migração

Abstract

Fundo

celular é um processo altamente complexo, regulado por vários genes , as vias de sinalização e os estímulos externos. Para descobrir genes ou agentes farmacológicos que podem modular a actividade migratória das células, o rastreio estratégias que permitem o acompanhamento dos diversos parâmetros migratórios em um grande número de amostras são necessários.

Metodologia

Na presente estudo, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de migração celular quantitativa, de alto rendimento, com base em algumas faixas phagokinetic modificados procedimento (PKT), e aplicá-lo para a identificação de genes pró-migratórias novos em uma biblioteca de genes relacionada ao câncer. Em resumo, as células são semeadas em placas de 96 poços revestidas com fibronectina, coberto com uma monocamada de contas de látex carboxilado. células móveis limpar as contas, localizadas ao longo de suas rotas migratórias, formando faixas que são visualizadas usando um, triagem microscópio de luz de transmissão automatizada. As faixas são então segmentado e caracterizada por multi-paramétricos, análises morfométricas, resolvendo uma variedade de características morfológicas e cinéticos.

Conclusões

Nesta tela nós identificamos 4 novos genes derivados de carcinoma de mama relacionado biblioteca de ADNc, cuja sobre-expressão induz alteração significativa na migração das células MCF7 estacionárias. Esta abordagem pode servir para triagem de alto rendimento para novas formas de modular a migração celular em estados patológicos, tais como metástases tumorais e invasão

Citation:. Naffar-Abu-Amara S, Shay T, Galun M, Cohen N, Isakoff SJ, Kam Z, et al. (2008) Identificação de Novos Pro-migratório, genes do cancro-associada utilizando o Screening quantitativa, Microscopia-base. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10.1371 /journal.pone.0001457

Editor do Academic: Neil Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 21 de outubro de 2007; Aceito: 18 de dezembro de 2007; Publicado: January 23, 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Israel Science Foundation e uma subvenção de NIGMS para o Cell Migration Consortium (NIH Grant U54GM64346) e pelo fundo de Kahn para a biologia de sistemas no Instituto Weizmann

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Introdução

migração celular desempenha um papel crítico em diversos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, respostas inflamatórias, a cicatrização de feridas, e a angiogénese, bem como em estados patológicos tais como invasão tumoral e metástase [1], [2]. Para explorar os mecanismos subjacentes à regulação da migração celular, uma variedade de abordagens qualitativas e quantitativas foram desenvolvidos. Estes incluem filmes de lapso de tempo de 2 e 3 dimensões, acompanhando a migração de células cultivadas ou incorporado de tecidos [3], [4], ensaios ferida de fechamento [5] – [7], ensaios de matriz de permeação [8] [9], e “gravação” da migração das células “história”, com base em ensaios, tais como a formação de PKT [10]. Este último ensaio é amplamente utilizado para estudar as actividades migratórias de diferentes tipos de células [3], [11], a matriz pode ser notada [12], [13] e perturbação da migração celular por moduladores químicos ou genéticos [14] – [19]. Tais estudos são de particular relevância para a motilidade de células de cancro, que se acredita reflectir o potencial invasivo ou metastático destas células in vivo [14], [20] – [23]. Assim, a identificação de substâncias químicas que alteram a migração de células, ou os genes específicos cujos perturbação afecta a migração celular poderia potencialmente ser utilizados para a modulação da migração celular metastático.

O objectivo do presente estudo foi o de desenvolver uma abordagem baseada em PKT para rastrear a migração de células, que é reprodutível, compatível com microscopia de alto rendimento, e fornece a informação quantitativa, morfológica e dinâmica, no processo migratório. Mostramos aqui que, enquanto o PKT registra a história integrado da atividade migratória em um único ponto do tempo, o software de imagem quantitativa, permite o cálculo de ambos os parâmetros “estáticas”, como o comprimento pista e área, e os parâmetros “dinâmicos”, tais como taxas de migração , persistência e atividade lamelar.

o ensaio de migração de alto rendimento aqui descrito, e o software de imagem desenvolvido para medir diferentes aspectos do processo migratório, proporcionar uma abordagem rápida, fiável e quantitativa para avaliar a migração de células em diversas tipos de células em cultura, sob condições variáveis, e expostos a uma variedade de perturbações químicos ou genéticos.

resultados

Desenvolvimento de um grânulo com base em ensaio de elevado rendimento PKT

críticos para o desenvolvimento deste ensaio foi o PKT selecção de grânulos adequados, com dimensões óptimas e propriedades químicas (Tabela S1). As pérolas que foram encontrados mais adequado para ensaios de PKT aplicado a uma ampla variedade de tipos de células foram carboxilato de látex modificado (LMC) de grânulos de poliestireno branco, com um diâmetro médio de 340 nm, e um teor de carga negativa de 184,7 μEq /g. Estes grânulos de formar uma monocamada homogénea e visível; a sua ligação ao substrato é suficientemente firme para evitar a separação espontânea, mas ainda susceptíveis à remoção por células que migram

A química da superfície dos grânulos foi encontrada para ter um forte efeito sobre o ensaio de PKT:. grânulos com um aldeído superfície -Modified firmemente ligado ao substrato, e não podia ser removido por células migrantes. Grânulos com uma superfície sulfatada tendiam a agregar-se, dando origem a uma monocamada não uniforme. esferas carboxiladas, com ou sem grupos sulfato adicionais, tendiam a formar suspensões homogéneas, em vez após centrifugação. A densidade de superfície dos grupos carboxilato também causou a formação de pista: uma densidade de carga de baixo (23,9 μEq /g) fez com que o talão para interagir fortemente com a superfície, de modo a que muitos tipos de células não conseguiram remover eficazmente os grânulos à medida que migraram. Grânulos com grupos carboxilato de densidade intermédia (91,4 μEq /g) foram encontrados óptima para algumas células aderentes (por exemplo, H1299, REF52), mas não para células com aderências mais fracos (por exemplo, MCF7; B16-F10). Grânulos que contêm grupos carboxilo com uma densidade de 160-185 μEq /g foram encontrados para ser óptimo para ensaios aplicados a uma vasta gama de tipos de células.

Além disso, o diâmetro das esferas teve um efeito importante sobre a visibilidade das faixas e na estabilidade da monocamada. Assim, pequenos grânulos ( 300 nm de diâmetro) dificilmente poderia ser visualizado, enquanto que grandes grânulos (~1,000 nm de diâmetro) tendem a separar a partir da superfície e, em seguida, recolocar espontaneamente, resultando em faixas mal definidos. O diâmetro do grânulo óptimo para ensaios automatizados PKT verificou-se ser cerca de 400 nm.

Desenvolvimento do sistema automatizado de microscopia

PKT ensaios foram registados utilizando um microscópio de triagem de células [24] equipado com um dispositivo de focagem automática a laser [25]. O programa operacional microscópio e o software de aquisição de imagem foram escritas como uma aplicação no ambiente de UCSF PRIISM (https://msg.ucsf.edu/ive). Para esta aplicação, as imagens foram tiradas com um objectivo de 10 × /0,4, sob iluminação de luz transmitida. Um difusor de luz foi inserido acima da placa multi-poço, para minimizar a iluminação não homogénea e evitar as sombras comumente causadas pelas paredes bem estreitas

O programa de aquisição dedicado controla a iluminação.; auto-focagem e de aquisição de imagens para todos os passos campos seleccionados dentro de cada poço, e para todos os poços seleccionados em placa, enquanto optimizando os detalhes experimentais (por exemplo, bem número, posição de campo, tempo de exposição, objectiva, configuração óptica, e similares). Para gravar um número máximo de faixas de células completas, imagens de campos adjacentes foram fundidos em uma montagem perfeita, na qual as faixas abrangendo mais de uma imagem são mescladas com alta precisão (figura S1).

Quantificação da migratória parâmetros, com base na morfometria PKT

para identificar faixas individuais, as imagens foram submetidas a “achatamento”, compensando, assim, para a iluminação não-homogênea, alisando e realce de contraste. O histograma de intensidade resultante produziu um pico principal, correspondendo ao fundo imperturbável (Figura 1c, asterisco preto); um pico de alta intensidade correspondente às faixas livres de talão (Figura 1C, azul asterisco); e de baixa intensidade pixels correspondente a células carregadas de talão (Figura 1C, um asterisco vermelho). Através da aplicação de dois limiares binários, células (Figura 1D), e pistas (Figura 1E) pode ser diferenciados uns dos outros. Detritos, arranhões, as faixas sem ou com mais de uma célula, pistas que se cruzam e faixas que se estendem para além da fronteira da montagem, foram identificados e descartados (Figura 1F, segmentos descritos em azul). Para obter fina definição de fronteiras para as faixas, que foram ligeiramente desfocada pelo passo de alisamento (Figura 1 g), limites de faixa foram recalculados a partir das imagens originais, usando análise de segmentação multiscale [26] (Figura 1h).

(a ) uma montagem de 4 × 4 campos (1024 × 1024 pixels), cada um adquiriu usando uma objetiva 10 × /0,4. (B) um único campo (512 × 512 pixels, binned 2 × 2) (c) do histograma de intensidade de pixel: o pico principal (*) correspondem a pixels de fundo; o pico menor de intensidade luminosa (*) corresponde a rastrear pixels; e os pixels escuros representam corpos celulares e detritos (*). As linhas verticais vermelhas marcar os dois limites que separam os pixels de trilha a partir das células e fundo. (D, e) as imagens binárias, após a aplicação de limiares. Pixels com intensidades abaixo do limiar mais baixo (as células e detritos) são de cor branca em (d), e os pixels com intensidades acima do limite superior (pistas) são de cor branca em (e). (F) Todos os componentes conectados de toda a montagem são descritas: As faixas são destacados em vermelho. Objetos ou muito pequenos ou muito grandes na área a ser incluído no analisa a imagem, ou localizados nas fronteiras da montagem, são esboçadas no azul. (G) o alargamento de um campo segmentada seguinte segmentação binário. (H) A mesma área representada em (g), seguindo a segmentação multi-escala, e incluindo o fino contorno da pista e os eixos de trilha. Barras de escala: 250 mm

Após a etapa de segmentação, quantificamos os vários parâmetros morfométricos para cada tipo de célula.. Os parâmetros de trilha que foram medidos automaticamente incluídos área de pista, perímetro, eixo principal, eixo menor, razão axial e solidez. comprimento do caminho pista e comprimento end-to-end foram medidos manualmente. Os parâmetros de via calculadas a partir destes parâmetros morfométricos incluem a persistência, a velocidade eficaz, a velocidade média de migração, actividade lamelar, e a direccionalidade global. Estes morfológicas e parâmetros “dinâmicos” são definidos na Tabela S2, e apresentados graficamente na Figura 2.

O cálculo automático dos vários parâmetros morfométricos utilizados neste estudo, estão demonstradas utilizando Pkts formados por H1299, B16-F10 e células MCF7. Os parâmetros calculados incluem: área total de faixas (mm

2), delineada em vermelho; área de pista líquido depois de área celular é subtraído; eixos maiores e menores (um) da elipse de melhor ajuste; razão entre os eixos; velocidade de migração [comprimento do esqueleto e ramos (verde + azul) /tempo de migração], a velocidade efetiva [distância end-to-end (de cor vermelha) /tempo de migração]; acompanhar perímetro; rugosidade [Perímetro

2 /(4π * Area)] e Solidez [área de faixa (azul) /área da casca convexa (vermelho + azul), que envolve a pista]. Os valores indicados na figura referem-se a única faixa mostrado.

Notavelmente, mesmo parâmetros aparentemente semelhantes (por exemplo, “velocidade de migração” e “velocidade eficaz”) pode variar muito. Por exemplo, células B16-F10, mostrado na Figura 2, exibiu quase a mesma velocidade de migração (62,4 um /h) como de células H1299 (67,26 um /h), enquanto que o tipo de célula último exibida uma velocidade muito mais elevada eficaz (57,26? M /h, em comparação com 20,4 uM /h em células B16-F10), indicando uma migração mais persistente do que o anterior. Para avaliar a actividade lamelar “laterais”, que afeta a largura e rugosidade das fronteiras para as faixas, medimos o perímetro pista, e os parâmetros de rugosidade e solidez calculados. Esta análise mostrou que, embora os perímetros das pistas formadas por células H1299 e B16-F10 foram quase o mesmo, o parâmetro de rugosidade foi consideravelmente mais elevada em células B16-F10 (5,2) do que em células H1299 (3.2), indicando uma maior actividade lamelar no células de melanoma. Este achado foi diretamente confirmado por filmes de lapso de tempo (Figura 3, e filmes S1 e S2).

Diferentes pontos de tempo são mostrados em que a atividade de lateral lamelar de um H1299 (painel superior) ou B16-F10 (inferior painel), as células deixam marcas na forma e rugosidade da fronteira pista. (Filmes completos estão disponíveis on-line como filme S1 e S2 Filme, respectivamente.)

Aplicação de morfometria PKT para medir efeitos específicos e induzida por drogas do tipo celular nos parâmetros migratórios

a) diferentes tipos de células produzem PKT com características distintas.

o ensaio PKT aqui descrito foi usado para testar o comportamento migratório de uma variedade de linhas celulares. Estes incluem: células de melanoma B16-F10 e B16-F1; MDA-MB-231 e MCF-7 de células de carcinoma da mama, REF52, SV80 e NIH3T3 de fibroblastos linhas; células de carcinoma pulmonar H1299, e várias linhas de carcinoma da próstata DU145 (, PC3 e CL1). Quatro destas linhas celulares (MDA-MB-231, MCF7, H1299 e B16-F10) são utilizados para os fins de ilustração (ver Figura 4A e Tabela S3). As células MCF-7, por exemplo, dificilmente migram, produzindo apenas uma pequena zona, sem talão em torno de cada célula, com uma média área de pista líquido de 4,900 ± 2,400 mm

2 (n = 93). As células de melanoma B16-F10 produzir ramificada faixas devido à extensão dos filopodios múltipla e lamela fina em grande parte perpendicular à pista principal migratório, com uma área líquida média de 7,400 ± 2,800 mm

2 (n = 124). As células MDA-MB-231 são células metastáticas altamente migratórias, produzindo faixas longas e largas com uma área útil média de 13.500 ± 6.300 mm

2 (n = 149). células H1299 são caracterizados pela migração rápida e altamente persistente, formando trilhas com uma área útil média de 14.000 ± 7.600 mm

2 (n = 104).

(a) A montagem de 2 × 3 imagens de PKT de células MCF7, bem como para as células MDA-MB-231, células B16-F10, e células H1299. Nota as diferenças na área de pista líquida (A

N) e razão axial (X), dependendo da linha celular. (B) Um montagem de imagem de células de controlo de H1299, que exibem caminhos migratórios longos que são altamente persistente 2 × 3. As imagens de montagem do Latrunculin A (4 M) – e Nocadazole (2,5 M) tenha sido tratada com poços indicam motilidade celular inibida; PMA (100 ng /mL) bem tenha sido tratada com mostra um aumento na motilidade celular. Barras de escala:. 250 um

b) Os efeitos das drogas do citoesqueleto em características estruturais e dinâmicas PKT

A fim de determinar se o nosso sistema de triagem automatizada foi capaz de detectar mudanças na. características migratórias específicas induzidas por perturbações genéticas ou químicas, que tratada células H1299 com vários compostos (por exemplo, latrunculin-a, nocodazol e PMA) que se sabe afectarem a motilidade celular. O efeito de cada fármaco sobre os diferentes parâmetros morfométricos foi então medida (Figura 4b). Uma vez que os valores para cada parâmetro PKT não pareceu ter distribuições estatísticas normais, baseamos a nossa comparação de mudanças nos valores de percentil para cada parâmetro morfométrico, em vez de em mudanças nos valores médios (Tabela S4). Análise da área de PKT de células H1299 tratadas com os diversos inibidores indicou que Latrunculin-A ou Nocodazole reduziu marcadamente áreas de pista, razões axiais, as velocidades de migração e de rugosidade, em comparação com células de controlo. Nas células tratadas com PMA, a área de PKT, eixo maior e velocidades de migração calculados aumentou (P 0,05), mas o eixo menor, razões axiais e solidez não diferiram significativamente dos das células de controlo

Aplicação. PKT do ensaio para a identificação de genes pró-migratórios de uma biblioteca de genes relacionados com o carcinoma da mama (BC1000)

o ensaio PKT aqui descrito foi utilizado para pesquisar uma biblioteca de genes relacionados com o cancro para a sua capacidade para induzir um fenótipo migratório em células epiteliais mamárias, em grande parte estacionárias. Para esse efeito, que as células infectadas em cultura MCF7 com vectores retrovirais que codificam para 55 genes seleccionados a partir da biblioteca BC1000 (Tabela S5) e testada a sua actividade migratória por meio de triagem de PKT quantitativa.

Tal como mostrado na Figura 5a e Tabela S6 , a tela PKT permitiu identificar quatro novos candidatos pró-migratórias: HOXB7, FGF7, ErbB3 e PKCζ. A 80

th valores percentuais, bem como a média e desvio padrão, são apresentados na Tabela S6. Enquanto todos os quatro genes estimulou a migração de células MCF7, os seus efeitos sobre os diferentes parâmetros migratórias diferiram. Assim, enquanto os clones FGF7 e PKCζ induzida a formação de longas faixas, persistentes, devido ao aumento de protuberâncias da membrana direccionais, as faixas alongadas, induzidas por HOXB7 ErbB3 e pareceu estar associado com várias saliências de membrana em todas as direcções. Portanto, enquanto proeminência de direcionais “saliências forward” não pode ser avaliada diretamente por morfometria pista, é evidente que o aumento do comprimento da pista que não é acompanhada por valores de rugosidade elevada é, muito provavelmente, impulsionado pelo aumento da atividade lamellipodial direcional (Tabela S6 e Figura 5). É interessante notar que, no ecrã da biblioteca BC1000, alterações no comportamento migratório foram observados para um outro gene, nomeadamente MFGE8 (também conhecida como antigénio epitelial da mama BA46). Enquanto a sobre-expressão desse gene induziu apenas realce menor na área PKT, fez aumentar consideravelmente faixa rugosidade, o que sugere que aumenta a saliência de membrana não-direccional (Naffar Abu-Amara, dados não publicados).

(a) Montagem de 4 x 4 imagens, comparando PKT produzida por células de controlo de GFP-MCF7, aos produzidos por células MCF7 que expressam os genes derivados de BC1000 HOXB7, PKCζ, FGF7, e ErbB3. Ampliação: 10 ×. Barras de escala: 250? m. (B) relação calculada entre cada um dos parâmetros morfométricos migratórios dos diferentes candidatos biblioteca BC1000, e os das células de controlo (GFP-MCF7). A abordagem estatística primária utilizada foi baseada no cálculo, para cada parâmetro, a O efeito normalizada de GFP-controle é sempre definido como zero “80

percentil.”: Um valor de zero indica que não há diferença entre o “80

valor percentil “do gene candidato, e das células de controlo. Os números que são maiores ou menores do que zero indicam um aumento ou uma diminuição, respectivamente, no 80

th valor percentual dos parâmetros testados. (Para obter detalhes adicionais, consulte a Tabela S6).

Para determinar as inter-relações entre os diversos parâmetros migratórios, foi aplicado o teste de correlação de Pearson para todos os PKT produzido por células não perturbados (Figura S2). Esta análise revelou, por exemplo, que o comprimento da pista (grande relação entre os eixos e axial) está negativamente correlacionada com a solidez pista, indicando que a produção de faixas alongadas por as células de controlo é altamente correlacionada com a actividade de protrusão lateral. Esta análise também foi aplicada a essas células que expressam os diferentes genes pró-migratórias, a fim de determinar a sua capacidade para perturbar a aparente interdependência entre os vários parâmetros migratórias. Essas análises demonstram que, superexpressão de PKCζ, HOXB7 e ErbB3 diminuiu a relação recíproca entre o comprimento pista e solidez.

No que respeita às relações entre a relação axial e as dimensões dos longas e curtas eixos, as células de controle mostram a contribuição predominante do eixo maior para o valor da relação axial, com o eixo menor exercendo um efeito limitado. Em células que expressam FGF7 e PKCζ a razão axial estava principalmente correlacionado com o eixo principal, enquanto ErbB3 e HOXB7 afectou a razão axial, alterando a largura da faixa. Parece, assim, que o reforço da migração global celular por diferentes genes pró-migratória pode ser alcançado pela modulação selectiva de uma variedade de características celulares dinâmicos, como a polarização celular e atividade membrana protrusive.

Discussão

o objectivo primário deste estudo foi o desenvolvimento de um ensaio quantitativo para a migração de células, o que pode medir várias características migratórias, e seja compatível com rastreio de alto rendimento. O grande desafio experimental envolvido na concepção tal ensaio é o aparente conflito entre a rápida aquisição de grande quantidade de dados de migração, bem como a necessidade de obter “alto teor” informações sobre o comportamento migratório de muitas células, incluindo recursos dinâmicos, como velocidade de migração ea atividade lamellipodial. Desde recolha de informação dinâmica direta sobre a migração celular é incompatível com alto rendimento, que, portanto, optou por explorar indireta, ainda reprodutível e robusto, abordagens para a obtenção de tais informações. Propomos aqui que a análise morfométrica detalhada de PKT gerado por células que migram individuais podem fornecer tais dados quantitativos, morfológicas e aparentemente dinâmicas

Os novos aspectos deste estudo que merecem discussão específica são:. (I) a escolha de contas ; (Ii) a segmentação pista e morfometria; e (iii) a análise estatística dos dados. A selecção de grânulos para o ensaio de PKT foi baseada em três propriedades do “campo de migração”: visibilidade da pista (principalmente afectados pelo tamanho das partículas, com um diâmetro do grânulo ideal de 300-400 nm); sua capacidade de formar uma camada homogênea (ideal com aldeído ou superfícies carboxilados; pobres com contas modificada-sulfato), ea capacidade de ser removido pela migração de células (ideal com carboxylated- e pobres com contas modificado por aldeído). Notavelmente, a susceptibilidade de esferas carboxiladas a remoção por células que migram está inversamente correlacionada com a densidade de superfície dos grupos carboxilato, permitindo a “sintonia fina” da camada do grânulo para o tipo de célula particular a ser testado

.

segmentação PKT e morfometria fornecida importantes insights sobre as características básicas do processo migratório. Estes incluem a actividade migratória global da célula, correspondente à área líquida PKT; migração de polaridade, que corresponde ao comprimento do eixo maior de migração (ou a razão axial); ea atividade lamelar “laterais”, medido pela solidez da faixa, entre outros valores. Com base nessa avaliação, vários parâmetros dinâmicos foram calculados, incluindo taxas de migração médios e eficazes e atividade lamelar. Naturalmente, a informação dinâmica, inferida a partir da morfologia PKT estática, é bastante indireta, ainda que os dados de alta resolução [especialmente a rugosidade das fronteiras para as faixas, medido por análise de segmentação multiscale [26]; (Figura 1H)] que pode ser correlacionada com informações dinâmicas, com base em microscopia vídeo lapso de tempo (Figura 3). Uma vez calculada para cada faixa, os vários parâmetros podem ser correlacionados uns aos outros, quer em células de controlo, ou após química ou perturbação genética.

Para os nossos propósitos, o ensaio de PKT foi utilizado para descobrir genes pró-migratórias novos numa biblioteca de genes relacionados com o carcinoma da mama. A lógica subjacente a esta abordagem é que, apesar da complexidade molecular óbvia do processo de migração celular, pode haver “genes mestres” que poderiam induzir características migratórias em uma célula estacionária. A capacidade única do ensaio PKT desenvolvemos para destacar e quantificar características individuais do fenótipo migratório, poderia, então, ligar um determinado gene pró-migratória aos mecanismos migratórios específicos. Os novos genes pró-migratórias aqui identificadas incluem: HOXB7, ErbB3, PKCζ e FGF7. Enquanto todos estes genes são conhecidos por serem “relacionadas com o cancro”, os atuais estudo aponta para a possibilidade de que sua contribuição para o processo maligno pode estar relacionado com a sua actividade pró-migratória.

Materiais e Métodos

Preparação do grânulo revestido por placas de 96 poços

de vidro de fundo placas de 96 poços (Whatmann, Inc., Clifton, NJ, USA, Cat. # 7706-2370) foram incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente, com 50 ul de solução /ml de fibronectina 10 ug dissolvidos em PBS (fibronectina, F-1141; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA). Os poços foram então lavados duas vezes com PBS e revestida com 340 nm branco esferas de látex de poliestireno (Interfacial Dynamics corporação Molecular Probes Microesferas Technologies, EUA; Produto Sem 2-300;. 1344 Lote n.). A suspensão de esferas (3,2 ml) foi centrifugado durante 5 minutos a 20800 x g, e o sedimento ressuspenso em 4 ml de PBS, até todos os grumos grânulo visíveis foram dispersos. O processo de sedimentação foi então repetida mais uma vez, após o qual as contas foram novamente suspensas em 7 mL de PBS, a uma concentração final de 0,9

12 partículas /ml. Alíquotas de 70 ul da suspensão de esferas foram adicionadas a cada poço, o qual tinha sido pré-revestidas com fibronectina e incubados a 37 ° C durante 2 h, seguido por lavagem suave com PBS (x 5), utilizando um lavador de placas (Colombo Além disso , Tecan, Suíça). Antes do plaqueamento de células, o PBS foi substituída com meio de cultura de 50 ul adequado para o tipo particular de célula usado no ensaio (ver Figura S3).

preparação de células para o ensaio de PKT

MCF7 (ATCC -HTB-22), as células MDA-MB-231 (ATCC-HBT-26), e B16-F10 (ATCC CRL-6475), foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM); células H1299 (ATCC CRL-5803-) foram cultivadas em meio RPMI-1640. Ambos os meios de cultura foram suplementados com 10% de FCS, 2 mM de glutamina, 100 unidades internacionais /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), e mantidas numa atmosfera de 5% de CO

2 incubadora humidificada a 37 ° C. Para o ensaio de PKT, 200-400 (células em 50 ul de meio) foram cultivadas em cada poço. Dependendo das dimensões de faixas típicas, conforme determinado em experimentos preliminares, o número de células plaqueadas e o tempo de incubação foram calibrados para maximizar o número de faixas de célula única, que não se cruzam. Tipicamente, 200-400 células /poço e 7 horas de incubação foram considerados parâmetros óptimos para a maioria das células.

perturbações farmacológicos da formação PKT

Para determinar os efeitos de vários inibidores farmacológicos sobre o a linha celular H1299, as células foram plaqueadas e incubadas durante uma hora, após o que foram tratadas com 4 uM Latrunculin a; 2,5 uM Nocodazole; ou 100 ng /ml de PMA (forbol 12-mirystate 13-acetato). As células foram então incubadas durante 4 horas adicionais, fixadas com paraformaldeído a 3% e lavadas duas vezes com PBS. As placas foram examinadas imediatamente, quer por meio de um microscópio de focagem automática de triagem, ou armazenado a 4 ° C durante a inspecção mais tarde.

Triagem para os genes indutores de migração

Para o rastreio de genes indutores de migração, nós selecionados 55 genes candidatos a partir da biblioteca BC1000: (https://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), reunidos no Instituto Harvard de Proteomics usando software literatura de mineração [27]. Esta biblioteca é composta de um conjunto de cDNAs de comprimento total que se sabe estarem associados com o desenvolvimento do cancro da mama. Os cDNAs são clonados em um vetor retroviral puromycin- seleccionável (JP1520) [28] usando o sistema de recombinação Criador ™ (Clontech, Mountain View, CA). Os 55 genes testados (ver Tabela S5) foram selecionados aleatoriamente a partir desta biblioteca, e foram generosamente fornecidos pelo Prof. Joan Brugge (Departamento de Biologia Celular, Harvard Medical School, EUA). Os genes foram introduzidos nas células MCF-7 através de infecção retroviral. Cada clone foi testado relativamente ao seu impacto sobre a migração de células, utilizando o ensaio de PKT. Como controlos, também gerado células MCF7 que expressam GFP JP1520. O ensaio PKT foi realizado em placas de 96 poços. Quatrocentos células por poço foram semeadas, e 8 poços foram testados para cada clone. As células foram incubadas durante 7 horas, e, em seguida, fixo, utilizando 3% de PFA. Os dados foram coletados usando o microscópio de triagem autofocus.

Análise Estatística

Uma vez que a distribuição dos parâmetros de trilha mostra distribuições não-normais, foi utilizada a ferramenta estatística percentil aos parâmetros estimativas de variabilidade. Por exemplo, o 80

percentil para a área pista é o valor abaixo que 80% da área de faixas são encontrados.

As diferenças entre o controle e culturas tratadas foram avaliadas para significância usando o Kolmogorov-Two-Sample Smirnov teste de hipótese goodness-of-fit. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

O teste de correlação de Pearson foi realizada com valores variando de 1 (uma relação linear positiva perfeita entre duas variáveis ​​testadas) para 1 (uma perfeita. relação linear negativa). Um valor de p 0,0014 foi considerado estatisticamente significativo

Informações de Apoio

Tabela S1..

Comparação das propriedades de diferentes contas usadas para o ensaio de PKT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s001

(0,03 MB DOC)

Tabela S2.

Parâmetros anotação

doi: 10.1371. /journal.pone.0001457.s002

(0,03 MB DOC)

Tabela S3. análise

PKT para as várias linhas celulares

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s003

(0,03 MB DOC)

Tabela S4. análise

PKT de H1299 células tratadas por várias drogas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s004

(0,03 MB DOC)

Tabela S5. : Lista dos genes testados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s005

(0.04 MB DOC)

Tabela S6. análise

PKT de células MCF-7 superexpressão um determinado gene pró-migratória

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s006

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Figura S1.

Um esquema descrevendo a aquisição de imagem e processo de representação visual. (A) Um modelo de uma placa de 96 poços. (B) As posições de 52 campos que podem ser adquiridos no prazo de um poço, utilizando um 10 × objectivo. (C) Um montagem de 4 x 4 imagens (1024 x 1024 pixels), correspondente à área marcada do poço. (D) A imagem de alta resolução de um campo (512 × 512 pixels) dentro da montagem (marcado em c). Barra de escala:. 250 um

doi: 10.1371 /journal.pone.0001457.s007

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Figura S2.

Auto-correlação entre os parâmetros morfométricos PKT em células de controlo, e em células que expressam genes pró-migratórias. Auto-correlação entre os vários parâmetros morfométricos foi calculado para o controlo (GFP-MCF7) biblioteca, bem como para as células que sobre-expressam os diferentes genes pró-migratórias descritos na Figura 5. Cada rectângulo é dividido por uma linha de branco em dois triângulos; cada triângulo mostra o teste de correlação de um candidato diferente. O p-valor de cada resultado da correlação é indicado abaixo do número de pontuação correlação

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s008

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Figura S3.

contorno esquemático da preparação placa de 96 poços para o ensaio PKT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s009

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Filme S1. formação

PKT por H1299, plaqueadas em esferas de poliestireno.