Abstract

aldeído desidrogenase isoforma 1 (ALDH1) foi provou ser útil para a identificação de células-tronco cancerosas. No entanto, o nosso conhecimento da expressão e atividade da ALDH1 em cancros epiteliais comuns e seus tecidos normais correspondentes ainda é praticamente inexistente. Portanto, caracterizado expressão ALDH1 em 24 tipos de tecidos normais e uma grande colecção de amostras de tumores epiteliais (seis tipos de câncer, n = 792) por coloração imuno-histoquímica. Utilizando o ensaio ALDEFUOR, ALDH1 actividade foi também examinada em 16 amostras de tumor primário e 43 linhas celulares de cancro epiteliais estabelecidos. Além disso, foram analisados ​​um câncer modelo de rato transgénico de ovário e 7 linhas celulares de cancro de ovário murino. Descobrimos que os níveis de expressão e padrões de ALDH1 em cancros epiteliais são muito distintos, e que se correlacionam com os seus tecidos normais correspondentes. Os níveis de expressão de proteína ALDH1 são positivamente correlacionados com a atividade enzimática ALDH1 medida por ensaio ALDEFLUOR. A longo prazo

cultura in vitro

não afecta significativamente a actividade ALDH1 em células tumorais epiteliais. Consistente com a pesquisa sobre outros tipos de câncer, descobrimos que a alta expressão ALDH1 está significativamente associado com resultados clínicos pobres em pacientes com câncer de ovário seroso (n = 439, p = 0,0036). Finalmente, ALDH

células tumorais br exibem propriedades de células-tronco do câncer e são resistentes à quimioterapia. Como um marcador de células-tronco novela câncer, ALDH1 pode ser usado para tumores cujos tecidos normais correspondentes expressar ALDH1 em níveis limitados relativamente restrito ou, como mama, pulmão, ovário ou câncer de cólon

Citation:. Deng S, Yang X , Lassus H, Liang S, Kaur S, Ye Q, et al. (2010) os níveis de expressão distinta e Padrões de Stem Cell Marker, a aldeído desidrogenase isoforma 1 (ALDH1), em cancros epiteliais humanas. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10.1371 /journal.pone.0010277

editor: Yihai Cao, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 01 de dezembro de 2009; Aceito: 30 de março de 2010; Publicação: 21 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do cancro da mama Alliance (LZ), o ovário Cancer Research Encontrado (Liz Tilberis Scholar, LZ), a Fundação de Caridade Mary Kay Ash (LZ), Instituto Nacional do Câncer (R01CA142776 e cancro do ovário SPORE P50-CA83638-7951 projeto 3, LZ) e Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-10-1-0082, LZ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a investigação tem prestado um grande apoio para a hipótese de células-tronco do câncer, que propõe que uma subpopulação relativamente rara de células tumorais têm a capacidade única para iniciar e perpetuar o crescimento do tumor [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Estas células, chamadas de células-tronco cancerosas ou células iniciadoras de tumores, compartilham diversas características com as células-tronco embrionárias e somáticas, incluindo auto-renovação e diferenciação multi-potentes [11], [12], [13], [14], [15] [16], [17]. cancro de células estaminais podem ser altamente resistentes à radiação ou quimioterapia [18], [19], [20], por conseguinte, o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o cancro requer uma orientação eficaz desta população de células [11], [12], [13 ], [14], [15], [16], [17]. cancro de células estaminais pode ser identificado e isolado utilizando marcadores específicos para células progenitoras normais ou células do mesmo órgão [16] haste, [21]. Vários marcadores provaram ser úteis para o isolamento de subconjuntos enriquecidas em células estaminais do cancro epitelial, incluindo CD44 /CD24 (TEM /PGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], de ligação a ATP B5 cassete (ABCB5) [22], CD90 (THY1) [23], CD61 (integrina β3) [24], a actividade do proteassoma 26S [25], bem como a exclusão Hoechst33342 [6], [26], [27].

aldeído desidrogenase ( ALDH) catalisa a oxidação irreversível de uma variedade de aldeídos alifáticos e aromáticos nos seus ácidos carboxílicos correspondentes [28]. Uma elevada actividade de ALDH é detectado na estaminais e progenitoras de células de diversas linhagens, incluindo hematopoiética [29], [30], [31], mesenquimal [32], neuronal [33], mamaria [34], [35] e da próstata [36] . O ensaio ALDEFLUOR foi originalmente desenvolvido para detectar a atividade ALDH em tecidos hematopoiéticos; o produto da reacção ALDEFLUOR fluorescente acumula nas células estaminais e correlaciona-se com a actividade de ALDH [29]. ALDH converte o substrato de ALDH, BAAA (BODIPY-aminoacetaldeído), na BAA produto fluorescente (BODIPY-aminoacetato), que é retido no interior de células viáveis. As células que expressam elevados níveis de ALDH tornar-se fluorescente brilhante (ALDH

l) e pode ser identificada e enumerada utilizando um citómetro de fluxo padrão ou isolados por separação de células para posterior purificação e caracterização. ALDECOUNT® é um

in vitro do produto de diagnóstico aprovado pela FDA

que se baseia no ensaio de ALDEFLUOR e é usado para a identificação e contagem de células estaminais para aplicações clínicas. Mais recentemente, o ensaio ALDEFLUOR tem sido aplicada com êxito para detectar as células progenitoras e estaminais cancro em tecidos não-hematopoiéticos, tais como cancros da mama e da glândula mamária [34]. O reagente ALDEFLUOR é conhecido por actuar como um substrato para ALDH1. Importante, um anticorpo específico pode ser utilizado ALDH1 para detectar cancro de células estaminais em espécimes clínicos embebidos em parafina [34]. Vários grupos independentes têm relatado que a expressão ALDH1 pode ser usado como um marcador de prognóstico para cancros epiteliais [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Portanto, o ensaio de imunocoloração ALDEFLUOR ALDH1 e pode revelar-se útil para a detecção e isolamento de células estaminais do cancro em tumores epiteliais, facilitando assim a introdução de conceitos de células estaminais de cancro para a prática clínica [34]. No entanto, o nosso conhecimento da expressão e atividade da ALDH1 em cancros epiteliais humanos e seus tecidos normais correspondentes, bem como o seu significado clínico, ainda está em sua infância. Para avançar o nosso conhecimento nesta área importante, que caracteriza a expressão ALDH1 em 24 tipos de tecidos humanos normais, bem como uma grande coleção de espécimes tumorais embebidos em parafina humanas epiteliais (seis tipos de câncer, n = 792) por coloração imuno-histoquímica. Utilizando o ensaio ALDEFUOR, ALDH1 actividade foi também examinada em 16 amostras de tumor primário e 43 linhas celulares de cancro epiteliais humanas estabelecidas. Além disso, foram analisados ​​um modelo de rato transgénico câncer de ovário e 7 linhas celulares de cancro de ovário murino em nosso estudo.

Materiais e Métodos

Tumor fresco espécimes

Os tecidos foram obtidos após consentimento por escrito dos pacientes no âmbito de um protocolo de coleta de tecido geral aprovado pelo da instituição Institutional Review Board (IRB), da Universidade da Pensilvânia. Todas as amostras foram coletadas no momento da debulking cirurgia de pacientes não tratados previamente com câncer de ovário em estágio final. Os eritrócitos foram lisados ​​com solução de cloreto de amónio. Suspensões de uma única célula foram preparados usando um filtro celular de 40 uM. As células mortas foram eliminados usando esferas magnéticas (kit celular Remoção Morto, Miltenyi Biotec) e um separador MidiMACS

Tissue microarrays

Tissue coorte rede matriz:.

um humano normal FDA tissue microarray órgão foi usada para caracterizar expressão ALDH1 em órgãos normais. Esta plataforma de arranjo de tecido incluiu 24 tipos de órgãos humanos normais com base em orientações do FDA, e cada órgão foi amostrado a partir de 3 indivíduos normais. Seis tipos de microarrays de tecido de tumor epitelial humanos foram utilizados para caracterizar a expressão ALDH1 em tumores epiteliais. Cada paciente foi representada com, pelo menos, duas biópsias de tecidos do núcleo.

Helsinki coorte:

Um tissue microarray câncer de ovário foi usado para examinar o significado prognóstico da ALDH1 no câncer de ovário. A matriz incluiu pacientes tratados com carcinoma do ovário seroso primária no Hospital Central da Universidade de Helsínquia.

As linhas celulares e Cultura de Células

Um total de 50 linhas celulares de cancro estabelecidos foram utilizados neste estudo, incluindo 15 humana da mama, do ovário humano 18, 7 de murino do ovário, e 10 do cólon humano. Todas as linhas celulares de cancro foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen). Três células humanas imortalizadas independentes ovarianos epiteliais superfície (IOSEs) foram generosamente fornecidos pelo Dr. Auersperg, e cultivadas numa combinação 01:01 de meio MCDB 199 e 105 forma (Sigma) suplementado com 15% de FBS. células epiteliais da superfície do ovário murino (Moisés) foram isoladas e cultivadas conforme relatado anteriormente [44].

Transgênicos Mice

O protocolo do estudo animal foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee ( IACUC) da Universidade da Pensilvânia. O camundongo transgênico câncer MISRII-SV40 ovário foi gerada pelo laboratório do Dr. Denise Connolly [45].

A imuno-histoquímica e Análise de Imagem

A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada utilizando o Kit Vectastain ABC como descrito por o fabricante (Vector). Os anticorpos primários que se seguem foram utilizados neste estudo: de ratinho anti-humano ALDH1 (clone: ​​44 /ALDH, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]; de ratinho anti-humano de Ki67 (1:100, DAKO) e de coelho anti-humano CD45 (1:200, Millipore). Os anticorpos foram incubados durante a noite a 4 ° C. A imunorreacção foi visualizado com 3,3′-diaminobenzidina. coloração de imunofluorescência dupla foi realizada tal como anteriormente descrito [47].

ALDEFLUOR Ensaio

ALDH actividade foi detectada utilizando o kit de ensaio de ALDEFLUOR (StemCell Technologies) tal como descrito pelo fabricante. Resumidamente, células individuais dissociadas a partir de linhas celulares ou amostras de tumor foram suspensas em tampão de ensaio ALDEFLUOR contendo um substrato de ALDH, BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA), de 1,5 uM, e incubadas durante 1 h a 37 ° C. Um inibidor específico de ALDH, dietilaminobenzaldeído (DEAB), num excesso molar de 10 vezes, foi utilizado como controlo negativo. A citometria de fluxo de dados foi analisado por BD V6.1.3 software FACSDiva (BD Biosciences) ou software FlowJo (TreeStar). As células em cultura

e isolamento de proteínas de transferência de Western

foram lisadas em 200 ul de tampão de lise contendo Tris-HCl 50 (pH 7,4), NaCl 150 mM e 1% de Triton X-100. As proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE sob condições desnaturantes e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com um anticorpo anti-ALDH1 primário (1:300, BD Pharmingen), seguido por incubação em anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1:5,000; Amersham Biosciences). proteínas imunorreactivas foram visualizadas utilizando ECL Western Blotting Substrato (Thermo Scientific).

Mammosphere cultura

culturas Mammosphere foram realizados como descrito por Dontu

et al

[48]. Resumidamente, as células individuais foram plaqueados em placas de 24 cavidades de fixação ultra-baixo (Corning) a uma densidade de 20.000 células viáveis ​​/mL e 5000 células /ml em passagens subsequentes. As células foram cultivadas num meio de cultura isento de soro mammosphere (StemCell Technologies, MammoCult) suplementado com MammoCult proliferação suplementos. Mammospheres foram recolhidas por centrifugação suave (800 rpm) após 7-10 dias e dissociados mecanicamente e ambos enzimaticamente (10 minutos em tripsina a 0,05%, 0,53 mM de EDTA-4Na).

In vivo

tumorigênico ensaio

o protocolo do estudo animal foi analisado e aprovado pelo comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Seis a oito semanas de idade ratinhos fêmea deficientes imunes foram utilizados nestes estudos. ALDH

baixa e ALDH

br (ALDH

brilhantes), as células foram isoladas por FACS classificação. As células foram suspensas em solução salina tamponada de fosfato misturado com um volume igual de Matrigel (BD Biosciences) a 10 mg /ml. Um volume total de 0,3 ml, contendo 500; subcutaneamente 5.000 ou 50.000 células, foi injectado (ovariectomizados e suplementados ratinhos estrogénio-pastilha).

ensaio MTT

ensaios MTT foram realizados em placas de 96 poços utilizando o Kit de Proliferação Celular (I) ( Roche) seguindo as instruções do fabricante.

a análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando os pacotes de software estatístico SPSS e StatView.

resultados

Expressão e distribuição ALDH1 de proteína em tecidos humanos normais

Como um marcador de células estaminais, ALDH1 foi usado para detectar células estaminais do cancro em vários tipos de tumores epiteliais humanos utilizando coloração imuno-histoquímica; No entanto, os seus padrões de expressão e distribuição em tecidos humanos normais são ainda desconhecidos. Para fazer face a esta importante questão, que caracterizou o padrão de expressão de ALDH1 em tecidos humanos normais por coloração imuno-histoquímica. Uma micromatriz de tecido humano normal de órgãos aprovado pela FDA foi usada neste estudo. Aqui, 24 tipos de órgãos humanos normais foram incluídos com base em orientações do FDA, onde cada órgão foi tomada a partir de 3 indivíduos humanos normais. Rato ALDH1 anticorpo anti-humano (clone: ​​44 /ALDH) [34], [39], [46] foi usado para detectar a expressão ALDH1. Como mostrado na Figura 1A, a coloração ALDH1 positiva foi detectada principalmente no citoplasma, e foi amplamente expressa no sistema digestivo (incluindo o epitélio do esófago, estômago, intestino e cólon, bem como o fígado e pâncreas), o sistema endócrino (incluindo a glândula supra-renal, hipófise, da tiróide e da glândula salivar) e o sistema reprodutor (ovário e testículos). Não foram observadas células positivas detectáveis ​​ALDH1 no cérebro e cerebelo (Figura 1A). Em outros órgãos, ALDH1 foi distribuído em determinadas áreas e em tipos específicos de células. Por exemplo, no baço, células positivas ALDH1 foram encontrados principalmente em leucócitos das regiões polpa vermelha, mas não na polpa branca (Figura 1A). Importante, consistente com outros relatórios [34], [46], [49], fortemente positivas ALDH1 células foram encontradas nas áreas em que as células estaminais epiteliais /progenitoras foram supostamente localizados na mama, cólon e estômago (Figura 1B). Em mama normal, as células positivas ALDH1 estavam localizados principalmente na região luminal (Figura 1B), e foram uma população relativamente rara (1-2% de células epiteliais luminais). células positivas ALDH1 pequenas também foram encontrados em estroma normal da mama (Figura 1B). Duplo coloração imuno-histoquímica demonstrou que a maioria destas células ( 90%) foram positivas CD45 leucócitos (dados não mostrados). No cólon normal, embora fracamente células positivas ALDH1 poderia ser encontrado em quase todos os criptas normais, o número de células fortemente positivas ALDH1 bastante limitado (Figura 1B). Estas células fortemente positivas estavam localizados principalmente nas bases das criptas (Figura 1B). padrões de coloração semelhantes também são vistos no estômago (Figura 1B).

A. Uma micromatriz de tecido humano normal de órgãos FDA foi usada para caracterizar a expressão e distribuição de ALDH1 em 24 tecidos. células ALDH1 fortemente positiva B. foram encontrados nas áreas em que as células-tronco epiteliais /progenitoras foram supostamente localizados na mama, cólon e estômago.

Expressão e distribuição da proteína ALDH1 em tumores epiteliais humanas

em seguida, investigamos a expressão ALDH1 em tumores epiteliais humanas utilizando matrizes de tecido. Como mostrado acima, os padrões e os níveis de expressão de ALDH1 em tecidos humanos normais são notavelmente diferentes e podem ser classificados em três tipos: 1) tecido com expressão ALDH1 ausente ou é reduzida, tal como cancro da mama ou do pulmão; 2) tecido com expressão ALDH1 relativamente fraco, como de cólon ou epitélio gástrico; e 3) de tecido com a expressão elevada de grande e ALDH1, tais, como o fígado ou pâncreas (Figura 1A). Assim, escolhemos seis tipos (mama, n = 69; pulmonar, n = 66; ovário, n = 65; cólon, n = 67; fígado, n = 67; e câncer pancreático, n = 19) dos cancros epiteliais cujas correspondente epitélios normais eram representativas de cada subtipo. Em todos os seis tipos de tumor, um grande número de células do estroma-se infiltram no tumor positivas ALDH1 foram encontrados (Figura 2B). imunomarcação dupla demonstrou que a maioria destes eram células positivas CD45. A percentagem de células tumorais positivas para ALDH1 em ilhéus tumorais foi quantificada independentemente por dois investigadores, com formação patológica. células positivas estromal ALDH1 foram excluídos desta análise. Descobrimos que a expressão ALDH1 foi negativo em 79,7% (55/69) de mama, 18,2% (12/66) de pulmão e 23,1% (15/65) dos casos de câncer de ovário. Pelo contrário, apenas a 6,0% (4/67) dos dois pontos e 5,3% (1/19) dos cânceres de pâncreas foram ALDH1 negativo, e todas as amostras de câncer de fígado foram ALDH1 positivo. Além disso, para aqueles tumores positivos ALDH, a percentagem de células de tumor que expressam ALDH1 foi também analisada. A percentagem detalhada das células cancerosas positivas ALDH1 está resumida na Figura 2C. Excepto no caso de cancro da mama (4,3%), uma alta percentagem de expressão ALDH1 (entre 75 a 100% das células tumorais) foi encontrada em cada uma das outras cinco tipos de cancro (de ovário: 29,2%, cólon: 38,8%, pulmão : 43,9%, 78,9% de pâncreas e fígado: 97,0%). Tomados em conjunto, houve uma correlação clara da expressão ALDH1 entre tumores e tecidos normais correspondentes. Por exemplo, naqueles tipos de cancro onde ALDH1 foi altamente expressos nos epitélios normais correspondentes, tais como cancros do fígado e pâncreas, ALDH1 foi expresso na maioria das espécies de tumores em níveis extraordinariamente elevados.

Tissue microarrays foram utilizados para caracterizar a expressão e distribuição de ALDH1 em cancros (n = 353). A. Expressão de ALDH1 nos tecidos normais correspondentes. células infiltrantes tumorais B. ALDH1 + foram detectados no estroma. C. Expressão de ALDH1 em tumores epiteliais. Percentagem de células ALDH1 + tumor foi resumido. D. alta porcentagem de células ALDH1 + estava associado com resultados clínicos pobres de câncer de ovário seroso.

Tem sido relatado por grupos independentes que uma elevada percentagem de células tumorais positivas ALDH1 está associado com menor período de sobrevivência em mama [34], [37], [42], do pulmão [38], pancreático [40], da bexiga [41] e [43] da próstata doentes com cancro. Testamos o valor prognóstico da ALDH1 usando uma matriz de tecido de câncer de ovário seroso, o histotipo mais comum de câncer epitelial de ovário humano. Os espécimes foram coletados a partir do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Central da Universidade de Helsínquia. A mediana do tempo de seguimento de pacientes vivos no final do período de estudo foi de 101 meses, variando de 4 a 475 meses. Os pacientes foram divididos em dois grupos com base em imunocoloração ALDH1: ALDH1 baixo ( 10% de células tumorais foram ALDH1 positivo) e ALDH1 alta (células tumorais ≥10% foram ALDH1 positivo). Consistente com os resultados a partir da mama [34], [37], [42], do pulmão [38], pancreático [40], da bexiga [41] e da próstata [43] pacientes com cancro, verificou-se que os pacientes com elevada ALDH1 tinham doença mais curto tempo de sobrevida livre e global em comparação com aqueles com baixa ALDH1 (p = 0,0036 e p = 0,023, respectivamente, Figura 2D).

atividade enzimática ALDH1 nas células tumorais epiteliais

O reagente ALDEFLUOR, originalmente desenvolvido para detectar a actividade de ALDH em tecidos hematopoiéticos [29], é conhecido por actuar como um substrato para ALDH1. Recentemente, o ensaio ALDEFLUOR tem sido aplicada com êxito para detectar ALDH

Br em cancro de células estaminais a partir de tumores não-hematopoiéticas [34]. No presente estudo, utilizou-se este ensaio para examinar ALDH1 atividade enzimática nas células tumorais epiteliais

in vitro

. Em primeiro lugar, para validar os resultados da matriz de tecido, escolhemos as linhas celulares a partir de três tipos de tumores epiteliais, incluindo da mama (n = 15), do ovário (n = 18) e do cólon (n = 10). Como mostrado na Figura 2, a percentagem de tumores com uma elevada frequência de células positivas ALDH1 foi maior no cancro de cólon em comparação com cancro da mama ou do ovário. Consistente com este achado, verificou-se que a percentagem de ALDH

células Br em linhas celulares de cancro do cólon (15,5 ± 11,5%) foi notavelmente superior ao de mama (3,5 ± 4,8%) ou de ovário célula cancerosa (6,2 ± 13,5%) linhas (Figura 3B e Tabela S1). Para confirmar ainda mais este resultado, detectamos a expressão da proteína ALDH1 por Western blot nestas linhas celulares. Como esperado, os niveis de expressão de proteína ALDH1 foram correlacionados positivamente com a percentagem de ALDH

br células nas linhas de células (Figura 3C e Figura S3). Embora tenha havido uma clara correlação positiva entre

In situ

imunocoloração e os resultados do ensaio ALDEFLUOR nestes três tipos de tumores, a percentagem de células que apresentam actividade enzimática ALDH1 por citometria de fluxo era menor do que a percentagem de células positivas por imunocoloração ALDH1 . Por exemplo, 4,3%, 29,2% e 38,8% dos espécimes da mama, do ovário e do cancro do cólon altamente expressos ALDH1 (entre 75 a 100% das células tumorais foram ALDH1 positivo, A Figura 2C), no entanto, nenhuma das linhas de células tumorais foram feitos de maior do que 75% de ALDH

células Br (Tabela S1). Em seguida, nós escolhemos o cancro do ovário como um exemplo para investigar a actividade enzimática da ALDH em células de tumor primário. Foram examinados espécimes de cancro do ovário Dezasseis de fase tardia. Uma vez que descobrimos que os leucócitos infiltrantes tumorais expressaram niveis elevados de ALDH1 (Figura 2B), que em primeiro lugar separados células de ascites por CD326 (EpCAM, um marcador epitelial para a porta do população de células tumorais) ou CD45 (uma máquina de linfócitos a população de linfócitos) depois a remoção de células mortas, utilizando pérolas magnéticas. O ensaio ALDEFLUOR foi usado para detectar células com actividade de ALDH em cada população de cima (Figura 4A). Descobrimos que 2,6 ± 3,1% (0,1-11,3%) de células positivas para CD45 foram ALDH

lg (Figura 4B). Consistente com o estudo linha de células, 1,1 ± 1,9% (0,1-7,0%) de células tumorais positivas CD326 foram ALDH

br (Figura 4B), percentual menor do que nos resultados de positividade.

A. ALDH1 actividade enzimática foi detectada utilizando o ensaio de ALDEFLUOR. DEAB foi usada para inibir a reacção de ALDH com o reagente ALDEFLUOR, proporcionando um controlo negativo. B. Resumo da actividade enzimática estabelecida ALDH1 na mama (n = 15), do ovário (n = 18) e linhas de células de cancro do cólon (n = 10). a expressão da proteína C. ALDH1 foi detectado por Western blot. Houve uma correlação positiva entre a expressão da proteína ALDH1 e atividade enzimática ALDH1. borrões de corpo inteiro são apresentados na Figura Suplementar S3.

A. ALDH1 actividade enzimática em células isoladas a partir de uma amostra de cancro do ovário. As células mortas foram eliminadas usando esferas magnéticas e um separador MidiMACS. Para imunofenotipagem de ALDH

células br ascite, APC-CD45 ou APC-CD326 foi utilizado para contracoloração. DEAB foi usada para inibir a reacção de ALDH com o reagente ALDEFLUOR, proporcionando um controlo negativo. B. Resumo das percentagens de ALDH

br em cada população de células de pacientes com câncer de ovário 16 em estágio final.

Para abordar a questão de saber se a longo prazo

in vitro

cultura afetará significativamente a atividade da ALDH em linhas celulares de cancro, nós escolhemos um modelo de rato transgénico câncer de ovário, em que um oncogene (região transformadora de SV40) foi overexpressed pela superfície do ovário específica do receptor de Müller inibir tipo de substância II (MISRII) promotor (Figura S1A). O ensaio foi realizado ALDEFLUOR em ambas as células de tumor e dois isolados primários culturas a longo prazo de linhas celulares de tumores (mais de 40 passagens) que foram isoladas a partir do mesmo modelo. Verificou-se que não havia nenhuma diferença significativa na percentagem de ALDH

células br entre os tumores primários (9,5 ± 7,6%, n = 5) e culturas de células de longo prazo (6,8 ± 4,9%, n = 2, P 0,05 , Figura S1B). Uma vez que apenas um número limitado de linhas celulares foram analisados ​​no presente estudo, esta conclusão precisa mais validar em outros modelos.

Finalmente, comparamos a atividade ALDH em células de câncer de ovário e de seus correspondentes epitélios normais, as células epiteliais da superfície do ovário. Três linhas de células imortalizadas humanas epiteliais do ovário superfície foram comparados com 18 linhas de células de cancro do ovário humano e células de superfície de murino primários isolados ovarianos foram comparados com 7 linhas celulares de cancro do ovário murino (incluindo duas linhas do MISIIR-SV40 ratinho transgénico). Verificou-se que a percentagem de ALDH

células br era relativamente mais elevada em células epiteliais da superfície do ovário normal (humano: 13,1 ± 6,72%, n = 3; murino: 7,6%, n = 1) em comparação com células de cancro do ovário (humanos: 6,2 ± 13,5%, n = 18; murino: 3,8 ± 2,92%, Figura S2). Do mesmo modo, a percentagem de ALDH

células br era relativamente mais elevada em células epiteliais mamarias normais (8,18 ± 4,31%, N = 14) [34] em comparação com células de cancro da mama (3,5 ± 4,8%, n = 15, figura 3) .

ALDH

células tumorais br tenham propriedades de células-tronco cancerosas e são resistiu à quimioterapia

tem sido demonstrado que

células tumorais br ALDH isolado de tumores humanos primários ou de curta passagens -TERM de células de NOD /SCID têm propriedades de células-tronco do câncer [34] e são resistentes à quimioterapia [50], [51]. Para examinar as propriedades de células-tronco do câncer de ALDH

células br isolados a partir de linhas de células cultivadas de longo prazo estabelecidas, ALDH

baixa e ALDH

células tumorais br foram isolados a partir de mama humana estabelecida e linhas de células de cancro do ovário por FACS classificação. Em primeiro lugar, a sua capacidade de auto-renovação foi examinada utilizando o ensaio mammosphere [48] em quatro células de cancro da mama. O número de mammospheres formados por ALDH

células tumorais BR foi significativamente mais elevada do que pelo ALDH

células tumorais baixos (Figura 5A). ALDH

células baixos a partir de linhas de células ZR-75-1 T47-D e não tinham a capacidade de formar mammospheres em cultura em suspensão. Em seguida, examinamos a sua

in vitro

capacidades de crescimento tumoral utilizando o ensaio de formação de colónias em linhas celulares de cancro da mama 5. ALDH

células tumorais br formado colónias visivelmente maior em comparação com ALDH

células tumorais baixos (Figura 5B). Além disso, os números de colónias de ALDH

células tumorais BR foram significativamente mais elevadas do que a partir de ALDH

células de tumor de baixo (Figura 5B). Finalmente, o

in vivo

capacidade tumorigénico da ALDH

baixa e ALDH

br células tumorais foi examinada utilizando células tumorais que foram enxerto transplantado (500, 5.000, ou 50.000) a ratinhos imunodeficientes . Nós descobrimos que 500 ALDH

br mas não ALDH

células de baixa tumorais foram capazes de gerar tumores de xenoenxerto

in vivo

(Figura 5C). Histologia dos três tumores de xenoenxerto foi examinado por coloração HE. Em MCF-7 e linhas de células SKBR-3, não houve diferença histológica significativa entre ALDH

br e ALDH

tumores de baixo. células estromais No entanto, em BT-474 tumores, foram limitados em ALDH

tumores br comparação com ALDH

tumores de baixo (Figura 5D).

In vivo

proliferação celular também foi examinada usando Ki-67 coloração. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa no índice de proliferação (percentagem de 67 Ki-células positivas) entre a ALDH

br e ALDH

tumores baixos em todas as três linhas de células (Figura 5E).

UMA. ALDH

populações de células br (azuis) gerado números significativamente maiores de mammospheres comparação com o ALDH

população de baixa (amarelo). B. tumorigenicidade da ALDH

br e ALDH

células baixas foram examinados

in vitro

usando ensaios de formação de colónia. C. tumorigenicidade da ALDH

br e ALDH

células baixas foram examinados

in vivo

. D. Histologia da ALDH

br e ALDH

Baixa BT-474 tumores foi examinado por coloração HE. E. Proliferação da br ALDH

e ALDH

baixos BT-474 tumores foi examinado por Ki-67 imunocoloração.

evidências rapidamente acumuladas sugerem que as células-tronco cancerosas pode ser altamente resistente à radiação ou quimioterapia [18], [19], [20]. Consistente com estes resultados, verificou-se que o

população de células br ALDH é expandida em um conjunto de linhas celulares de cancro de platina resistentes ovarianos, A2780 /CP70, A2780 /C200 e A2780 /C30, em comparação com sua platina parental linha sensível, A2780 /WT (Figura 6A). Além disso, o tratamento das células com cis-platina (1XIC

50) enriquecido significativamente a ALDH

população de células Br em linhas celulares de ovário e cancro da mama

In vitro

(Figura 6B). O ALDH

população br foi significativamente mais resistentes ao tratamento de platina em comparação com o ALDH

população de baixa (Figura 6C). Por último, testamos a observação acima

in vivo

usando um mouse modelo de xenotransplante de cancro do ovário. Três semanas após a implantação das células tumorais, células A2780 (5 x 10

6 por animal), os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos experimentais a receber o tratamento por via i.p. injecção com 1) o tratamento de controlo (n = 4), 2) tratamento de 2 mg /kg de cis-platina (½ dose máxima tolerada (MTD), n = 3) e 3) tratamento de 4 mg /kg de cis-platina (MTD completo, n = 3). O q7d × 4 i.p. esquema de tratamento (Figura 6D) foi usado para a terapia experimental. Percentagem da população ALDH positivo foi analisada pelo ensaio ALDEFLUOR. Consistente com nosso

in vitro

de dados, tratamento de cis-platina aumentou significativamente o

população de células br ALDH no tumor xenoenxerto

in vitro

(Figura 6D, ½ MTD: 8,44 vezes da média ; MTD total: 4,67 vezes em média, em comparação com tumores não tratados). Ele sugere que ALDH

população de células tumorais BR é resistente à quimioterapia. Resultados semelhantes também foram relatados no câncer de cólon

in vivo

mais recentemente por um grupo independente [50].

A. ALDH

células br foram notavelmente ampliado em linhas de células resistentes de platina (A2780 /CP70, A2780 /C200 e A2780 /C30) em comparação com a sua linha sensível platina parental (A2780 /WT). B.

In vitro

tratamento de platina aumentou significativamente a ALDH

população de células br em linhagens de células do ovário e câncer de mama depois de três dias. C. ALDH

células br eram resistentes ao tratamento de platina. ALDH

br e ALDH

células baixas foram isoladas por FACS classificação. D. ALDH

população de células tumorais br era resistente à quimioterapia

in vivo

. O q7d × 4 i.p. esquema de tratamento foi utilizado para a terapia experimental. Os tumores foram recolhidos e dissociados por digestão com enzimas. Percentagem da ALDH

população br foi analisada pelo ensaio ALDEFLUOR.

Discussão

Como uma nova abordagem, o ensaio ALDEFLUOR e ALDH1 imunocoloração pode ser útil para a detecção e isolamento de células-tronco cancerosas em tumores epiteliais, facilitando assim a aplicação de conceitos de células-tronco do câncer para a prática clínica [34]. Descobrimos que o padrão e nível de expressão de ALDH1 em condições normais tecidos humanos são notavelmente diferentes e podem ser classificados em três tipos: 1) tecido com expressão ALDH1 ausentes ou limitados, tais como mama ou de pulmão; 2) tecido com expressão ALDH1 relativamente fraco, como de cólon ou epitélios gástricas; e 3) de tecido com a expressão elevada de grande e ALDH1, tais como fígado e pâncreas (Figura 1A).