS e RFS (Tabela 2 e quadros S6 e S7 no S1 Arquivo). Resultado semelhante foi encontrado em HCC recidiva precoce (Fig. S5C no arquivo S1) e pequeno-tumorais HCC subgrupos (Fig. S6E e 6F, e Tabela S8 em S1 Arquivo), e foi confirmado na coorte de teste PC independente 3 (

foram adotadas Fig 4) os fatores de risco identificados pela análise multivariada e da combinação de α-SMA e MVD, e seus valores preditivos foram determinados por análise ROC (Tabela 3;.. descrito nos quadros S10 e S11 em S1 Arquivo). Tumor MVD previu a morte e recorrência (

p Art 0,05). Embora α-SMA previu nem a morte nem a recorrência, a combinação de α-SMA e MVD morte precisamente previsto e recidiva precoce (

p Art 0,01 para todos). Exceto para a fase TNM e recorrência na HCC, e para a diferenciação do tumor e morte em PC, o valor preditivo da combinação de α-SMA e MVD foi maior do que outros fatores. Quando o valor de corte foi definido como o grupo III (com baixa α-SMA e de alta MVD) versus outros grupos de três, o valor preditivo negativo, valor preditivo positivo, sensibilidade e especificidade do HCC coorte 1 foram 0,749, 0,616, 0,491, 0,832 para OS e 0,616, 0,558, 0,364, 0,780 para a RFS, e de PC coorte 2 foram 0,690, 0,600, 0,409, 0,829 para OS e 0,476, 0,733, 0,333, 0,833 para a RFS, respectivamente. As áreas sob a curva desta combinação foram 0,743 /0,758 (HCC /PC) para a morte (

p Art 0.001 e

p

= 0,001, respectivamente) e 0,615 /0,790 (HCC /PC) para a recorrência (

p = 0,001

e

p Art .. 0.001, respectivamente) (Fig 3G, 3H, 3O e 3P)

intensidade da HIF-1α e CA IX Expressão em subgrupos de diferentes MVI

os valores de HIF-1α e CA IX foram utilizados como indicador de hipóxia do tumor, e suas intensidades foram divididos em quatro grupos de acordo com a combinação de a-SMA e MVD. O HIF-1α ou CA IX densidade média foi maior para o grupo de combinações I e menor para o grupo IV em HCC coorte 1 e PC Cohort análise 2 (one-way de variância,

p Art 0.001 e

p = 0,008

para HIF-1α, e

p = 0,012

e

p Art 0,001 para CA IX, respectivamente; a Fig. 5). Comparado com o grupo I, o HIF-1α ou CA IX do grupo II foi significativamente menor; em comparação com o grupo III, HIF-1α ou CA IX do grupo IV também foi menor (ambos

p Art 0,05).

O indicador de hipóxia do tumor foram HIF-1α e CA IX, e as suas intensidades foram divididos em quatro grupos, como descrito. O HIF-1α ou CA IX densidade foi maior no grupo I e menor no grupo IV, tanto para (A) carcinoma hepatocelular (HCC) coorte 1, e (B) o cancro do pâncreas (PC) coorte 2; (

p Art 0.001 e

p

= 0,008 para HIF-1α, e

p = 0,012

e

p Art 0,001 para CA IX , respectivamente).

* Em comparação com o grupo I., e

** quando comparado com o grupo III; tanto

p Art 0,05. IOD, densidade óptica integrada.

Discussão

No presente estudo, verificou-se que a baixa densidade celular intratumoral α-SMA-positivo, juntamente com altos valores MVD-CD34, é significativamente associada com uma alta incidência de trombo tumor intravascular e baixa sobrevida após a ressecção do HCC. Destes dois marcadores, apenas a MVD é um fator prognóstico independente; No entanto, a combinação dos dois tem maior poder de prever a morte do paciente e recidiva precoce. Além disso, o nosso trabalho demonstra que a localização da maioria das células α-SMA positivos perivasculares e sobrepõe-se ECs nas paredes vasculares, e não é maior do que 80% co-localização no interstício do tumor. Este achado também foi observado no PC e uma coorte de teste PC independente. Por isso, propomos que uma combinação de α-SMA e MVD pode, em parte, ser um bom indicador da MVI (CD34

+ /α-SMA

+); que MVI é mais crítica do MVD sozinho no desenvolvimento de invasão microvascular; e que MVI é fundamental para outros mecanismos subjacentes compreensão possível de antiangiogenesis como um acelerador de metástase do tumor.

A reconhecida marca CE humano é CD34. Houve relatos em um modelo de camundongo que a-SMA e CD31 de um marcador CE pode co-expressar nas paredes vasculares [24], [26]; No entanto, este não é clara na humanas. Nosso trabalho confirma este padrão de co-expressão α-SMA e CD34 (ver diagrama esquemático na Fig. S7 em S1 Arquivo). Essas células α-SMA positivos perivasculares que envolvem ECs foram identificados como o PVC, e a densidade do PVC foi usado como um indicador de MVI. Antes deste estudo, um grande desafio foi selecionar um marcador molecular apropriado de PVCs. Expressão de vários marcadores foi avaliado em PVC; isto é, NG2, derivado de plaquetas fator de crescimento-receptor beta (PDGFRβ), α-SMA, desmina e RGS5 [23], e a sua expressão pode ser específica do tecido. Apesar de alguns marcadores de PVC de HCC e PC tendo sido identificados em experiências com animais [25], [26], [36], [37], estudo de sua expressão em biópsias humanas tem sido amplamente inexplorado. Os nossos resultados sugerem que α-SMA é um marcador adequado para MVI, por causa da sua taxa-coloração positiva e expressão co-localizada com o CD34. Por conseguinte, os nossos resultados estabelecem que é um marcador de PVC. Isto é consistente com Feig et ai. [13] que considerava que os fibroblastos estromais alfa-SMA-positivo pode provavelmente representam PVCs. Pois, embora NG2 poderia ser manchado positivamente em amostras de rato [38], a investigação do mesmo e outras moléculas de previsão foram falhou em tecidos humanos recolhidos no nosso instituto (ver Fig. S8 no arquivo S1).

Os nossos resultados também demonstram que, em pacientes com tumores MVD alta, desde que a sua MVI também é alta, a probabilidade metastático pode ser baixa, e, neste caso, o prognóstico seria excelentes. Em contraste, o prognóstico pode ser pobre para pacientes com baixo MVD e também baixo MVI. integridade pobre dos vasos fornece vários caminhos para células de tumor intra /extravasamento da arquitetura vascular com vazamento, e essas células poderiam transplantar em órgãos-alvo, resultando em metástase. O que torna as coisas piores é que em áreas de colapso vascular, decorrentes da cobertura de PVC pobre, reduzido drasticamente perfusão sanguínea tumor pode resultar e produzir hipóxia regionais [19]. As células tumorais dotado-hipoxia resultante teria propriedades migratórias e invasivos através da transição epitelial-mesenquimal induzida pelo HIF-1α [22], [32], [39]. Esta situação criaria um ambiente hostil tumor onde essas células poderia facilmente invadir através dos vasos anormais e formar trombos tumor. Esta hipótese é apoiada por um excelente estudo mostrando que a depleção de pericitos causa hipóxia de tumores e metástases [22], e pelo nosso estudo anterior mostrando que o reforço da MVI alivia hipóxia e inibe a metástase [38]. Estes achados são consistentes com nossas observações clínicas. O presente trabalho também examina hipóxia biomarcadores HIF-1α e intensidades CA IX de acordo com grupos marcadores combinatórias de diferentes MVI, e encontramos o seu fato apresenta uma distribuição de gradiente. Em ambos os grupos de baixa MVD I e II, e em ambos os grupos MVD elevados III e IV, a maior correlaciona-se com a MVI inferior HIF-1α e CA IX. Como MVI é regulado não é clara. Mazzone et al. relataram que a hipoxia e a HIF-1α /-2α-proteína associada PhD2 poderia danificar MVI [24], e verificou-se que a abordagem selectiva de genes de

PhD2

resultados em MVI aumentada e melhorada a resposta do tumor à quimioterapia [40 ]. Esta última observação sugere que a MVI pode ser regulada por hipóxia /HIF-1α através de um caminho de feedback. No entanto, não temos um valor de prognóstico independente para PVCs marcados por α-SMA, que é diferente dos achados de Cooke e colegas [22]. As possíveis razões para a discrepância pode ser a heterogeneidade de vários tumores, ou o potencial falta de especificidade de α-SMA. Os nossos resultados sugerem que o exame da PVCs por si só é insuficiente; o ponto-chave, em vez disso, encontra-se na associação de PVCs com ECs.

Recentes dados emergentes, tanto do nosso grupo e outros, revelou que o fator de crescimento endotelial vascular ou do receptor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) bloqueio por sorafenib ou sunitinib leva a metástase reforçada [20], [21], [41]. Há alguns insights sobre o mecanismo desse fenômeno, mas ainda não é totalmente compreendido. Nós especulamos que provavelmente é porque alvos antiangiogenesis tanto da CE e PVC, como sunitinib pode bloquear VEGFR2 e PDGFRs [42]. No entanto, os resultados foram inconsistentes. Tabela S1. Tabela S4. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Figura S7. Figura S8.