Abstract
MKT-077, um corante rhodacyanine, foi mostrado para produzir a morte celular específica câncer. No entanto, as complicações impedido a utilização deste composto para além de ensaios clínicos. Aqui descrevemos YM-1, um derivado de MKT-077. Descobrimos que YM-1 foi mais citotóxica e localizada de modo diferente do que MKT-077. YM-1 demonstrou isso citotoxicidade em várias linhas celulares de cancro. Esta toxicidade foi limitado a linhas celulares de cancro; modelos celulares imortalizadas não foram afectadas. Breves aplicações de YM-1 foram encontrados para ser não-tóxico. O tratamento breve com YM-1 restaurou a sensibilidade tamoxifeno a um modelo de células MCF7 resistentes ao tamoxifeno refratário. Este efeito é potencialmente devido à fosforilação estrogênio receptor alfa alterada, um resultado precipitada por reduções selectivas dos níveis de Akt (Akt /PKB). Assim, poderiam ser feitas modificações no andaime rhodocyanine para melhorar a eficácia e propriedades farmacocinéticas. Além disso, o impacto sobre a sensibilidade tamoxifeno poderia ser um novo utilitário para esta família composto
Citation:. Koren J III, Miyata Y, Kiray J, O’Leary JC III, Nguyen L, Guo J, et al. (2012) Rhodacyanine Derivative seletivamente alvos células cancerosas e vence a resistência Tamoxifen. PLoS ONE 7 (4): e35566. doi: 10.1371 /journal.pone.0035566
editor: Leonard Petrucelli, Clínica Mayo, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de fevereiro de 2012; Aceito: 17 de março de 2012; Publicação: 26 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Koren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Dr. Dickey foi apoiado pela Associação de Alzheimer, CurePSP (paralisia supranuclear progressiva), Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional sobre Envelhecimento (NIH /NIA) R00AG031291 e NINDS (Instituto Nacional de Distúrbios neurológicos e Derrame) R01NS073899. Dr. Gestwicki foi apoiado pelo NIH R01NS059690. Dr. Cheng foi suportada por James Esther Rei Grant 1KG02-33967. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
toxicidade e crescimento inibição específica do câncer MKT-077, um rhodacyanine catiônica, demonstrou
in vitro
e
in vivo
através de múltiplas variedades de câncer [1]. Determinou-se que MKT-077 localizada nas mitocôndrias [1]. MKT-077 entrou em ensaios clínicos para o tratamento de tumores sólidos avançados refractários e de várias origens celulares, incluindo: rim, pulmão, próstata, cólon, adenocarcinomas e melanomas [2], [3]. O efeito lateral negativo principal observado em ambos os estudos foi a toxicidade renal [2], [3]. A toxicidade observada interrompida recrutamento para um ensaio como estudos animais semelhantes mostraram toxicidade renal irreversível, após administração de MKT-077 [2], [3]. Mais tarde descobriu-se que MKT-077 interagiu com mortalin (MOT-2), uma proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) um membro da família, e que a interacção de MKT-077 com MOT-2 induziu a libertação do supressor de tumor p53 a partir de um complexo com MOT-2 [4]. Este complexo mot-2 /p53 inativado as capacidades de supressão do tumor de p53 sequestrando-o no citosol
in vivo
[5].
Os cancros da mama estão entre os cancros mais comuns diagnosticados em mulheres [ ,,,0],6]. Os dados publicados afirma que o tratamento de células MCF7, um modelo celular de cancro da mama, com MKT-077 produz citotoxicidade e altera o crescimento [1], [2]. No entanto, nos resultados de dois estudos de Fase I de ensaios clínicos publicados, nenhum paciente com um tumor da mama sólido ou tumor da mama refractário foram incluídos no estudo [2], [3]. Embora existam numerosos quimioterapia para câncer de mama, resistência a terapias contra o câncer de mama pode surgir em cerca de 30% das mulheres tratadas para câncer [7] mama. resistências conhecidos em cânceres de mama têm sido observados para as estratégias anti-câncer não só padrão, tais como doxorrubicina, mas também o trastuzumab e tamoxifeno (4-OHT) [8], [9], [10].
Breast cancros também têm uma alta prevalência de mutações; mutações que podem promover a sobrevivência e a tumorigénese [11]. Embora essas mutações produzem alvos para tratamentos, outras mutações podem superar sinalização circuitos de rede em cascata para eliminar alvos a montante [12], [13]. Isto reduz o número de alvos potenciais, reduzindo o quadro de opções de tratamento, e aumentando o potencial para a génese de resistência. Além disso, a resistência pode surgir quando as proteínas reguladoras são alteradas para permitir que as proteínas pró-sobrevivência de agir sem diminuir. Várias cinases relacionadas com a sobrevivência da célula têm sido implicados na resistência à quimioterapia facilitando [14], [15], [16], [17], [18]. Por exemplo, a fosforilação do receptor alfa de estrogénio (RctE) faz com que ERa de se tornar activa, independentemente do estrogénio de ligação, o que resulta em resistência a 4-OHT. Assim, as estratégias para re-sensibilizar células cancerosas refratários ao existente terapias são extremamente necessários.
Nestes dados, identificamos um derivado funcional do MKT-077, que mostrou aumento da citotoxicidade através de múltiplas variedades de câncer, mantendo a especificidade do câncer associado com MKT-077. Esta actividade aumentada foi devido à localização intracelular do composto. Além disso, tratamentos curtos com YM-1 foram capazes de resensitize células cancerosas que tinham desenvolvido resistência à ERa antagonista, o tamoxifeno. Uma maneira em que estes compostos estão trabalhando é reduzindo os níveis totais de Akt, que podem contribuir para ERa insensibilidade ao tamoxifeno. Combinados, o cadafalso rhodacyanine tem um grande potencial como um cancro terapêutica tanto como uma estratégia de tratamento individual, mas também, potencialmente, como combinações ou a opção sinérgico para uso com regimes existentes.
Métodos
Linhas Celulares
O tamoxifeno resistente (TR-MCF7) e MCF7 células parentais foram generosamente fornecidos pelo Dr. Jin Cheng Q. de Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). A linha de MCF7 foi originalmente gerada pela Fundação do Câncer Michigan e foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) eo TR-resistência foi produzido por tratamento de dose baixa crónica com tamoxifeno. As células HEK-293, M17, H4, MDA-MB-231, Hs578T e NIH-3T3 foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). As células HeLa foram generosamente fornecidos pelo Dr. Kenneth E. Ugen na Universidade de South Florida. Ele originalmente obtidas-los de ATCC (Manassas, VA). Estas células foram geradas a partir de um tumor do colo do útero de Henrietta Lacks.
Chemicals e anticorpos
O azul de metileno (MB) foi adquirido a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). MKT-077 e YM-1 foram sintetizados como descrito [19]. Anti-Akt1, Akt2, e pAktS473 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-ERa e pERα S167 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-actina foi adquirido de Sigma Aldrich. Anti-GAPDH foi comprado de Meridian Life Science (Memphis, TN).
Cultura de Células e tratamentos com medicamentos
MCF7, MDA-MB-231, células Hs578T e HeLa foram cultivadas como descrito anteriormente [ ,,,0],20]. As células H4 e HEK-293 foram cultivadas em OPTI – meio de Eagle modificado (OPTI-MEM) a partir de Invitrogen, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e Penstrep (Invitrogen) a 1%. As células M17 foram cultivadas em OPTI-MEM suplementado com 10% FBS, 1% de Penstrep e 100 mg /L de piruvato de sódio. As células NIH-3T3 foram cultivadas em DMEM com bicarbonato de baixo teor de sódio (1,5 g /L) a partir da ATCC, suplementado com 10% FBS e 1% de Penstrep. células MCF7-TR foram cultivadas em DMEM (descrito com células MCF7) suplementado com 10? M de 4-OHT. MKT-077 e YM-1 foram dissolvidos em DMSO. DMSO foi usado como veículo para MKT-077 e YM-1, onde indicado. estratégias de tratamento exatos acompanhar os dados na seção resultados. Coleção
Protein, quantificação e transferência de Western
As células foram colhidas por aplicação de reagente de extração de proteínas de mamíferos (Thermo) como descrito anteriormente [20]. medição de nível de proteína, de equilibração, transferência de Western, e a detecção foram realizadas como anteriormente descrito [20].
Lactato Desidrogenase (LDH) Ensaio
linhas celulares indicadas foram plaqueadas em meio designado. Uma vez que as células atingiram -95% de confluência, MKT-077 ou YM-1 foi aplicada em DMEM sem vermelho de fenol. Após tempos indicados por experimento, o meio foi recolhido a partir de cada tratamento e centrifugadas para sedimentar as células mortas e detritos. Protocolo foi seguido como fornecida a partir de Cytotox-96 kit (Promega).
mitocondrial Isolamento e Espectroscopia
MCF7 células foram tratadas durante 6 horas com veículo (DMSO), MB, YM-1, ou MKT-077. Seguindo células de tratamento foram colhidas e as fracções subcelulares recolhidos utilizando um estojo de isolamento de Pierce mitocondrial Thermo Scientific (Rockford, IL). Análise de localização da droga foi realizada por espectroscopia no Thermo Scientific Nanodrop espectrofotómetro. As concentrações e percentagens subsequentes foram aproximadas por concentração gerado:. Curva de absorvância (não mostrado)
viabilidade celular MTT Assay
células MCF7-TR foram plaqueadas numa placa de 96well em meio contendo 10 uM 4- OHT. Quando as células atingiram células confluência ~ 90% foram tratados em OPTI-MEM em uma das quatro condições 1: 10? M de 4-OHT em OPTI-MEM para a plena 48 horas de experimento. 2: YM-1 (ou veículo) nas concentrações indicadas, durante 4 horas, seguido por troca de meio YM-1 com meio contendo 10 uM de 4-OHT. 3: YM-1 (ou veículo) nas concentrações indicadas, durante 4 horas, seguido por troca de meio YM-1 com meio contendo 95% de EtOH (veículo de 4-OHT). Ou, 4: YM-1 (ou veículo) nas concentrações indicadas para o total de 48 horas de experiência. Kit de ensaio de MTT foi adquirida da ATCC e ensaio foi realizado de acordo com o protocolo fornecido.
Isolamento de proteínas nucleares
células MCF7-TR foram cultivadas em meio designado em placas de 10 cm. As células foram tratadas durante 4 h com 10 ^ M de 4-OHT, 10 uM YM-1, ambos ou veículo (s) para ambos os compostos. Após a incubação, as células foram colhidas e proteínas nucleares isolado utilizando reagentes e fornecido protocolo do Kit Proteína Qproteome Nuclear (Qiagen).
Resultados
Os perfis de citotoxicidade de uma série de derivados de MKT-077 em MCF7 células foram comparados em uma tela pequena escala. O derivado de YM-1 foi o único composto verificou-se que a dose mais elevada do que a toxicidade dependente MKT-077 após 24 horas (valores de LDH normalizados para o número de células) (Figura 1A). Uma possível razão para essa potência melhorada foi a localização celular. Tirando partido das propriedades espectrais únicas destes compostos, as células MCF-7 foram tratadas com MKT-077 ou YM-1 e a separação celular de mitocôndrias e citosol foram realizadas. O azul de metileno, um composto conhecido para localizar para as mitocôndrias, utilizou-se como controlo [21]. As fracções subcelulares foram analisadas espectrofotometricamente. Estes valores foram comparados com uma curva padrão gerada de Abs: concentração (dados não mostrados) para dar uma concentração aproximada de composto em cada fracção e, assim, uma percentagem de droga por local. Curiosamente, YM-1, ao contrário MKT-077 foi mais prevalente nas fracções citosólicas (Figura 1B).
células MCF7 foram tratadas durante 24 horas com três concentrações de MKT-077 ou YM-1. Após 24 horas, o meio foi recolhido e analisado por ensaio de LDH. Os valores mostrados são uma% de tratamento com veículo ± SD (A). MCF7 células foram tratadas com MKT-077, YM-1 ou azul de metileno (MB). fracções mitocondriais foram coletados e localização composto foi medida pelo espectrofotômetro (B).
Preocupado que a falta de interação mitocondrial reduziria a especificidade citotóxica visto com rhodacyanine de células cancerígenas, a seletividade de YM-1 em várias linhas de cancro e as células imortalizadas foram testados. Estes incluíram: MCF7, Hs578T e MDA-MB-231 (cancro da mama), M17 (neuroblastoma), H4 (neuroglioma), HeLa (cancro do colo do útero), e duas linhas de células imortalizadas: HEK 293 (rim embrionário humano) e NIH 3T3 ( fibroblasto de murino). citotoxicidade robusta (1,323% de veículo), tal como medido pelo ensaio de lactato desidrogenase (LDH), foi observada em células MCF7 seguinte 24 horas YM-1 de tratamento (Figura 2A). Como esperado, estes valores de toxicidade foram maiores do que os observados na Figura 1A, uma vez que utilizada uma população de células maior (1A≈0.2 × 10
6 células; 2A≈1.2 × 10
6 células) e, portanto, mais LDH foi libertado por a toxicidade associada. As outras linhas celulares de cancro testado todos toxicidade exibida após a administração YM-1; enquanto que, as duas linhas de células imortalizadas exibida mínima ou nenhuma toxicidade por ensaio de LDH (Figura 2B). Isto demonstrou que a localização citosólica de YM-1 não afectar a sua especificidade para as células cancerosas.
das células MCF7 (cancro da mama) foram tratadas durante 24 horas com concentrações crescentes de YM-1. Após 24 horas, o meio foi recolhido e analisado por ensaio de LDH citotoxicidade. Os valores mostrados são uma% de tratamento com veículo ± SD (A). célula Hs578T e MDA-MB-231 (cancro da mama), M17 (neuroblastoma), H4 (neuroglioma), e HeLa (cancro do colo do útero) tratadas com concentrações crescentes de YM-1 e a toxicidade foi comparado com o NIH-3T3 (fibroblastos de ratinho embrionário ) e HEK 293 () células de rim embrionário humano à toxicidade para o câncer. Todas as linhas celulares foram tratadas durante 24 horas. Após 24 horas, os meios foram recolhidos e analisados por um ensaio de LDH. Os valores mostrados são uma% de tratamento com veículo ± SD (B).
YM-1 eficácia foi então testado num modelo de célula-tamoxifeno de resistência. A toxicidade de YM-1 em um refractário tamoxifeno (4-OHT) linha de células MCF7 resistentes (MCF7-TR) foi comparada com a da linha celular MCF7 parental (não resistente). Com efeito, YM-1 matou eficazmente ambas as células normais e resistentes (MCF7-TR), após 48 horas de incubação (Figura 3A). Dadas as preocupações anteriores com o tratamento crônico MKT-077, nós especulamos que um tratamento mais curto com YM-1 pode ser igualmente tóxico. Para testar isto, células MCF7 e de células TR-MCF7 foram tratadas com 10? M YM-1 durante 4 horas. Este foi removido e substituído com o veículo, durante 44 horas. Além disso, as células TR-MCF7 foram tratadas com 4-OHT ou o veículo durante 4-OHT (EtOH a 95%) (Figura 3B). Em cada caso, foi observada uma toxicidade mínima.
TR-MCF7 e MCF7 células parentais foram tratadas durante 48 horas com 10? M YM-1. Após 48 horas, os meios foram recolhidos e analisados por um ensaio de LDH. Os valores mostrados são uma% de tratamento com veículo ± SD (A). As células MCF7 foram tratadas durante 4 horas com 10 ^ M YM-1. Ao fim de 4 horas, o meio foi substituído com meio de crescimento normal durante 44 horas. células TR-MCF7 foram tratadas com 10? M YM-1 durante 4 horas. Ao fim de 4 horas, o meio foi removido e substituído com meio padrão TR-MCF7, contendo 10 uM de 4-OHT ou 95% de EtOH, o veículo de 4-OHT, durante 44 horas. Depois de 48 horas a partir do tratamento inicial, os meios foram recolhidos e analisados por um ensaio de LDH. Os valores mostrados são uma% de tratamento com veículo ± SD (B).
A viabilidade das células (MTT), em seguida, os ensaios foram utilizados para testar se esta estratégia de tratamento mais curto estava a afectar a proliferação celular. As células MCF7-TR foram cultivadas em meio contendo 10 uM de 4-OHT. A nossa estratégia de tratamento concebido continha quatro condições que encerra todos às 48 horas: 1. 10 pM 4-OHT sozinho durante 48 horas, 2. YM-1 (ou veículo) tratamento durante 4 horas, seguido de re-adição de 10 uM de 4-OHT para 3. 44 horas, YM-1 (ou veículo) de tratamento durante 4 horas, seguido de 95% de EtOH (veículo de 4-OHT), e 4. tratamento YM-1 (ou veículo) para o total de 48 horas. ensaios MTT revelaram que o 4 horas 10 uM YM-1 seguida de tratamento 10 uM 4-OHT viabilidade reduzida em 60% em relação ao tratamento de 4-OHT sozinho. A 10 uM YM-1 seguido por 95% de EtOH tratamento não alterou viabilidade (Figura 4A). O 48-hora e 10 uM YM-1 tratamento reduziu a viabilidade em 40% em comparação com 48 horas de tratamento de 4-OHT, semelhante à da Figura 3A.
células TR-MCF7 foram tratadas com 4-OHT, durante 48 horas, YM-1 (ou veículo) durante 4 horas, seguido de 44 horas quer de 4-OHT ou 95% de EtOH, ou YM-1 (ou veículo) durante 48 horas. Às 48 horas após o tratamento inicial, foram realizados ensaios de viabilidade MTT. valores de viabilidade de cada tratamento como% de 48 horas de tratamento de 4-OHT ± SD (A). 2-Way análise de variância, comparando todos os grupos YM-1 tratamento (Gray squares- 4 horas YM-1Então 4-OHT, aberta diamonds- 48 horas YM-1, preto triangles- 4 horas YM-1, em seguida, 95% EtOH), significado revelado através concentrações (F (2,30) = 54,22, p 0,0001), e a estratégia de tratamento (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), mas nenhuma interacção significativa (F (8,30) = 1,83 , p = 0,1107). * – Indica diferença significativa (p 0,05) de 4-horas YM-1, em seguida 4-OHT de outros dois grupos com excepção de 10 uM tratamentos, significado conforme indicado (NS = p 0,05) (B). Um ANOVA de uma via da estratégia de YM-1 + 4-OHT revelando significado de uma concentração de 10 uM (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (C). Análise de YM-1 + 95% de EtOH, por um ANOVA de uma via, não revelaram qualquer significância entre concentrações testadas (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (D). 48 horas de tratamento YM-1 mostrou diferenças significância entre todas as concentrações e a concentração de 10 pM, por um ANOVA de uma via (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007) (E). 1-way ANOVA (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001), comparando todos os YM-1 tratamentos de 10 um, 48 horas 4-OHT, e tratamentos de veículo não revelaram qualquer diferença significativa entre 48 horas 4-OHT e tanto 4 horas 10 uM YM-1 + 95% de EtOH e 48 horas, de 10 um de YM-1 tratamentos; Considerando que a 48 horas 4-OHT e de 4 horas a 10 uM YM-1 + 95% de EtOH foram significativamente diferente do de 4 horas, YM-1 tratamento + 4-OHT (p 0,05). (F)
Todas as estratégias de tratamento contendo YM-1 foram analisados por ANOVA de duas vias (Figura 4B). Esta análise revelou um efeito significativo pela estratégia de tratamento e concentração do YM1 (F (4, 30) = 41,04, p 0,0001), (F (2,30) = 54,22, p 0,0001). A interacção entre a estratégia de tratamento e concentração não foi significativa (F (8,30) = 1,83, p = 0,1107). Bonferroni análise post-hoc deste 2-way ANOVA não mostraram diferenças significativas entre qualquer das concentrações utilizadas para o tratamento de 48 horas YM-1 e a 4 horas YM-1 seguido por 95% de tratamento EtOH (todos p 0,05) ; Considerando que, todas as concentrações utilizadas para o 4 horas YM-1 seguido por tratamento de 4-OHT eram significativamente diferente do de 4 horas, YM-1 seguido por 95% de EtOH tratamento (todos p 0,05). Todas as concentrações de 4 horas YM-1 seguido de 4-OHT, e as 48 horas YM-1 foram significativamente diferentes (todos p 0,05) com a excepção de a concentração de YM-1 10 ^ M (p 0,05). Nós atribuído à falta de importância para a toxicidade geral causada pela concentração uM de 48 horas de 10 YM-1 (ver Figura 3A B). Um ANOVA de uma via da curva de concentração YM-1 para o 4 horas YM-1 tratamento seguido por 44 horas de tratamento de 4-OHT revelou que a concentração de 10 uM foi significativamente diferente de todas as outras concentrações (F (4,10) = 16,49, p = 0,0002) (Figura 4C). A curva de concentração para a quatro horas uma YM-tratamento seguido por 95% de EtOH tratamento exibida que nenhuma concentração foi significativa de qualquer outra concentração por ANOVA de uma via (F (4,10) = 3,435, p = 0,0516) (Figura 4D) . A comparação de todas as concentrações de YM-1 48 horas, por ANOVA de uma via, apresentada que, novamente, a concentração de 10 uM foi significativamente diferente de todas as outras concentrações neste tratamento (F (4,10) = 12,32, p = 0,0007 ) (Figura 4E). Continuamos a nossa análise, comparando a 10 mM concentração YM-1, de todos os grupos de tratamento, com o tratamento nulo. valores de viabilidade de todas as condições de tratamento acima mencionados, com a inclusão do tratamento horas 4-OHT 48 e tratamentos de veículo, tal como grupos separados, foram analisados por ANOVA de uma via (F, (5,12) = 24,33, p 0,0001). O teste post-hoc de Tukey revelaram que 4 horas YM-1 seguido de 4-OHT era significativamente diferente do de 4-OHT 48 horas de tratamento (p 0,05), ao passo que tanto as 48 horas 10 uM YM-1 e de 4 horas a 10 uM YM-1 seguido por 95% de EtOH tratamentos não foram significativamente significativas a partir da 4-OHT 48 horas de tratamento (Figura 4F). Esta análise também mostrou que 10 uM YM1 seguido de 4-OHT é significativamente diferente de 10 uM YM1 seguido por EtOH a 95% (p 0,05).
Estes resultados sugerem que apenas um tratamento de 4 horas de 10 uM YM -1 poderia re-sensibilizar células TR-MCF7 ao tamoxifeno /4-OHT, parando o crescimento de células sem causar toxicidade evidente. Os mecanismos possíveis para este fenômeno foram então exploradas. Um mecanismo plausível foi actividade de quinase aberrante, que é conhecido por promover a resistência ao tamoxifeno por fosforilação ERa a um sítio conhecido para promover a actividade independente de estrogénio [14], [15], [16], [17], [18]. Foram tratados células MCF7-TR, tal como descrito para as experiências da Figura 4A B. proteínas nucleares foram isolados e sondada para os níveis de ERa pS167, um local que, quando transmite fosforilados tamoxifeno independência. Com efeito, a fosforilação de ERa pS167 foi elevado na presença de 4-OHT; No entanto, a adição de 10 uM YM-1 anulou este evento (Figura 5A B). YM-1 não alterou a localização nuclear de ERa para dentro do núcleo (Figura 5C D).
células TR-MCF7 foram tratadas com as condições indicadas, durante 4 horas. isolados nucleares e citosólicos fracções foram comparados por Western blot, blots representativos mostrados (A C). análise de densitometria dos níveis pERα e ERa exibido como% do tratamento veículo ± SD (B D)
S167 de ERa quedas está contido dentro de um local de consenso de Akt (Akt /PKB).. Akt é uma quinase pró-sobrevivência com duas isoformas conhecidas para interagir com ERa. Nós tratada células MCF7 com 10 mM YM-1 durante 6 horas para evitar a toxicidade e olhou para mudanças em ambos os níveis de Akt ou ativação. Os níveis de Akt1 e Akt2 foram dependente da dose reduzida de YM-1 (Figura 6A B). Isto sugere que YM-1 pode causar toxicidade específica para as células cancerosas, semelhante à do composto progenitor MKT-077, mas que YM-1 faz isso através da redução quinases pró-sobrevivência como Akt, potencialmente conduzindo a alterações em mecanismos de resistência em tumores refractários. Isto concorda com os dados de trabalho de trabalhos anteriores demonstrando que os efeitos de LY294002, um inibidor da via PI3K /Akt inibidor da via de sinalização, na apoptose induzida por tamoxifeno foram específicos para inibir a actividade de Akt [16].
células MCF7 foram tratadas com concentrações notáveis de YM-1 durante 6 horas. Células lisados foram analisados por Western blot (A). análise de densitometria dos níveis Akt2 Akt-1 e como% do tratamento veículo ± SD (B).
Discussão
Aqui nós descrevemos o potencial terapêutico de um MKT-077 derivado, YM-1. Este composto, semelhante ao MKT-077, foi especificamente tóxico para as células cancerosas. YM-1 também teve uma maior eficácia e localização citosólica de MKT-077. Breve exposição a YM-1 foi capaz de re-sensibilizar as células de cancro da mama refractário ao tamoxifeno, uma terapia comum utilizado na clínica. Este mecanismo foi demonstrado ser dependente de Akt como YM-1 foi capaz de reduzir os níveis de Akt, bem como a fosforilação de ERa a um local de consenso de Akt. Estes dados demonstram o potencial de derivados rhodacyanine no tratamento de cancros refractários.
É possível que a presença citosólica de YM-1, contra mitocondrial de MKT-077, leva a um aumento de toxicidade e de apuramento de Akt observar com YM -1. Embora os aspectos mitocondriais de MKT-077 está bem caracterizada [1], [2], [3], os dados recentes sugerem que MKT-077 pode também interagir com os membros da família Hsp70 citosólica [22]. Se MKT-077 é capaz de inibir a Hsp70 citosólica, como o faz mortalin [4], [5], YM-1 pode também inibir a Hsp70 citosólica. inibidores de Hsp70 demonstraram especificidade para o cancro, bem como a capacidade de reduzir as proteínas Hsp70 cliente [20], [23], [24], [25]. Nós suspeitamos que a inibição de Hsp70 poderia ser o mecanismo de YM-1; No entanto exame adicional é necessária.
terapias Tamoxifen tipicamente falham devido ao desenvolvimento de resistência. resistências adquiridas levar tempo para se desenvolver. Os nossos estudos demonstraram que breves tratamentos com YM-1 pode re-sensibilizar cancros refractários ao tamoxifeno. A vantagem de um tratamento curto tal é a falta de oportunidades para uma resistência à YM-1 em si, bem como reduzida probabilidade de toxicidade para fora do alvo. Além disso, a capacidade de negar resistências existentes permite a reintrodução de quimioterapias putativos; evitando a necessidade de estratégias terapêuticas secundárias e terciárias mais dispendiosos e potencialmente perigosos. Além disso, YM-1 sozinho tratamento foi capaz de matar selectivamente apenas determinadas células cancerosas, sugerindo não só tolerabilidade à abordagem, mas também uma necessidade para caracterização adicional sobre os tipos de células específicas que possam ser sensíveis a estes compostos e a depleção de Akt. Estes benefícios para os pacientes, juntamente com o elevado número de variedades de câncer ligados à disfunção Akt fornece uma plataforma para o estudo continuado e desenvolvimento de novos compostos para esgotar Akt através da manipulação do andaime rhodocyanine.
Enquanto outras cinases foram identificados a ERa fosforilada, Akt quinase é uma das principais de sobrevivência, independentemente do fenótipo de resistência, e a sua depuração pode aumentar a eficácia de agentes quimioterapêuticos. Se a nossa hipótese de que YM-1 é um inibidor de Hsp70 é preciso, esta folga poderia ser devido a uma maior ubiquitinação de Akt, tal como a ligase de ubiquitina para Akt, chip (terminal carboxi da proteína interagir Hsc70) [26], é conhecida por interagir com Hsp70 [27].
Estes estudos demonstram a necessidade de uma visão mais mecanicista para o modo de ação da rhodacyanines. Pequenas mudanças entre MKT-077 e YM-1 conduzir a uma presença citosólica aumento que foi capaz de manter a especificidade similar. Isto sugere que modificações a este andaime poderia provocar toxicidade específica ou reduzir a toxicidade renal, como observado nos ensaios clínicos e laboratoriais [1], [2], [3]. Na verdade, os nossos dados demonstrando uma morte quase preferencial de células de cancro da mama, versus outros tipos de células cancerígenas, sugere que a especificidade para determinadas variedades de tumor poderia ser construído no andaime rhodacyanine.